专利名称：志贺氏菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测志贺氏菌的方法。以及用于该方法的志贺氏菌金标快速 诊断试剂盒和其制备方法。
背景技术：
志贺氏菌属(Shigella)的细菌通称是痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。临床上 能引起痢疾症状的病原微生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，此外， 阿米巴原虫、鞭毛虫以及病毒等亦可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最 为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿中可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约 2-3 μ m，宽0.5-0. 7 μ m。不形成芽孢，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C含量为49-53% 克每分子(Tm法)。该菌好氧或兼性厌氧，且营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适生 长温度为37°C，最适pH为6. 4-7. 8。37°C培养18- 小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、 无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，不透明，而且经常出现扁平的 粗糙型菌落。在液体培养基中呈均勻浑浊生长，无菌膜形成。此菌属都能分解葡萄糖，产酸 不产气。大多不发酵乳糖，仅宋氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP实验 阴性，不分解尿素，不产生对甘露醇的分解和产生吲哚的能力因菌种而异。根据生化反 应可进行初步分类。抗原构造与分型志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原(0)及表面抗原(K)组 成。主要抗原有以下三种型特异性抗原型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。 当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失。各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的 型别。群特异性抗原为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常 在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚 型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，可分成2a、2b两个亚型。表面抗原(K抗原)在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。耐热性差，加热 100°C 1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，细菌经口感染，且感染仅限于胃肠道，很少侵 入血流。营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。据报道，每年约有14000例志贺氏 菌病，但估计发病人数为30万。据FDA统计，1997年美国加州等5个州食源性疾病共为8051例，其中志贺氏菌引 起的为1263例。志贺氏菌病常见为食物爆发型或经水传播。志贺氏菌病相关的食品包括色拉(土 豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡)，生的蔬菜，奶和奶制品，禽，水果，面包制品，汉堡包及鳍鱼类 等。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下可迅速传播。经常发现于人员大量集中的地方，如餐厅、食堂等处。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌 者污染食品。食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品，或食品存放温度不适当等。志贺氏菌感染具有传染源广、传播速度快等特点，同时该菌的自然来源非常广 泛。目前对其致病机制还不是很清楚。虽然近年来相关检测技术取得了很大的进展，但仍 然存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源性致病菌感 染的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常重要。本发明采用志贺氏菌免疫家兔或羊，制备多表位抗体。免疫BALB/c小鼠制备单克 隆抗体。研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒，本试剂盒可快速(5-20分钟 出检测结果)特异性的检测志贺氏菌，而且快速(5-20分钟出结果)，可用于发病现场快速 诊断。本发明的公开本发明的第一目的是提供一种志贺氏菌的检测方法。该方法为一步法检测，反应 速度快、灵敏度高、特异性强，操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和 场地检疫等多种场合。本发明的第二目的是提供一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒。该试剂盒针对志贺 氏菌检测提供一种简便而且直接的一步法检测。利用该试剂盒检测志贺氏菌的反应速度 快，灵敏度高，特异性强，操作简便，无需专门设施。本发明的第三目的是提供一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法。该方 法简便、稳定性好、重复性好。本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种志贺氏菌检测方法包括以下步骤(1)将胶体金标记的抗志贺氏菌抗体载于 玻璃纤维或无纺布载体上，将胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被志贺氏菌抗体形 成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶体金标记抗体 的载体上，如果上述样品稀释液含有志贺氏菌，则在检测载体上形成紫红色检测线和控制 线双线，则检测结果判定为阳性，若仅有一条红色的质控线，则检测结果为阴性。本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的构成为内设志贺氏菌金标检测卡组成。检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。所述的志贺氏菌金标 检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层 之间设有金标志贺氏菌抗体层，在检测层上包被有由志贺氏菌抗体形成的检测线和由羊、 兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括首先制备金标抗体层和 检测层的控制线和检测线包被，然后再衬板上组合志贺氏菌金标测试条和检测板。所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为 0. 008-0. 012% mg/ml的氯金酸中加入其体积的1. 4-2%、浓度为1-3% mg/ml的柠檬酸三 钠，煮沸10-20分钟，可得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗志贺氏菌抗体，在 胶体金溶液中用0. 2M碳酸钾溶液调pH7. 8-8. 8，按l-6mg/100ml加入志贺氏菌抗体，搅拌 后，再在溶液中按0. 1-0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，弃沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分 钟离心60-80分钟，离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml的体积溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI 缓冲液，最后得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6%的动物血清蛋白和0. 01-0. 06% mg/ ml叠氮钠；vi将玻璃纤维或无纺布浸入胶体金溶液至液体开始渗出为止，37°C干燥过夜 形成金标抗体层。所述的检测层的制备，是在纤维素膜上设有志贺氏菌抗体构成的检测线 和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。其制备方法是在浓度为l_2mg/ml的或抗体溶液 中加入体积比为1-3%的固定剂，再利用喷膜机将抗体喷在纤维素膜上，喷膜后37V干燥， 再用0. 01mlpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在37°C下封闭30分钟，0. 01mlpH7. 0的PBS漂 洗，37°C干燥。所述的固定剂选用甲醛、丙酮中的一种。本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明检测、诊断志贺氏菌的方法为一步法具有较高的特异性和灵敏性，且操 作简便，无需专门设施和设备。2、本发明的诊断试剂盒检测志贺氏菌时具有较高的特异性和灵敏性，检测过程操 作迅速、快捷、方便，适用于临床检验。流行病学调查和场地检疫等多种场合。3、本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。图面说明
图1是发明检测板的外观结构示意图1-检测板 2-加样孔 3-观察孔图2是本发明检测板的内部结构示意图4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线7-检测线8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板本发明的实施方式本发明还将结合实例作进一步详述实施例一一种志贺氏菌检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗志贺氏菌抗体载于 玻璃纤维或无纺布载体上，并与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被志贺氏菌抗体 形成的检测线，和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶体金标记 的载体上。如果上述稀释液含有志贺氏菌则在检测载体上形成紫红色检测线和控制线双 线，则检测结果判定为阳性，若仅有一条红色控制线而无检测线出现，则检测结果判定为阴 性。参照图1，一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的组成为内设志贺氏菌金标检测 卡1。参照图2，所述的志贺氏菌金标检测卡1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检测 层8和吸水端吸水层9。在检测层和加样端吸水层9之间设有金标志贺氏菌抗体层5。在 检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层滤 纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；金标抗体层为 玻璃纤维或无纺布浸取胶体金抗体制成。
一种志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层(5)和 检测层(8)、控制线(6)和检测线(7)的包被，然后再衬板(10)上组合志贺氏菌金标测试条 和检测卡(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水层4和吸水端吸水层9 ；在其中 段粘贴包被检测线和控制线的纤维素膜层8。在加样端吸水层4与纤维素膜层8的交接部 位。夹贴含金标抗体5的玻璃纤维。玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水层4中间，1/5部分 在纤维素膜层8上，然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，在组装于金标检测盒内。盒盖上加 样孔2正对测试条的加样端吸水层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。本权利要求书中所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备， 称取0. Img氯金酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸15分 钟，冷却后得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记志贺氏菌抗体，取IOOml胶体金溶 液，用0. 2M碳酸钾溶液调pH8. 5，加入^ig志贺氏菌抗体，搅拌20分钟，再加入MOmg牛血 清白蛋白，继续搅拌5分钟，4°C静置2-4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心 10分钟，弃沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉淀物；V 将沉淀物按4-10ml/100ml的体积比溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI缓冲液得胶体金溶液，该缓 冲液中含有0. 25% mg/ml的牛血清白蛋白和0. 02% mg/ml叠氮钠；vi用胶体金溶液浸没 玻璃纤维或无纺布，至其上有胶体金液体渗出为止。在37°C下干燥2小时，即形成金标抗体 层5。所述胶体金标记抗体为羊、兔抗志贺氏菌抗体。所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有志贺氏菌抗体构成的检测线7和由羊或 兔抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取志贺氏菌抗体，调浓度至lmg/ml，加入 2%的甲酸，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7 ；再取羊或兔抗鼠IgG调浓度为2mg/ml，加 入2%的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0. 5cm处，喷控制线6，按20ul/10cm设 置喷膜量，喷膜后置于37°C干燥2小时，再用0. 01mol/lpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在 37°C下封闭30分钟，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。实施例二 志贺氏菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。该试剂盒的制备方法除制备胶体金标记的抗体为抗志贺氏菌单克隆抗体外，其他 条件与例一同。
权利要求
1.一种志贺氏菌检测方法，其特征在于(1)将胶体金标记的志贺氏菌抗体(多抗和单 抗)载于玻璃纤维或无纺布载体上，并与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗志 贺氏菌抗体(多抗或单抗)形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。(2)取 检测样本稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如果上述样本中含有志贺氏菌则在检测载 体上形成紫红色的检测线和控制线两条线，则检测结果判定为阳性；若仅控制线显色，则结 果判定为阴性。
2.一种志贺氏菌金标记快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设志贺氏菌金标检测 卡，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡盒内。
3.如权利要求2所述的志贺氏菌金标快速诊断试剂卡，其特征在于所述的志贺氏菌金 标检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层G)、检测层(8)和吸水端吸水层(9)，在 检测层⑶和加样端吸水层⑷之间设有金标志贺氏菌抗体层(5)，在检测层⑶上包被有 检测线(7)和控制线(6)。
4.如权利要求2所述的志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于制备金 标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)、检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合志贺 氏菌金标测试条和检测卡(1)。
5.如权利要求4所述的志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的 金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为0. 008 0. 012%的 氯金酸中加入其体积的1. 4 2%、浓度为1 3%的柠檬酸三钠，煮沸10 20分钟，可得 到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗志贺氏菌单克隆抗体，在胶体金溶液中用 0. an碳酸钾溶液调pH7. 8 8. 8，按1 6mg/100ml加入抗志贺氏菌单克隆抗体，搅拌后，再 在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii将上述胶体金溶 液经2000转/分钟离心10 15分钟，弃沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟 离心60 80分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI 缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6%的动物血清蛋白和0. 01-0. 06%叠氮钠；vi 将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37°C干燥过滤形成金标抗 体层。
6.如权利要求4或5所述的志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所 述胶体金标记抗体为羊或兔抗志贺氏菌抗体或志贺氏菌单克隆抗体。
7.如权利要求4所述的志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的 检测层(8)是在纤维素膜上设有羊或兔志贺氏菌抗体或志贺氏菌单克隆抗体构成的检测 线⑵和由抗羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
8.如权利要求7所述的志贺氏菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述的 固定剂为甲醛或丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测志贺氏菌的方法，以及用于该方法的金标快速诊断试剂盒和其制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗志贺氏菌抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗志贺氏菌抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有志贺氏菌，则在检测载体上形成检测线和控制线双线，结果判定为阳性；仅控制线显色，结果判定为阴性。该试剂盒由检测卡组成，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内，检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标志贺氏菌抗体层，在检测层上包被有由抗志贺氏菌单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。
文档编号G01N33/558GK102135537SQ201010272888
公开日2011年7月27日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者周海飞, 张远兴, 李克生, 李志远, 杜惠芬, 郑悦, 马国荣 申请人:李克生