专利名称：单花粉全基因组扩增库的快速制备方法
技术领域：
本发明涉及单花粉全基因组扩增库的制备方法，尤其涉及单花粉全基 因组扩增库的快速制备方法、试剂配方及技术，实现单个植物性细胞遗传物质的多次 分析。
背景技术：
花粉是植物的性细胞，其遗传分离规律直接决定了杂种一代的性状表 现。单花粉PCR检测技术已经在几个物种上成功，但由于单个花粉分离和裂解的困难， 以及单花粉只含痕量遗传物质，PCR检测只能做一次，不能重复检测，限制了现有分子生物学技术在单花粉遗传分析in染色体制图上的应用。而要对花粉进行分子遗传分析，如分子标记，则需要对同一个单花粉进行不同引物、多次PCR反应，由于单个花 粉只含有痕量的DNA，进行一次PCR反应尚且困难，更不用说进行多次PCR检测。现 有研究尚停留在如何进行单个花粉PCR反应。如能将单个花粉粒分离、裂解并进行全 基因组复制扩增，将单个花粉的DNA放大到上百万倍，则问题就会迎刃而解。全基因 组扩增技术(Whole Genome Amplification, WGA)是近年来发展起来的新型DNA复 制技术，它提供了一种从微量基因组DNA获取大量遗传信息的途径，在人类遗传分析 方面应用较多(Blanco et al. 1989; Zhang et al. 1992; Esteban et al. 1993)， 尤其为法医处理微量检材提供了一个有用的工具，有关技术方面的详细信息可访问西 格玛 (SIGMA ) 公司全基因组扩增技术专业网站 http://www. sigmaaldrich. com/Life—Science/Molecular—Biology/PCR/Product—Li nes/Whole—Genome_Amplification.html。利用全基因组扩增技术(WGA)制备单花粉 全基因组扩增库以实现对植物生殖细胞的遗传分析，国内外尚没有同类研究报道。通过花粉粒群体研究亲本的遗传规律，关键在于建立单花粉PCR方法和实现单花 粉的多次分子检测。由于花粉粒作为单倍体细胞本身只含有微量的DNA，比常规PCR 方法利用的模板含量低得多，所以单花粉PCR是一个限制因子；花粉粒非常小，又相 互粘连，使得分离单花粉粒成为另一个限制因子。另外，自然条件下花粉粒在花粉囊 裂解后只能存活几分钟(Fritz and Lukaszewski 1989; Khatun and Flowers 1995; Luna et al. 2001)。因此基于花粉活性的研究，取样和遗传分析的效率显得很重要。 目前，应用于花粉粒的PCR检测技术还主要停留在PCR技术的验证性研究方面，少数 几种植物的单花粉PCR检测技术基本建立(Aziz and Sauve 2003; Li a丄1990; Matsunaga s丄1999; Parducci et a丄2005; Petersen " s丄1996; Zhang s丄1992)，但一粒花粉只能检测一次，不能重复使用；花粉数量小，最多的一例只有60粒(Aziz^a丄2005)。可见，当前有关单个花粉分子检测技术还无法实现对单个 花粉进行分子遗传分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，单花粉分离裂解后，即可直接进行WGA扩增，利用Phi29DNA聚合酶(Phi29DNA polymerase)的高保真全基因组DNA复制活性扩增产生大量的全基因组DNA，为植物 单倍体细胞遗传分析提供大量DNA模板。该方法能应用于大批量单花粉收集并制备足 量全基因组DNA，为分析植物单倍体性细胞遗传规律和通过单倍体染色体制图创造首 要条件。本发明的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于由以下步骤组成1、 滴1-2滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微 镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释 放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用30mM灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花 粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分 为0.7 raM苯胺磷酸氢二铵蓝和30 mM蔗糖的水溶液；所述花粉粒的直径》0. Olmm; 所述镊子为显微解剖镊子DUMONT No. 11254-20。2、 分装0.5W裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并离心，使裂解液沉于管 底；应用镊子直接在显微镜下分离着色的单个花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底 的裂解液中。所述裂解液的组成成分为终浓度0. 1M的NaOH与2%的Tween-20的水溶 液的混合液。裂解液的制备方法为各吸取欲配制终体积十分之一的1.0 M NaOH储 备水溶液和终体积十分之一的20% Tween-20储备水溶液混合，加入终体积十分之八 的灭菌双蒸水混匀即为裂解液。3、 分装5W矿物油于含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并 短暂离心；所述的短暂离心以8000转/分离心，时间一般不超过10秒。4、 在PCR仪上裂解后用与裂解液等体积的TE缓冲溶液中和，成为裂解混合液； 所述TE缓冲溶液的组成成分为0. 1 M Tris-HCl和2 mM EDTA的水溶液的混合液。5、 每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应的模板直接进行全基因组扩增， 获得单花粉全基因组扩增库。具体按照试剂盒Genomiphi DNA Amplification Kit(Amersham Biosciences Corp. 928 East Arques Avenue, Sunnyvale CA 94085 USA) 的说明书中提供的方法进行全基因组扩增①向每管含单花粉的裂解混合液中加入 Sample buffer 9 41， 95°C保温3 min，迅速放置冰上(0°C);②加入mix reactionbuffer 9 W;③加入Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase) 1W(冰上操作)，30°C保温18 hrs: 65'C保温10 min灭活，低温保存，即得到单花粉全基因组扩增产物，所得DNA量可供上百甚至更多次分析之用。染色液(0.7 mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30 raM蔗糖的水溶液)中的苯胺磷酸氢二铵蓝主要是为了活细胞染色，30 mM蔗糖的水溶液主要是保持花粉粒渗透压，避免破裂；原料纯度要求分析纯或以上；裂解液主要是为了溶解细胞，释放基因组DNA;原料纯度要求分析纯或以上； 矿物油主要是为了减少裂解液蒸发，保持裂解液体积和各成分浓度；原料纯度要求分析纯或以上；TE缓沖溶液是为了中和裂解液，保持ra值原料纯度要求分析纯或以上； 试剂盒中各成分主要是为了全基因组复制扩增。本发明的有益效果是，可以快速分离和裂解单个花粉，释放出基因组DNA，直接 作为模板利用全基因组扩增试剂盒将单个花粉的DNA复制扩增出大量全基因组，经稀 释后可直接作为PCR分析的模板，没有常规丽A提取纯化方法的烦琐过程，该方法操 作简单、方便、快速，不影响检测灵敏度和准确性。本发明具有的优点为1) 效率高到目前为止，由于显微操纵器本身烦琐的操作过程限制，单个试验 受试的花粉粒个数最多没有超过60，分离单花粉粒效率很低；而应用本发明的方法， 一个经过培训的人每天可以进行288个即3个96孔PCK板的单花粉的分离和WGA反 应。而且，制一板花粉粒载玻片可供多次直接取样使用，省去其它方法如花粉发芽培 养和保存等步骤;再者，花粉裂解液可直接作为WGA反应模板使用，不用沉淀分离DNA， 进一步提高了效率。2) 通用性强本发明方法可应用于多种植物的单花粉WGA反应，包括花粉直径 很小的番茄。3) 操作简便易行不需要昂贵的仪器，样品制备简单，不需要复杂DNA抽提和 预扩增；操作过程简便易行，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验操作步骤。4) 稳定性强根据花粉活性染色鉴定方法保证入选花粉粒均含有DNA模板；花 粉粒分离收集手段可靠；花粉粒裂解释放DNA效果比发芽等其它方法更好。5) 实用性和可操作性强按照本发明方法， 一般的实验室都具备开展相关研究 的条件； 一个经过培训的普通人员均可进行试验操作。
图1为本发明应用显微解剖镊子在显微镜下分离单个花粉，以及花粉粒和镊子尖端直径尺寸的比较。图中(A)甘蔗；(B)玉米；(C)青豆；(D)五节芒；(E)高粱；(F)番茄。测量尺采用OLYMPUS Objective Micrometer OB Ml/100 ， 图中一格代表O.Olmm。图2为本发明分离的六个物种单花粉粒用5S rDNA-ITS (ribosomal intergenic spacer)序列引物(Cox et al. 1992)进行PCR反应的产物电泳检查图。泳道定义 La: DNA标准分子量(Catalog甜N2050);图中泳道1、 3、 7、 11、 15、 19，负对 照(H20);泳道2，正对照(L03-378总DNA);泳道4至6，玉米；泳道8至10，高 粱；泳道12至14，五节芒；泳道16至18,青豆；泳道20至22，番茄。图3为利用本发明中单花粉裂解液作模板制备的单花粉全基因组扩增库(以 HoCP02-618的单花粉粒为样本)。泳道定义La: DNA标准分子量(Catalog #BN2050); 泳道l: 2pl 10 ng/ial入DNA浓度标准，左图泳道2-10: 2^1单花粉全基因组扩增产 物；右图泳道2-10: 2jal稀释100倍的单花粉全基因组扩增产物。图4为本发明全基因组扩增产物用5S rDNA-ITS (ribosomal intergenic spacer) 序列引物(Cox et al. 1992)进行PCR反应的产物电泳检査图。泳道定义La为DNA 标准分子量(Catalog甜N2050);泳道1:灭菌双蒸水作为PCR模板检测结果；泳道2:未灭菌单蒸馏水作为PCR模板检测结果；泳道3:暴露于空气中双蒸水作为PCR 模板检测结果；泳道4: A DNA作为PCR模板检测结果；泳道5:阳性对照(品种 HoCP02-618叶片DNA PCR检测)；泳道6-10:单花粉WGA扩增产物PCR检测；泳道11: DNA标准分子量(Catalog #BN2050)具体实施方式
为充分公开本发明的单花粉全基因组扩增库的快速制备方法， 以下结合实施例加以说明。实施例单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，依序包括如下步骤1)、在生物安全柜中，滴l-2滴染色液在载玻片上；如图1所示，在显微镜下用镊子分离供试作物的完整、干净、未开裂的花药，将花药浸入染色液中，用镊子挑破花粉囊壁，释放出花粉粒，染色20-40分钟，用镊子将染色液排净，用灭菌的30mM蔗 糖的水溶液清洗留下的花粉粒，让花粉粒完全干燥；所述供试作物如甘蔗、玉米、青 豆、五节芒、高梁、番茄……。2) 、分别吸取800 W灭菌双蒸水，100 W 1M NaOH和100 W 20%Tween-20，置 于1. Oml离心管中，以8000转/分离心1 min即制成裂解液；用8道取液器分装0. 裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并离心使裂解液沉于管底；3) 、在显微镜下用镊子挑选着色的单花粉粒并分别把着色的单花粉粒放入96孔PCR板的PCR管底的裂解液中；4) 、用8道取液器分装矿物油于含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR 管中，密封并短暂离心，即以8000转/分离心，时间一般不超过10秒；5) 、在PCR仪上95。C保持17分30秒，取出迅速放冰上(在冰上进行以下步骤)； 用8道取液器分装0. 5W TE缓冲溶液加入含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR 管中，短暂离心；6) 、每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应模板直接按照试剂盒Genomiphi DNA Amplification Kit (Amersham Biosciences Corp. 928 East Arques Avenue, Su皿yvale CA 94085 USA)的说明书中提供的方法进行全基因组扩增①向每管含 单花粉的裂解混合液中加入Sample buffer 9 W,95°C保温3 min，迅速放置冰上(0 °C);②加入mix reaction buffer 9 Pi;③加入Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase) l!4(冰上操作)，30°C保温18hrs; 65。C保温10 min灭活，置冰上； 得单花粉全基因组扩增产物，即单花粉全基因组扩增库，如图3所示，所得DNA量可 供上百甚至更多次分析之用；7) 、取1 W，用0.8%琼脂糖凝胶电泳测浓度；根据测定结果，调节全基因组扩 增产物浓度至100ng/W到lPg/W，作为PCR反应的模板；8) 、 PCR反应成分混合液(20 W的反应体系含2. 0 W IOXPCR反应缓冲液，终 浓度3. 0 mM MgCl2， 0. 2 mM的dATP、 dTTP、 GTP和dCTP, 0. 25 的引物，0. 1% (W/V) 的BSA和1单位的Taq DNA聚合酶，以及的模板DNA (步骤7单花粉全基因组扩 增产物)，用无菌双蒸水调整终体积为20 W;所述引物序列为PI: [TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA]， PI I: [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA];实施 例中所列举的六种作物，均使用同一种通用的引物，该引物为植物保守性序列，具有 植物通用性；使用同一引物也可显示本发明通用性强；9) 、短暂离心，置于PCR仪上，PCR反应参数为95。C保持5分钟，循环参数为 93 。C 55秒，60 。C 10秒，72 。C 40秒，40个循环，最后72 。C延伸10分钟。获得PCR 产物，保持于4t:温度下；10) 、步骤9)的PCR产物用电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。步骤l)所用的镊子的尖端直径《0.01画。步骤1)所述操作是在63倍的显微镜下进行。所述的花粉染色20-40分钟，是将 载玻片放入带盖的培养皿中于温度为23-3(TC下培养；花粉粒用灭菌蔗糖液重复清洗的同时调整视野内密度，花粉粒之间的距离以便于镊子挑取为宜。上述"将载玻片放入带盖的培养皿中"在本发明中是在优选温度为28。C下培养 20-40分钟。步骤1)所用的染色液是由0. 7 mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30 mM蔗糖配成的水溶液。步骤2)所述的1M NaOH和20% Tween-20储备液的制备方法为用灭菌双蒸水配 制1.0 M NaOH水溶液储备液和20% Tween-20水溶液储备液，4。C保存；由二者配制 的裂解液于使用前新鲜配制。所述的裂解液体积可依反应个数多少增减，但裂解液中 NaOH的终浓度为0. 1M, Tween-20终浓度为2%。所述的步骤2)中使用的取液器可采用12道或8道取液器，96孔PCR板用锡箔 胶带密封并离心使裂解液沉于管底；步骤2)和步骤4)中所述的短暂离心是自指在离心力为3000 g左右离心1分钟；歩骤5)中所述的PCR板一般选用96孔PCR板，是放在PCR仪中且PCR仪的优选 温度控制为95°C，保持时间优选为17分30秒；步骤6)所力口入的Sample buffer 、 mix reaction buffer禾口 Phi29 DNA polymerase 酶均系试剂盒(Ge画iphi DNA Amplification Kit 25-6600-01)中的试剂成分；步骤8)所加入的PCR反应成分混合液一般由1 XPCR反应缓冲液，适宜量dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP, MgCl2，引物，模板DNA， Taq DNA聚合酶和H20组成；本发明所 使用的引物均为Cox等1992根据5S rDNA-ITS序列设计的引物，具体为PI: [TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA]， PII: [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox et al. 1992)。步骤9)短暂离心，置于PCR仪上，在优选温度为95t保持时间3-8分钟进行预 变性。步骤10)获得的PCR产物用含0. 5 pg/ml溴化乙啶的1. 5%琼脂糖进行电泳分离 并在成像系统上进行扫描拍照。本发明具有的特点为本发明应用显微解剖镊子(DUMONT No. 11254-20， FineScience Tools USA, Inc., Foster City, CA， USA)在显微镜下分离单个花粉，在碱和表面活性剂溶液(终浓度0. 1M的Na0H，终浓度2%的Tween-20水溶液)中裂解后用TE缓冲溶液(O. 1 M Tris-HCl和2 mM EDTA水溶液)中和。裂解混合液直接作为模板在试剂盒Genomiphi DNA Amplification Kit方法中工作，得到单花粉全基因组，为分析植物单倍体遗传规律和通过单倍体染色体制图创造了首要条件。应用这种方法， 一个经过培训的人每天可以制备288个单花粉WGA反应模板。该方法在六种可以 采集到花粉的植物即甘蔗、玉米、青豆、五节芒、高粱、番茄上验证成功，以甘蔗单 花粉为材料建立了单花粉全基因组快速扩增制备技术，效果良好，该发明方法也可以 用于其它花粉的采集及PCR检测。该方法大批量收集并制备单花粉WGA的能力为植物 遗传分析和染色体制图提供了 一种新途径。单花粉分离的分子证明为证明上述方法对不同植物单花粉分离的可靠性，以生 物进化中保守性强的5S核糖体间区序列5S rDNA-ITS(ribosomal intergenic spacer) 设计引物(Cox et al. 1992)，以0.5 pl裂解混合液(含一粒花粉)加热裂解后用 0.5 pl TE缓冲溶液中和溶液为PCR模板，设置对照，进行PCR反应检查，引物序列 为 PI: [TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA] ， PII :[(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox et al. 1992); PCR反应成分及终浓度分 别为50 mM KC1， 10 mM Tris. HC1 (pH 8. 3)， 3. 0 mM MgCl2，各0. 2 mM的dATP， dTTP, dGTP, and dCTP， 0.25 (^！的引物，0.1% (W/V) BSA禾Q 1单位的Taq酶。PCR仪上 95。C保持5分钟，循环参数为93°C 55秒，60 °C 10秒，72。C40秒，40个循环，最 后72T延伸10分钟。PCR反应产物经电泳检査，证明按照上述方法可以实现不同作 物单花粉的可靠分离，详见说明书附图2。单花粉全基因组扩增产物的分子证明由于微量的任何DNA污染均可能作为上述 方法中Phi29 DNA polymerase酶的模板进行扩增。为证明上述方法的可靠性，以生 物进化中保守性强的5S核糖体间区序列5S rDNA-ITS(ribosomal intergenic spacer) 设计引物(Cox et al. 1992)，以单花粉全基因组扩增产物为模板，设置环境对照， 进行PCR反应检査，引物序列为PI : [TGGGAAGTCCT (C/T) GTGTTGCA] ， PII : [(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA] (Cox et al. 1992); PCR反应成分及终浓度分 别为50 mM KCl， 10 mM Tris. HC1 (pH 8. 3) ， 3. 0 mM MgC12，各0. 2 mM的dATP， dTTP， dGTP， and dCTP， 0.25 的引物，0.1% (W/V) BSA和1单位的Taq酶。95°C保持 5分钟，循环参数为93。C 55秒，60°C 10秒，72°C 40秒，40个循环，最后72 °C延 伸10分钟。经电泳检查，证明PCR扩增产物是单花粉DNA的扩增产物，上述方法可 以防止污染，详见说明书附图4。
权利要求
1、一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)滴1-2滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用30mM灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分为0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30mM蔗糖的水溶液；(2)分装0.5μl裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并离心，使裂解液沉于管底；应用镊子直接在显微镜下分离着色的单个花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底的裂解液中；(3)分装5μl矿物油于含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并短暂离心；所述裂解液的组成成分为终浓度0.1M的NaOH与2％的Tween-20水溶液的混合液；(4)在PCR仪上裂解后用与裂解液等体积的TE缓冲溶液中和，成为裂解混合液；(5)每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应的模板直接进行全基因组扩增。
2、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，其特征在于所述花粉粒的直径X).Olmm。
3、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，其特征在于裂解液于使用前新鲜配制。
4、 根据权利要求1或3所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制 备方法，其特征在于裂解液的配制方法为各吸取欲配制终体积十分之一 的1. 0 M NaOH储备水溶液和终体积十分之一的20% Tween-20储备水溶液 混合，加入终体积十分之八的灭菌双蒸水，混匀。
5、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，其特征在于所述镊子为显微解剖镊子DUMONT No. 11254-20。
6、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于分离花粉是在63倍的显微镜下进行。
7、 根据权利要求1或5所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制 备方法，其特征在于所述镊子的尖端直径《0.01mm。
8、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，其特征在于所述分装O. 裂解液，其分装方法为采用8道取液器 分装0. 裂解液于96孔PCR板的PCR管中。
9、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，其特征在于所述分装5 W矿物油，其分装方法为采用8道取液器 分装矿物油于含有裂解液和单花粉粒的96孔PCR板的PCR管中。
10、 根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，其特征在于分装0.5W裂解液于96孔PCR板的PCR管中，然后用锡 箔胶带密封96孔PCR板，并离心使裂解液沉于管底。
全文摘要
植物单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，具体涉及植物单花粉的分离、快速裂解和全基因组复制扩增。本发明的技术方案是在载玻片上将花粉染色、干燥，制备花粉粒玻片；应用一种显微解剖镊子在显微镜下分离单个花粉，放入PCR管中，在碱和表面活性剂溶液中裂解后用TE缓冲溶液中和。裂解混合液直接作为模板在试剂盒Genomiphi DNA Amplification Kit方法中工作，将单个花粉的DNA复制扩增出大量全基因组，该方法能应用于大批量单花粉收集并制备全基因组，为植物单倍体遗传规律分析和通过单倍体染色体制图提供了一种新的途径。
文档编号C12P19/00GK101328491SQ20081007143
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月23日 优先权日2008年7月23日
发明者华 张, 徐景升, 潘永保, 王恒波, 蔡澜峰, 许莉萍, 郭晋隆, 陈如凯, 陈平华, 陈由强, 高三基 申请人:福建农林大学