专利名称：一株高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株福氏志贺氏菌菌株。
背景技术：
氟磺胺草醚(通用名称f0meSafen，商品名称虎威)，是由英国捷利康公司开发的二苯醚类触杀除草剂，用于大豆、果树、橡胶园等作物地阔叶杂草的防除，由于其良好的除草效果而得到广泛应用。氟磺胺草醚在全国使用量及使用面积较大，其在大豆苗前、苗后使用可很快使杂草被叶部吸收，破坏其的光合作用，致杂草迅速枯萎而死。但这种除草剂在土壤中会持续作用很长一段时间，残存于土壤中的药物因其较大的植物毒性会对轮作产生破坏作用。微生物降解方法是土壤中二苯醚类除草剂的主要分解方式。目前氟磺胺草醚的降解也有所研究，GST(谷胱甘肽转移酶)介导的巯基共轭对氟磺胺草醚的去毒作用在黄豆的应用中已非常成熟。但是，有关氟磺胺草醚的微生物降解，目前很少有资料报道。
发明内容
本发明提供了一株福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)菌株，可高效降解氟磺胺草醚，为二苯醚类除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。本发明高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株为福氏志贺氏菌FB5 (Shigella flexneri FB^，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为 CGMCC No. 4410 ；本发明福氏志贺氏菌FB5为革兰氏阴性菌，棒状，细胞大小为(0. 5 μ m 0. 7 μ m) X (0. 9 μ m 1. 6 μ m)，无芽孢、无鞭毛(如图1和图2所示)，无菌膜；在无机盐固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。本发明的福氏志贺氏菌FB5伏普试验呈阴性，淀粉水解试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，七叶灵水解试验呈阴性，硫化氢产生试验呈阴性，脲酶试验呈阴性，氧化酶试验呈阴性，甲基红试验呈阴性。本发明的福氏志贺氏菌FB5不能利用水杨苷、山梨醇、乳糖或蔗糖为碳源；在含有氨苄霉素、状观霉素、氯霉素、阿莫斯林、链霉素、头孢噻肟钠或头孢哌酮钠的环境下可以生长，在含有四环素、卡那霉素或头孢曲松钠的环境下不能生长。本发明的福氏志贺氏菌FB5(Shigella flexneri FB5)通过16S rDNA序列比对分析，与志贺氏菌属(Shigella)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定福氏志贺氏菌FB5属于志贺氏菌属 (Shigella)，为福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)菌株。本发明的福氏志贺氏菌FB5可在添加了氟磺胺草醚的LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐培养基上生长，其中最适培养基为添加了氟磺胺草醚的LB培养基，培养基中氟磺胺草醚的最佳终浓度为500mg/L。福氏志贺氏菌FB5的最适生长温度为37°C，最适合生长环境的PH值为7。本发明福氏志贺氏菌FB5能够高效降解氟磺胺草醚，福氏志贺氏菌FB5在含500mg/L的氟磺胺草醚液体无机盐培养基中，反应96h，对氟磺胺草醚的降解率达到 88. 32% ；本发明福氏志贺氏菌FB5对含有氟磺胺草醚残留的土壤具有修复作用。本发明的福氏志贺氏菌FB5 (Shigella f lexneri FB5)属于志贺氏菌属 Shigella)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4410。
图1为本发明福氏志贺氏菌FB5的扫描电镜照片；图2为福氏志贺氏菌FB5的透射电镜照片；图3为通过福氏志贺氏菌FB5和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株为福氏志贺氏菌FB5 Shigella flexneri FB^，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06 日，保藏号为CGMCC No. 4410。本实施方式福氏志贺氏菌FB5 (Shigella flexneri FB5)为革兰氏阴性菌，棒状， 细胞大小为(0. 5 μ m 0. 7 μ m) X (0. 9 μ m 1. 6 μ m)，无芽孢、无鞭毛，无菌膜；在无机盐
固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对福氏志贺氏菌 FB5 (Shigella flexneri FB5)进行生理生化鉴定福氏志贺氏菌FB5伏普试验呈阴性，淀粉水解试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，七叶灵水解试验呈阴性，硫化氢产生试验呈阴性，脲酶试验呈阴性，氧化酶试验呈阴性，甲基红试验呈阴性。本实施方式福氏志贺氏菌FB5可在添加了氟磺胺草醚的LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐培养基上生长，其中最适培养基为添加了氟磺胺草醚的LB培养基，培养基中氟磺胺草醚的最佳终浓度为500mg/L。其中无机盐培养基(IOOOmL)由1. Og的NaCl、l. Og 的NH4NO3U. 5g的Κ2ΗΡ04、0· 5g的KH2PO4和0. lg、MgSO4 · 7H20和余量的蒸馏水组成。无机盐培养基加热充分溶解后与121°C高压灭菌15min，冷却至50 60°C后向其中加入氟磺胺草醚至终浓度为500mg/L。本实施方式福氏志贺氏菌FB5的最适生长温度为37°C，最适合生长环境的pH为 7。
具体实施方式
二 本实施方式福氏志贺氏菌FB5 Shigella flexneri FB5)由中国黑龙江省讷河市受除草剂污染的土壤中筛选得到。筛选按以下步骤进行取5g黑龙江省讷河市受除草剂污染的土壤于三角瓶中，加入50mL生理盐水，振荡30s，用8层纱布过滤，取ImL过滤液加入到含100mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基中，于30°C、180r/min下培养， 每隔7天提高氟磺胺草醚浓度100mg/L，直至氟磺胺草醚的浓度为500mg/L，得富集培养液； 取富集培养液100 μ L均勻涂布于氟磺胺草醚浓度为500mg/L的固体无机盐培养基上培养， 30°C培养24h后挑取生长较好的菌落进行纯化，即可得到福氏志贺氏菌FB5。对筛选得到的福氏志贺氏菌FB5进行分子鉴定，按以下步骤进行用热破壁法提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、 转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。福氏志贺氏菌FB5的16SrDNA序列长度为lMlbp，其序列提交至GenBank获得的登录号为HQ701686，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件 DNAMAN的Observed Divergency构建系统发育树(如图3所示)，以确定菌株的种属关系。 同源性分析结果表明，该序列与志贺氏菌属(Shigella)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99 %，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定福氏志贺氏菌FB5属于志贺氏菌属(Shigella)，为福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)。PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。对本实施方式福氏志贺氏菌FB5降解氟磺胺草醚的降解率进行测定，具体方法如下将福氏志贺氏菌FB5接入含有500mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基中，于30°C， 200r/min条件下培养，设置不接菌的无机盐培养基为对照，做三个重复，培养后取样， 按甲醇水无水乙酸=60 40 0.5的体积比，直接向培养液(视为水)中加甲醇和无水乙酸，充分混勻，用注射器吸取一定量过0. 45 μ m滤膜，用高效液相色谱检测其残留。色谱条件色谱柱Inertsil 0DS-3C18(4. 6X 250mm, 5 μ m)；柱温室温；流动相甲醇水 无水乙酸=60 40 0. 5;检测波长220nm;流速0. 8mL/min;进样量10yL。根据标准曲线计算出样品中氟磺胺草醚的残留量，根据以下公式求出其降解率氟磺胺草醚降解率 (% ) = [1_(处理实测残留量/对照实测残留量)]χιοο%。本实施方式福氏志贺氏菌FB5在含500mg/L的氟磺胺草醚液体无机盐培养基中， 反应96h，降解率达到88. 32%，说明福氏志贺氏菌FB5为高效降解氟磺胺草醚的菌株。检测本实施方式福氏志贺氏菌FB5对含有氟磺胺草醚残留的土壤的修复作用，具体方法如下以氟磺胺草醚的后茬敏感作物玉米、高粱以及靶标杂草苘麻、稗草作为指示植物， 采用盆栽方式，挑选饱满的作物及杂草种子，在恒温培养箱中浸种催根Mh，设置不加氟磺胺草醚且不接福氏志贺氏菌FB5的为空白组，设置不加氟磺胺草醚只接福氏志贺氏菌FB5 的为对照组CK1，设置加氟磺胺草醚且不接福氏志贺氏菌FB5的为对照组CK2，设置加氟磺胺草醚且接福氏志贺氏菌FB5的为处理组，每个处理设置3个重复，待福氏志贺氏菌FB5分别处理5(1、10(1、15(1、20(1、25(1和30d后同时播种，对照组和处理组所施用的氟磺胺草醚的浓度为5mg/kg，福氏志贺氏菌FB5的接种量为109cfu/kg，置于光照温室、2 30°C )培养 5d左右观察，观察作物及靶标杂草的出苗和生长发育情况，记录湿重、干重、株高及根长等生物量，使用Excel，SPSS统计学软件对所得数据进行分析。
本实施方式福氏志贺氏菌FB5的修复作用对后茬敏感作物玉米和高梁生长指标的影响分别见表1和表2。表lDimcan法分析福氏志贺氏菌FB5施用后对玉米生长指标的影响
No.湿重(g)干重(g)株高(mm)根长(mm)空白组1. 87 ±0. 13oA0. 36 ±0. 030οΑ148. 99 ±9. 76oA173. 67±17. 19oACKl1. 85±0. lloA0. 34 ±0. 035οΑ142. 12 ±8. 37oA169. 87±19. 22oACK21. 46 ±0. 17bA0.邪±0. 044cdCD103. 61 ±8. 53eE119. 85 ±18. 32dD处理5d1. 48 ±0. 072bA0. 26 ±0. 024cCD96. 57±7. 97ff116. 74 ±8. 43dD处理IOd1. 69 ±0. 37—0. 22±0. 012dD129. 26 ±8. 96bB151. 67±19. 81cC处理15d1. 61±0. 027—0. 29±0. 012bcBC119. 08±8. 16cC159. 48 ±17. 28bcBC处理20d1. 63 ±0. 32—0. 32 ±0. 021obAB111. 18±8. 50dD166. 81 ±22. 38obAB处理25d1. 51 ±0. 022—0. 32 ±0. 042oAB118. 47 ±4. 85cC162. 94 ±18. 06bABC处理30d1. 71 ±0. 021οΜ0. 34±0. 012oA127. 08 ±6. 84bB168. 09±21. 75obAB数据结果表明对照组CK2的干重和根长均显著低于空白组，福氏志贺氏菌FB5处理20d、25d和30d后玉米的干重和根长均显著高于对照组CK2，且均已恢复至空白组水平。 对照组CK2的湿重和株高均显著低于空白组，而福氏志贺氏菌FB5处理10d、15d、20d、25d 和30d，湿重虽未显著增加，但已恢复至空白组水平，株高虽与空白组有显著性差异，但与对照组CK2相比均显著增加。表2DimCan法分析福氏志贺氏菌FB5施用后对高粱生长指标的影响
No.湿重(g)干重(g)株高(mm)根长(mm)空白组2. 28 ±0. 33oA0. 42±0. 061°189. 19 ±5. 88oA108. 38 ±9. 44oACKl2. 45 ±0. 41oA0. 39±0. 052°187. 16±6. 29oA106. 25 ±8. 34oACK21. 37 ±0. 14cC0. 27±0. 011bB39. 95 ±3. 36fF59. 08 ±6. 83eD处理5d1. 36 ±0. 12cC0. 28±0. 02bB52. 10±5. 27dD65. 96±9. 71dD处理IOd1. 51 ±0. 081cBC0. 24 ±0. 042bB40. 69 ±5. 65fF85. 69 ±11. 09cC
权利要求
1. 一株高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株，其特征在于高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株为福氏志贺氏菌FB5 (Shigella f lexneri FB5)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No. 4410。
全文摘要
一株高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株，它涉及一株福氏志贺氏菌菌株。本发明提供了一株福氏志贺氏菌菌株，可高效降解氟磺胺草醚，为二苯醚类除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。本发明高效降解氟磺胺草醚的福氏志贺氏菌菌株为福氏志贺氏菌FB5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4410。本发明福氏志贺氏菌FB5能够高效降解氟磺胺草醚，对含有氟磺胺草醚残留的土壤具有修复作用。
文档编号A62D3/02GK102174447SQ20111004779
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者刘丽萍, 刘亮, 刘春光, 刘爽, 杨峰山, 肖延臣 申请人:黑龙江大学