一种培养基及其应用、培养方法
【技术领域】
[0001]本发明设及细胞培养技术领域，特别设及一种培养基及其应用、培养方法。
【背景技术】
[000引套式淋己瘤（Mantlecelllymphoma)属于非霍奇金淋己瘤（NHL)的一种，大约 70%的病人在诊断时已处于III期或IV期病变。临床上经典的CHOP(环憐酷胺+多柔比星 +长春新碱+泼尼松）方案对套式淋己瘤的治疗疗效不满意，只有少数病人达到完全缓解， 因此亟需新的治疗策略来改善疗效。
[0003] 随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，过继细胞免疫治疗近年来取得了长足的进 步，其中W嵌合抗原受体（chimericantigenrecepto;r，CAR)修饰的T细胞为代表的肿瘤革己 向免疫治疗的成就尤为突出，在体外和临床试验中表现出良好的祀向性、杀伤性和持久性， 展示了巨大的应用潜力和发展前景。
[0004] CAR-T细胞治疗的原理在于经嵌合抗原受体修饰的T细胞，可W特异性地识别肿 瘤相关抗原，使效应T细胞的祀向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可 克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态，即表达CAR的T细胞W抗原依赖、 非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。
[0005] 大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区（由来源于单克隆抗体的轻链VL和重 链VH，中间经带初性的较链区连接形成的单链抗体（singlechain化agmentvari油Ie, scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。
[0006] 目前正在开发的针对血液系统恶性肿瘤的CAR种类很多，主要包括利用抗CD19、 抗CD20、抗Ka卵a轻链、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗体构建CAR修饰的T细胞或 NK细胞进行抗肿瘤研究，其中抗CD19单克隆抗体为基础构建的CAR在临床上取得的成就最 为突出。祀向CD19分子的嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞（CD19-CAR-T)在治疗多发性、 难治性的急性淋己细胞白血病（ALL)上获得了巨大成功，美国宾夕法尼亚大学的研究小组 的临床试验结果显示，高达90%W上的难治性、复发性A化患者获得完全缓解。
[0007] 2011年宋德刚在文献《表达嵌合性抗原受体的T淋己细胞介导的肿瘤过继性免 疫治疗作用的临床前研究》中使用RPMI1640+10%FBS培养基培养CAR-T细胞。但采用 RPMI1640+10%FBS去培养转染后的T细胞存在诸多缺点：
[0008] 1、转染后的T细胞无法大量增殖，因为会出现基因丢失的风险，通常CD4+和CD8 + 细胞增殖倍数在50倍左右；
[0009] 2、培养天数有限，通常只能培养7天左右；
[0010] 3、培养后细胞的嵌合抗原受体的表达会有所降低，W转染CD19CAR的T细胞为例， 即使转染效率达到90%W上，通常培养7天后CD19CAR表达的细胞比例会降至60%左右。
[0011] 因此，急需提供一种能够有效促进CAR-T细胞增殖并能高效表达CAR的培养基及 其培养方法。
【发明内容】
[0012] 有鉴于此，本发明提供了一种培养基及其应用、培养方法。该培养基在培养CD19-CAR-T细胞时，能够提高细胞的增殖倍数，延长细胞培养天数，并能够保持表达 CD19CAR等表面标志物。
[0013] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0014]本发明提供了一种培养基，包括转铁蛋白、重组人膜岛素、孕酬、胎牛血清、干细胞 生长因子、维生素C、白介素2、白介素4、硫酸锋和DMEM/F12培养基。
[0015]作为优选，培养基WIL计算，包括W下成分：
[0016] 转铁蛋白 40~180ng/ml; 重组人唤岛素 0.5~5mg/mk 孕觸 8~60nmoR4 胎牛血清 2%~5%体积分数； 干细胞生长因子 5~40打g/mL; 维生素C 0.5~5mg/mL;
[0017] 白介素 2 15~70ng/mL; 白奔素斗 10~拂ng/mL; 發。酸舞 50~2OOng/niL; DMEM化12培养基 余量々
[0018]在本发明提供的一些实施例中，培养基WIL计算，包括W下成分：
[0019] 转铁蛋白 lOOng/m丄； 重组人跋岛素 3mg/mL; 孕固同 20nmol/L; 胎牛血清 5%体积分獄； 干细胞生長周子 20ng/mL; 维生素C 1.5mg/mk 白介素 2 50ng/iW_.; 白令素4 30ng/iW-.; 硫酸辑 lOOng/nik DMEM化12培养基 余量。
[0020] 在本发明提供的另一些实施例中，培养基WIL计算，包括W下成分：
[0021] 靜鉄齋白 40ng/mL; 重组人J复岛素 5mg/mL:; 孕躺 8nmcWL;. 漱牛血绿 3從体載分敎； 干細胞生长周子 40iig/mL;; 维奎素C 0.5mg/mL; 訪余素 2 TOngZmL:; 訪余素4 lOng/mL； 吞乾茜复轉 200ng/mL- DMEM/F12接养基 余憂。
[0022] 在本发明提供的另一些实施例中，培养基WIL计算，包括W下成分：
[0023] 转铁蛋白 180ng/mb 重组人跋岛素 0.5mg/m 孕綱 锁nmol/L;
[0024] 胎牛血淆 2%体积分数； 干细胞生长厲子 SngZmL; 维朱素C 5mg/mL; 自介素3 15rig/mk 自.奔素 4 SQiig/m1_.; 猶面灸鲜 5()ng/iTP丄； DMEM/F12培养基 余量。
[0025] 本发明还提供了该培养基在促进CAR-T细胞增殖、延长细胞培养时间、保持表达 表面标志物中的应用；该培养基包括转铁蛋白、重组人膜岛素、孕酬、胎牛血清、干细胞生长 因子、维生素C、白介素2、白介素4、硫酸锋和DMEM/F12培养基；作为优选，培养基WIL计 算，包括W下成分：
[0026] #铁聲白 40…巧胞鈎iiL; 重纽人跋岛素 0.5~5〇1名/|1心 孕聯 8 ~60nmol/L; 艇牛血薄 2%~5%体积分数； 干细胞生长因子 5~40ng/mL; 维泰索C 0.5~5mg/m。 封?斧索么 1,5可晚IgZbiL.;. 白介素4 10~8〇1巧/11止； 硫酸辞 50-200ng/mU DMEM/F12縷养慕 余囊。
[0027]作为优选，CAR-T细胞为CD19-CAR-T、CD20-CAR-T、K轻链-CAR-T、CD22-CAR-T、 CD23-CAR-T、CD30-CAR-T或CD70-CAR-T。
[0028]优选地，CAR-T细胞为CD19-CAR-T。
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，表面标志物为CD4\CD8+或CD19CAR中的一种或几 种。
[0030] 作为优选，表面标志物为CD19CAR。
[0031] 本发明还提供了一种CAR-T细胞的培养方法，采用本发明培养基培养CAR-T细胞； 该培养基包括转铁蛋白、重组人膜岛素、孕酬、胎牛血清、干细胞生长因子、维生素C、白介素 2、白介素4、硫酸锋和DMEM/F12培养基；作为优选，培养基WIL计算，包括W下成分：
[0032] 转铁蛋白 40~巧始g/mL; 重组人/谈岛素 0.5~5mg/mk 孕網 8 ~60nmolZL; ,胎牛血清 2%~5%体积分数； 干细胞生长国乎 5~40ng/mL; 维生素C 0.5~5mgZmk 白介素2 15~70ng/mk 白介素4 10~80ng/rnk 硫酸辞 50~200ng/m：L; DMEM/F口培养基 余量。
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，该培养方法包括如下步骤：
[0034] 步骤1:将CAR-T细胞和CD3单克隆抗体加入本发明培养基中，调整细胞密度，进 行细胞培养，培养72小时后补加培养基和CD3单克隆抗体；
[0035] 步骤2:继续培养至少4天，每隔2~3天补充培养基。
[0036] 作为优选，细胞密度为（1~10)XIO6Cell/血。
[0037] 作为优选，细胞培养的条件为5%C02、37°C。
[0038] 作为优选，CD3单克隆抗体的浓度为20~50ng/mL。
[0039] 在本发明提供的一些实施例中，CD3单克隆抗体的浓度为30ng/mL。
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，该培养方法包括如下步骤：
[00川将CD19-CAR-T细胞用本发明培养基重悬，同时加入30ng/血的CD3单克隆抗体， 调整接种密度lXl06cell/mU放入5%C02、37°C培养箱中培养；
[004引培养72小时后按照5XIO5CelVmL的密度补加本发明培养基，同时补加30ng/mL的CD3单克隆抗体；
[0043] 之后每2~3天补充本发明培养基一次，保持细胞密度在5Xl〇5cell/mL。
[0044] 本发明提供了 一种培养基及其应用、培养方法。该培养基包括转铁蛋白、重组人膜 岛素、孕酬、胎牛血清、干细胞生长因子、