专利名称：：甘蔗宿根矮化病菌pcr快速检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种PCR检测方法，尤其是甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法。
背景技术：
：甘蔗宿根矮化病(Ratoonstuningdisease,RSD)是由寄生在甘蔗木质部导管内的Zei/^o/7j'a;^乃'subsp.病菌引起。目前应用于甘蔗宿根矮化病的PCR检测技术，首先需要从甘蔗蔗汁或蔗茎组织提取DNA，然后进行PCR扩增。而病菌DNA的提取需要经过一系列步骤，即CTAB缓冲液裂解，氯仿/异戊醇抽提，醋酸钠和无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤等过程。其过程复杂、繁琐、耗时，很难应用于甘蔗病害大规模检测和甘蔗早代RSD抗病育种研究。
发明内容本发明的目的是提供一种甘蔗RSD病菌PCR快速检测的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:甘蔗RSD病菌加入BufferA试剂，经过95。C水浴10分钟后，再加入BufferB试剂，甘蔗RSD病菌即可裂解出Zej'/s朋j'asubsp.J7h'基因组DNA，然后作为PCR反应的模板。本发明的甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，其特征在于具体步骤如下1、提取蔗汁在甘蔗的基部节间取蔗汁l1.5mL置离心管A中，室温下3000rpm离心46min，取上清液300400uL放入离心管B中，室温下12000rpm离心812min，弃上清，取沉淀；2、病菌裂解在收集到的沉淀中加入50uLBufferA，混匀，稍离心；95。C水浴10min，取出放置冰上3min;加入50pLBufferB，混匀；稍离心后静置备用；所述BufferA为100mMNaOH与2。/。Tween20水溶液的混合液；BufferB为100mMTris-Hcl与2mMEDTA水溶液的混合液；3、模板PCR检测和电泳成像；PCR检测和电泳成像采用常规技术。BufferA是裂解液,通过NaOH碱性裂解RSD病菌；BufferB是中性溶液，平衡裂解后溶液的pH值。本发明专利的有益效果是，可以快速裂解甘蔗RSD病菌，释放基因组DNA，操作简单、方便，不影响检测灵敏度和准确性，而且试剂价格便宜、无毒，通过对一定甘蔗样品蔗汁病菌的裂解，然后PCR检测，验证了本发明具备了较高的灵敏性和准确性，与常规CTAB法相比，PCR反应的灵敏度高1个数量级，且具有快速、简便、成本低、无污染的特点。图1是两种不同甘蔗RSD病菌裂解方法的PCR检测灵敏度比较图。具体实施方式为了充分公开本发明甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，以下结合实施例加以说明。实施例甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，具体步骤如下1、提取蔗汁用带槽锥子在甘蔗的基部节间取蔗汁lmL，放入1.5mL的离心管中，室温下3000rpm离心5min。取上清液350nL放入新的l.5mL的离心管中，室温下12000rpm离心10min，弃上清。2、病菌裂解在收集到的沉淀中加入50liLBufferA，混匀，3000rpm离心5秒；95"水浴10min，取出放置冰上3min;加入50uLBufferB，混匀，3000rpm离心5秒，置-2(TC冰箱内备用。3、PCR扩增用于甘蔗RSD病菌检测的引物为Lxxl:5，-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3，Lxx2:5，-ACCCTGTGTTGTTTTCMCG-3'PCR体系<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>PCR程序95°C，15min;94°C，15sec，55°C，15sec，72°C，lmin;40个循环72°C，10min;4°C，Hold4、电泳成像。甘蔗蔗汁RSD病菌经过BufferA和BufferB裂解处理后，分别稀释10、102、103、104、和105倍，然后进行甘蔗RSD病菌PCR检测，以确定本方法PCR检测灵敏度。没有稀释的病菌为模板，PCR扩增产物经电泳检测有明亮的特异性条带，稀释104倍的病菌作为模板，仍可检测出微弱的特异性条带。而蔗汁经过CTAB裂解提取的DNA稀释104倍后(5pg)，几乎看不到目的片段的条带。本方法建立的甘蔗蔗汁RSD病菌快速PCR检测技术具有较高的灵敏度,可应用于甘蔗病害大规模检测和甘蔗早代RSD抗病育种研究。检测结果如图1所示，M.250bpDNALadderMarker;16为甘蔗RSD病菌经过BufferA和BufferB裂解，然后分别稀释10°、101、102、103、104、105倍，作为PCR扩增模板；712.为甘蔗RSD病菌经过常规CTAB提取，然后分别稀释10。、101、102、103、104、105倍，作为PCR扩增模板。13为阳性对照，RSD病菌DNA;14为阴性植株对照；15为双蒸水对照。电泳结束后，用1.2。/。的琼脂糖凝胶检测PCR目的条带(439bp)。权利要求1、一种甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，其特征在于具体步骤如下(1)提取蔗汁在甘蔗的基部节间取蔗汁1～1.5mL置离心管A中，室温下3000rpm离心4～6min，取上清液300～400μL放入离心管B中，室温下12000rpm离心8～12min，弃上清，取沉淀；(2)病菌裂解在收集到的沉淀中加入50μLBufferA，混匀，稍离心；95℃水浴10min，取出放置冰上3min；加入50μLBufferB，混匀；稍离心后静置备用；所述BufferA为100mMNaOH与2％Tween20水溶液的混合液；BufferB为100mMTris-Hcl与2mMEDTA水溶液的混合液；(3)模板PCR检测和电泳成像。2、根据权利要求1所述的一种甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，其特征在于所述稍离心为3000rpm离心5秒。3、根据权利要求1或2所述的一种甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，其特征在于所述静置备用，指置-2(TC冰箱内备用。全文摘要本发明涉及甘蔗RSD病菌的快速裂解和PCR检测技术。本发明通过BufferA和BufferB裂解甘蔗RSD病菌，用PCR检测技术快速检测出Leifsoniaxylisubsp.xyli病菌。本发明的检测灵敏度比常规CTAB裂解提取DNA的方法高，且具有快速、简便、成本低、无污染的特点，具备较高的灵敏性和准确性。本发明可用于大规模甘蔗RSD病菌的PCR检测。文档编号C12Q1/68GK101328501SQ20081007143公开日2008年12月24日申请日期2008年7月23日优先权日2008年7月23日发明者华张,徐景升,潘永保,许莉萍,陈如凯,陈平华,高三基申请人:福建农林大学