专利名称：改进的培养基添加剂及其应用方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的包括多胺和铁的细胞培养添加剂，一种含有该细胞培养添加剂的培养基和一种使用该细胞培养添加剂提高细胞生长、细胞活力或细胞产率的方法。
背景技术：
细胞培养过程中的发展目标特别是提高活细胞积分(integral of viable cell concentration, IVC)和增加细胞产物的形成。活细胞积分(IVC)直接与产物的浓度相关联(Renard, J. M.等，Biotechnology Letters, 1988,10(2) :91-96)。这个活细胞浓度积分能通过提高活细胞浓度的峰值或延长培养时间而增加。如果细胞保持高的活性，例如细胞平稳增长阶段可以延长，那么这个过程时间可以延长。一个好的细胞培养基或一种好的细胞培养过程将提供整个过程细胞所有必要的底物，致使细胞生长良好，细胞活力高或产物形成多。多胺，例如亚精胺或精胺，对细胞生长和生产过程中是很普遍的必要成分。尽管如此，据报道精胺的毒性是附着在含血清培养基生长的BHK(幼仓鼠肾)细胞中(Brimton， V. G.等，Biochem. J.，1991,280 :193-198)。牛血清白蛋白含量加快了多胺尤其是精胺的细胞毒性(Katsuta，H.，Jpn J Exp Med. ,1975,45(5) :345-54)。用 10μΜ 的三价铁 (1.6mg/l)对CHO (Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢)细胞进行治疗，增加精胺的浓度(0 100 μ Μ,最大为20. 2mg/l)，降低了在血清培养基中剂量依赖性的活力细胞的数量 (Gaboriau, F.等，Biochemical Pharmacology，2004，67 1629-1637)。牛血清中含有的牛血清胺氧化酶可以催化多胺的氧化脱氨。专利WO 98/08934公开了一种无血清的培养基， 包含0. 9 18. lmg/1尤其是9. 05mg/l的精胺。多胺氧化形成的产物是形成细胞毒性的原因(Averill-Bates 等，Arch BiochemBiophys.，1993，300(1) :75_9)。多胺的氧化产物也可以作为细胞生长的负调节器。总之，公布的数据表明，尽管多胺是细胞必不可少的，但是对哺乳动物细胞来说它们是有毒的。因此，一个技术人员在细胞培养基中主要关注于优化腐胺(一种二胺)的浓度而不是多胺的浓度。腐胺是多胺的前驱体，专利WO 2004/078955公开了一些含有培养基的腐胺的例子。专利WO 2007/077217公开了一种包括至少0. 5mg/l多胺的无寡肽培养基，可以提高细胞特定产率。这进一步证明最有效的是腐胺。增加精胺浓度在ang/1以上并没有显著增加细胞产率。该发明同时公开了另外加入浓度为1.067mg/l的!^e(II)的培养基。未观察到多胺和铁的协同效应。专利W098/089;34公开了一种含有精胺和Fe2+和/或!^e3+浓度为0. 28 1. lmg/1
的培养基。因此，为了改进细胞生长、细胞活力和细胞产率，仍有需要发展培养基和添加剂作为补充。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞培养基、 组成及其应用，特别是能够使细胞培养过程具有增加活细胞积分和/或提高细胞产物的形成。本发明解决了由该独立权利要求规定的上述发现的问题。特别是，本发明提供了一种细胞培养添加剂，至少含有一种多胺，其浓度至少优选高于20mg/l ；和至少含有一个铁的；其浓度至少优选高于ang/1。很惊奇的发现，在培养基中多胺的浓度显著高于平常的浓度，但对细胞并没有毒性，而是促进细胞生长、细胞活力和/或细胞的产率。如果没有被理论约束和以非限定性的方式，如果在细胞培养基中提供细胞一种二胺，例如腐胺，我们相信能用细胞能量从腐胺合成细胞多胺，如精胺。此外，所述的细胞多胺合成可能需要一个相当长的时间以建立一个为了细胞能够快速生长的足够大的内部多胺池。如果在另一方面，在细胞培养基中多胺浓度增加，细胞的新陈代谢没有必要来合成多胺，也不需要为了细胞生长和细胞产率来节约细胞能量。众所周知，虽然铁的氧化产物对细胞具有毒性，特别是在高铁浓度和/或长期的过程中形成的；人人都知道在培养基中，含有浓度为100 μ M的!^2+或者!^3+离子培养基对大鼠肝癌细胞的线粒体DNA造成损坏(Itoh，H.等，Arch Biochem Biophys.，1994，313 120-125)，本发明适用于目前含有添加剂的多胺中的高铁浓度和含上述物质的培养基中。 令人惊奇的是，在培养基中多胺存在下，高铁浓度促进细胞生长。由于氨基的存在，多胺明显能够螯合金属阳离子。这些螯合物的稳定常数随着氨基基团的数量和多胺链长的增加而升高。因此，如果不被理论约束和以非限定性的方式，我们相信，通过螯合物的形成多胺能有效地防止铁氧化。多胺结合铁离子可以稳定铁的氧化状态和辅助传输铁到细胞中去，多胺同时可作为螯合剂防止1 2+/ 3+离子沉淀。目前使用的高浓度多胺结合铁可以促进细胞生长、细胞活力或细胞产率。根据发现，多胺不仅是一种底物，而且也可作为一个正电荷的离子载体，如过渡金属，诸如基质中的狗2+，Fe3+, Cu2+，Zn2+0为了有效形成多胺-铁配合物，较高的多胺和铁离子浓度是有益的。所述形成多胺-铁配合物很容易被细胞吸收，并保证较好的细胞内的铁和多胺的供应， 以带来更高的细胞生长、细胞活力和/或细胞产率。因此，根据本发明，多胺和铁在培养基中的浓度应提高到本发明的浓度。根据本发明，供给细胞的多胺和铁尤其是对于细胞高密度生产过程或延长过程时间的生产过程是有用的，例如在流加过程或灌注过程中。随着过程持续时间的增加，为避免限定性向培养基中加入多胺和铁变得很重要。由于多胺和铁这两种物质对抗氧化可能是敏感的，因此，保护它们抗氧化和提高相应的细胞高密度浓度变得很重要；为了提供多胺-铁配合物的形成，目前供给所述高浓度的两种物质是很有用的。特别地，本发明解决了上述问题，提供了一种所述培养添加剂，特别是培养基添加剂，进一步提供了一种培养基，所述培养基包括上述培养添加剂，其中培养添加剂定义为高浓度多胺尤其是精胺或亚精胺和高浓度铁的特定组合。因此，在一个特别优选的实施例中，本发明涉及一种按照上面所述的培养添加剂， 其中所含多胺的浓度至少优选大于25mg/l，30mg/l，35mg/l，40mg/l，45mg/l，或者在一个特别优选的实施例中至少优选大于50mg/l。在另外一个优选实施例中，本发明提供一种按照上面所述的培养添加剂，其中铁的浓度至少优选大于5mg/l，10mg/l, 15mg/l, 50mg/l, 100mg/l，M0mg/l，或者在一个特别优选的实施例中至少，优选大于480mg/l。在另外一个优选的实施例中，本发明所述培养基是指一种培养基质，其中的多胺浓度从30mg/l到120mg/l，特别是从40mg/l到120mg/l。在一个特别优选实施例中，培养基中铁的浓度从50mg/l到900mg/l，优选是从50mg/l到450mg/l。在本发明的另外一个优选实施例中，培养基中多胺的浓度从30mg/l到120mg/l，并且铁的浓度从50mg/l到900mg/ 1，特别是从50mg/l到450mg/l。如果没有特别说明，这里给出的所有铁浓度的值涉及到全部铁的质量，而不仅仅是铁本身。在本发明中，一种培养添加剂意味着变成了培养基的一个组成部分，并且能够在一个实施例中定量加入到本领域传统的培养基中，以提供一种按本发明所示的培养基，其中按本发明所示的培养基是指含有至少一种多胺和至少一种铁的所需浓度的培养基。当然，也有可能通过向本发明的培养基中加入不同成分来制备培养基，从而形成了如本发明所示的培养基。在一个较优实施例中，培养添加剂包括多胺和铁从2到10000倍，优选10 到1000倍，尤其是100倍，如上面确定的较高浓度培养基，即培养添加剂含有多胺的浓度从60mg/l到1200000mg/l，含有铁的浓度从100mg/l到9000000mg/l，尤其是从100mg/l到 4500000mg/lo在另一个较优实施例中，培养添加剂含有多胺的浓度从300to 120000mg/ 1，含有铁的浓度从500mg/l到900000mg/l，尤其是500mg/l到450000mg/l。在另一个较优实施例中，培养添加剂含有多胺的浓度为4000mg/l至12000mg/l，铁的浓度为5000mg/ 1至90000mg/l，尤其是从5000mg/l至45000mg/l。在一个特别优选的实施例中，本发明所示培养基含有一定数量的如本发明所示的培养添加剂，例如提供了一种培养基至少含有一种多胺和至少含有一种铁，其中培养基中多胺的浓度至少为20mg/l，25mg/l，30mg/l，35mg/ 1，45mg/l，或者特别是50mg/l ；培养基中铁浓度至少为2mg/l，5mg/l，10mg/l，15. 50mg/l， 100mg/l,240mg/l和至少为480mg/l。在一个特别优选的实施例中，本发明所示的培养基包含有一定数量如本发明所示的培养添加剂，例如提供了一种含有至少一种多胺和至少一种铁的培养基，其中培养基中多胺的浓度从30mg/l至120mg/l ；培养基中铁浓度从50mg/l至 900mg/l，优选 50mg/l 至 450mg/l。在进一步优选的实施例中，本发明所示的培养添加剂是指一种培养基添加剂。在进一步优选的实施例中，培养基是指一种细胞培养基。在进一步优选的实施例中，培养基是指一种富集培养基。下列术语是同义的，意思相同，“培养基”和“细胞培养基”。一种“培养基”是指一种基质，所述基质适合细胞培养或孵育。这种培养基可能包含维持细胞完整、或细胞活力、或细胞生长、或细胞产率的营养。作为优选的培养基是一种液体培养基。专利WO 2007/036291 描述了一种特别优选的培养基，可用于本发明中。一种基础培养基是指一种培养基的特定实施例，最好与其他成分相结合，例如一种富集培养基。一种特别优选的基础培养基包含细胞生长、细胞活力和细胞产率所需的所有物质。一种优选的基础培养基特别包含下面的例子，但不局限于此，例如葡萄糖1. 0-6. Og/Ι，氯化钠2. 8-6. 2g/l，氯化钾273_945mg/， 氯化钙 48-290mg/l，氯化镁 42_330mg/l，磷酸二氢钠 56_1130mg/l，精氨酸 56_930mg/l， 天冬酰胺44-900mg/l，天冬氨酸^_445mg/l，半胱氨酸35_270mg/l，谷氨酸44_900mg/l，谷氨酰胺 44-900mg/l,甘氨酸 18_180mg/l，组氨酸 42_670mg/l，异亮氨酸 54_877mg/l， 亮氨酸 59-1250mg/l，赖氨酸 73_1120mg/l，蛋氨酸 9_45%ig/l，苯基丙氨酸 35_677mg/l， 脯氨酸17-828mg/l，丝氨酸^_1339mg/l，苏氨酸M_989mg/1，色氨酸9_441mg/l，酪氨酸 55-565mg/l，缬氨酸52_787mg/l，碳酸氢钠2. 4g/l。一种优选的基础培养基可进一步包括脂肪酸和核苷酸。下面的术语是同义的“富集培养基(feed medium) (feeding medium)”和“灌注培养基(perfusion medium)”。术语“富集培养基(feed medium) ”是指培养基的一个特定实施方式，在培养过程中向细胞培养中加入的物质。换言之，一种富集培养基是一种培养基，在第一培养基与细胞接触后加入到细胞培养中的物质，例如基础培养基。向培养基中加入一种富集培养基有多种用途，例如可以延长细胞寿命，提高细胞活力，增加细胞浓度，或者增加产物浓度。专利WO 2007/036291描述了一种特别优选的富集培养基，可用于本发明中。一种如本发明所示的优选的富集培养基包含细胞生长、细胞活力和细胞产率所需的所有物质。例如，一种富集培养基并不局限于盐，首选含有微量元素，碳水化合物，氨基酸，脂肪酸，PH值调节剂和核苷酸。仅仅含有一种或多种上述物质的富集培养基同样适用。根据本发明多胺和铁的浓度，即现在的培养添加剂可以以优选的实施方式应用于培养基、基础培养基或富集培养基中。因此，在本发明中，一种培养基或一种含有添加剂的细胞培养基就是一种如上所述的培养基、基础培养基或富集培养基，所述培养基中包含有培养添加剂。在特别优选的实施例中，一种培养添加剂除了包含至少一种多胺和至少一种铁， 还要含有至少一种溶剂，例如水或盐水。因此，一种培养添加剂优选的实施方式可以是液体形式。本发明中培养添加剂加入到一种培养基中，所述培养基可以是传统的培养基。本发明所示的一种培养基除了含有本发明所示的培养添加剂以外，可以含有其它成分，例如溶剂，其中溶剂可以是水、维生素、盐、碳源和/或氮源、氨基酸、PH值调节剂、微量元素、脂肪酸、核苷酸。特别是，本发明所示的培养基是一种水相培养基。如今，对哺乳动物细胞的细胞培养在科学教科书和手册中都有良好的描述。详细信息包括在R. Ian Fresney所著的《动物细胞培养》一书中，手册，第四版，Wiley-Liss/ N. Y.，2000。培养基和培养方法，例如动物细胞，结合本发明所示的添加剂其应用本质上在本领域内已是众所周知的。这种培养基优选的组成是含有一种溶剂，例如水、碳源、氮源、 氨基酸、PH值调节剂、微量元素、脂肪酸、核苷酸。在本发明中优选的培养基是标准细胞培养基，这也可能是适应特定细胞类型的需要，内容包括而不限于，罗斯韦尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640培养基，L-15培养基，达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，最小量伊格尔氏培养基(MEM)，Ham' s F12培养基或Iscoves ‘改良的DMEM培养基。其他优选培养基是例如Ham' sFlO或F12培养基，这是专门为CHO细胞培养设计的。本发明其它优选的培养基特别适用于CHO细胞培养，并在EP0481791中有实例描述。本发明的一种优选的培养基也可以是已经商业化的培养基,例如但不局限于CD CHO (Gibco，10743、ProCH05 (Bio ffhittaker, BE12-766Q), HyQSFM4CH0(HyClone, SH30548. 02)。本发明的细胞培养基中以优选的实施方式进行的可以含有蛋白质。这些蛋白质可来源于任何重组或从天然物中分离出来的蛋白质，比如转铁蛋白，牛血清白蛋白或胰岛素。这种蛋白质优选是重组产生的，例如重组胰岛素，或重组牛血清白蛋白，或重组人血清白蛋白。在本发明的一个特定优选实施例中，本发明所示的培养添加剂和含蛋白质的。本发明进一步的一个优选实施例中，本发明所示的培养添加剂和含谷氨酰胺的。在本发明的一个特定优选实施例中，本发明所示的培养添加剂和含动物成分的。在一实施例中，本发明优选的培养基也可以包含由动物来源、植物来源或酵母的水解物。首选是植物来源的水解物，如大豆蛋白胨或酵母水解物。本发明的培养基在一实施例中可以含有肽，所述肽可以是二肽、三肽、寡肽或多肽。在一个特定首选实施例中，本发明所示的培养添加剂和/或培养基是无血清。在一个特定的首选实施例中，本发明所示的培养添加剂和/或培养基是无蛋白质的。在一个特定的首选实施例中，本发明所示的培养添加剂和/或培养基不含从动物中分离出的物质。在一个特定的首选实施例中，本发明所示的培养添加剂和/或培养基是不含水解物的。 在更进一步的首选实施例中，本发明所示的培养添加剂和/或培养基是不含肽的。在一个首选的实施例中，本发明所示的培养添加剂或培养基中含有一个或多个其它细胞营养素，即一种碳的来源和一种氮的来源，所述碳的来源例如葡萄糖，所述氮的来源例如氨基酸和/或其盐。根据本发明，在一个首选的实施例中，本发明所示的培养添加剂可以以一种或多种储备液的形式存在，比如含储备液的铁和多胺。在另一首选的实施例中，储备液包含下面两种物质，即至少含有一种多胺和至少一个铁。在所述的储备液中，可以首选高浓度的多胺和/或铁。该储备液可以含有其它成分，例如盐或PH值调节剂。该类储备液可用来添加到培养基、或富集培养基、或细胞培养基中，形成了本发明的培养基。此处储备液也可被定义为“试剂盒”。通过加入“试剂盒”，预期的多胺和铁的浓度可以在最终培养基或细胞培养中调整。该培养基或培养添加剂也可以含有其它物质，特别是金黄三羧酸(aurin tricarboxylic acid, ΑΤΑ)、二氯乙酸(DCA)和/或琥珀酸。当然，一种或更多的酸可以以盐类及其衍生物的形式存在。根据本发明，在一个首选实施例中，多胺和铁可以结合如本发明所示的培养添加剂或培养基，所述的培养添加剂或培养基可含有二氯乙酸，或其盐类，或其衍生物，例如二氯乙酸酯(DCA)或其盐类，例如二氯乙酸钠。根据本发明，在一个首选实施例中，多胺和铁可以结合本发明所示的含有琥珀酸及其盐类，例如六水琥珀酸钠的培养添加剂或培养基。根据本发明，在一个首选实施例中，多胺和铁可以结合本发明所示的含有金黄三羧酸(aurin tricarboxylic acid, ΑΤΑ)及其盐类的培养添加剂或培养基。在一特定首选实施例中，培养基或培养添加剂包括精胺、柠檬酸铁、二氯乙酸钠、 六水琥珀酸钠和金黄三羧酸。在一特定首选实施例中，本发明所示的培养添加剂含有100mg/l至900mg/l，优选 400mg/l的多胺，尤其是精胺；lmg/1至10mg/l，优选4g/l的铁，尤其是柠檬酸铁或下述物质中的一种或多种5mM到IOOmM,优选20mM的二氯乙酸钠；5g/l至100g/l，优选30g/l六
/或培养基是不 /或培养基是不 /或培养基是不水琥珀酸钠；5mg/l至100mg/l，优选25mg/l金黄三羧酸。术语“多胺”是指确定结构的有机化合物，由碳、氮、氢组成，并含有两个或两个以上氨基基团。在特定优选的实施例中，本发明所用的多胺是指精胺、亚精胺、去甲精胺、去甲精眯、高精胺、高精眯、尸胺、腐胺、胍丁胺、鸟氨酸。水合或脱水的形式、各种盐的形式或结合一种或多种的多胺都包括在术语“多胺”中。术语“铁”是指确定的过渡金属Fe，原子量为55. 845。术语“铁”是一通用术语，即含有一种或多种铁离子的所有分子，例如狗3+离子和/或!^2+离子。Fe3+离子和/或!^2+ 离子可以以铁盐的形式存在。铁盐可以含有结晶水和不含结晶水。在一个特定优选实施例中，铁包含铁(II)和/或狗(111)离子。在一个特定优选实施例中，本发明所用铁可选自以下组的物质磷酸铁，焦磷酸铁，硝酸铁，硫酸亚铁，三氯化铁，乳酸亚铁，柠檬酸铁，柠檬酸铁铵，右旋糖酐铁，乙二胺四乙酸铁钠盐或上述物质含结晶水或不含结晶水的形式。铁也可以与另一个分子络合，例如与载体或螯合剂络合。一些特定优选的例子中， 铁和螯合剂络合的配合物是指乳酸亚铁(II)水合物、柠檬酸铁(III) (CAS :3522-50-7)、柠檬酸铁铵(III)、右旋糖酐铁、乙二胺四乙酸铁钠盐(CAS :15708-41-5)。铁也可以与下述物质络合，例如专利US 60487 所描述的即吡哆醛异烟酰腙， 柠檬酸，柠檬酸胆碱，乙酰丙酮，以及其他各种有机酸，如苹果酸，琥珀酸，延胡索酸，α -酮戊二酸。专利W02001/016294进一步给出了本发明所用的铁螯合剂。本发明所用铁的一些特定优选的例子磷酸铁(III)，焦磷酸铁水合物(III)，右旋糖酐铁，九水硝酸铁(III)，七水硫酸亚铁(II)，六水三氯化铁(III)，柠檬酸铁(III)，柠檬酸铁铵(III)。本发明还涉及到一个制备培养基的方法，其特征在于，根据本发明所示的培养添加剂添加到液体培养基中，特别是添加到对于本领域而言常规的培养基中。本发明还涉及到根据本发明所使用的培养添加剂来制备培养基。本发明的另一方面是一方法，在这个过程中，细胞与培养基接触，所述培养基包含至少一种多胺，其浓度至少为优选高于20mg/l ；还包含至少一种铁，其浓度至少为优选高于aiig/Ι。本发明的一个优选方式是，用本发明的培养基来培养细胞，包括逐渐增加多胺或者铁的浓度或者两者的浓度同时增加，例如在一个培养容器中，以至于这些成分的最终优选浓度在细胞培养过程中体现出来。以一种优选的方式，增加一种或两种物质的浓度也可通过向培养基中加入多胺和/或铁或从一种或多种储备液中加入到细胞培养基中。本发明还涉及到了在培养基中培养细胞的方法，其中，a)准备细胞和第一次用的培养基，b)在适宜培养所述细胞和所述第一次用培养基的条件下，在所述第一次用培养基中培养细胞，c)在所述第一次用培养基接种细胞之前，或之后，或在培养过程中，其中至少一种多胺或铁或两者加入到第一次用培养基中，因此，已有的多胺和加入到步骤a)，b)，c) 中的所有多胺的总量和已有的铁和加入到步骤a)，b)，c)中的所有铁的总量形成了如本发明所示的浓度，尤其是其浓度含有至少一种多胺的浓度至少为20mg/l和至少一种铁的浓度至少为ang/1。因此，本发明构想了在培养基中培养细胞的这样一个过程，预测了出现在培养基中所有多胺的总量和所有铁的总量，所述所有多胺的总量包括在培养过程中加入的多胺和可能已经消耗掉的多胺，所述所有铁的总量包括在培养过程中加入的铁和可能已经消耗掉的铁，导致产生本发明所示理论浓度，其中这个理论浓度包括至少一种多胺的总量其浓度至少为20mg/l和至少一种铁的总量其浓度至少为aiig/1。根据本发明，所有已知的细胞培养过程实施例适合应用于本发明中。本发明的一个优选过程实施例是一个细胞高密度过程。一个细胞高密度过程定义为一个过程，在这个过程中，细胞浓度超过1 X 105/ml，优选1 X 106/ml，最优选1 X 107ml。根据本发明，优选的实施方式是连续过程、分批过程、分流批量过程、流加过程或灌注过程。在一特定优选的实施方式中，培养细胞的方法是一种流加过程。该方法的实施细节对技术人员来说是众所周知的。专利WO 2007/036291描述了该方法实施方式的更多细节限定。作为一个非约束性的例子，一个典型的流加过程始于培养基接种的细胞。在细胞与培养基接触之后，细胞培养将会与另一培养基相接触，例如一个富集培养基。接种后， 与富集培养基接触的细胞可以但不局限于接触1至4天。可以连续、间歇或分批添加富集培养基到细胞培养基中。通过向培养基中加入富集培养基可以提高培养体积。根据本发明优选是长培养时间的方法。一个长培养时间定义为生产步骤(η步) 的过程时间，所述生产步骤至少是4天或更长，优选至少8天或更长，较为优选至少10天或更长，进一步优选至少12天或更长，最优选至少14天或更长。本发明对细胞的类型并不限定。细胞类型例子包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，细菌细胞和酵母细胞。细胞还可以是原代细胞或干细胞。这些细胞可能是自然产生的细胞而不是被转化或转染的细胞。这些细胞也可以是与一个或更多的重组基因表达载体转染或转化的重组细胞。这些细胞可以用病毒转化以产生任何产物，例如病毒产物。这些细胞可来源于仓鼠、老鼠、人类或其他动物。这些细胞也可以是细胞株，例如但不限于CHO细胞、NSO细胞、Per. C6细胞、BHK细胞、SP2/0细胞。因此，本发明还涉及到了一种在培养基中培养细胞的方法，其中，a)提供本发明的细胞和培养基，b)在恰当和适宜的培养条件下，细胞在所述培养基中培养，这意味着在所述培养基中培养所述细胞，特别是提供的条件适合细胞生长和/或细胞扩增和/或细胞产物的生产。在一个特定优选的实施例中，细胞在所述培养基中超过两个通道或多于4天进行培养。在另一个优选的方案中，在培养基中培养细胞的方法是一个过程，所述过程是指一个细胞产物产生的过程，尤其是一个蛋白表达，尤其是从细胞表达和分泌。在另外一个优选方案中，本发明涉及到在培养基中培养细胞的过程，其中，a)提供细胞和第一培养基，尤其是常规培养基，b)在所述培养基中培养所述细胞的适宜条件下，细胞在所述的第一培养基中培养，其中，a)在培养基接种细胞之前，和/或b)在培养基接种细胞之后，和/或c)在培养过程中，和/或d)在培养初期和培养过程中，至少添加一种如本发明所示的培养添加剂，这样培养细胞期间形成了第二培养基，所述第二培养基是指本发明的一种培养基，以一种先后制备的方式提供，即逐步增加多胺和/或铁的浓度到本发明的高浓度。本发明的进一步优选方式在从属权利要求书中体现。下面的实施例和附图可更清楚的说明本发明。
图1表示细胞高密度流加方法中多胺和铁的协同效应。
图2表示分批方法中在100mg/l的焦磷酸铁(III)存在下使用亚精胺作为多胺的来源。图3表示细胞高密度流加方法中在100mg/l的焦磷酸铁(III)存在下精胺浓度的影响。图4表示分批方法中在40mg/l精胺存在下铁浓度的影响。图5表示分批方法中铁单独的影响以及和精胺结合的影响。图6表示细胞高密度流加方法中铁单独的影响以及和精胺结合的影响。图7表示精胺和柠檬酸铁(III)浓度的正面促进作用分布。图8表示精胺和磷酸铁(III)浓度的影响。图9表示精胺和右旋糖酐铁浓度的影响。
具体实施例方式材料和方法细胞所有实验使用的是CHO DG44 宿主细胞系(Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77 :4216)。宿主细胞系经携有IgG抗体基因的载体转染，培养基中使用MTX 进行转染扩增，生产一种抗体克隆分离和克隆，一种抗体的克隆被分离出来，然后这种克隆可应用于所有实验。细胞培养条件待用培养细胞保存在一个摇瓶或转瓶中。储备培养基每隔两到三天补充到新的培养基中。这意味着细胞培养的一小部分用来接种并转移到一个新的烧瓶中，并补充新鲜的培养基。细胞在37°C时在一种培养箱中的CO2气体中培养。在这种方式下，细胞在几次传代中培养。其中传代定义为2-4天的培养时间。在不同的时间点下，从储备培养基中取出接种细胞并进行不同规模的实验，例如在6孔板、摇瓶、T型瓶、转瓶和生物反应器中进行。培养基如下所述的一种培养基(也称为专用培养基)是用于在所有步骤中培养细胞的， 如在储备培养基中，在培养基扩大步骤和在生产步骤。基础培养基包括细胞生长、细胞活力和细胞生产所需的所有物质。基础培养基包括葡萄糖1. 0-6. Og/Ι，氯化钠2. 8-6. 2g/l， 氯化钾 273-945mg/l，氯化钙 48_290mg/l，氯化镁 42_330mg/l，磷酸二氢钠 56_1130mg/l， 精氨酸56-930mg/l，天冬酰胺44_900mg/l，天门冬氨酸^_445mg/l，半胱氨酸35_270mg/ 1，谷氨酸 44-900mg/，谷氨酰胺 44_900mg/l，甘氨酸 18_180mg/l，组氨酸 42_670mg/l，异亮氨酸 M_877mg/1，亮氨酸 59-1250mg/l，赖氨酸 73_1120mg/l，蛋氨酸 9_45%ig/l，苯丙氨酸 35-677mg/l，脯氨酸 17_828mg/l，丝氨酸 ^_1339mg/l，苏氨酸 M_989mg/1，色氨酸 9-441mg/l，酪氨酸55-565mg/l，缬氨酸52_787mg/l，碳酸氢钠2. 4g/l。基础培养基进一步包括脂肪酸和核苷酸。除非另有说明，在所有批次和流加实验中使用相同的专有培养基和专有富集培养基。在流加实验中使用的富集培养基(以下也被称为“专有富集培养基”)具有对细胞生长、细胞活力和细胞产率所有必要的物质，特别是盐、微量元素、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、PH值调节剂、核苷酸。尽管这里使用的富集培养基含有上述物质，但是并不是所有富集培养基含有这些成分。含有一种或多种上述物质的富集培养基同样适用。基础培养基和富集培养基这两种都是不含血清，不含蛋白，不含蛋白胨，不含肽的。然而，向培养基中补充以上一种或多种添加剂是可能的。所有的培养基都是化学定义的，包含单个的明确定义的化学物质。实验以分批或流加的模式进行。如果一个实验是以流加的模式设计的，在生产培养基(培养基)时是通过接种烧瓶中的储备培养细胞开始的。培养瓶中以2-4X 105/ml活细胞接种密度接种。细胞培养1-4天。在第一次使用富集培养基后，培养基需要补充。每隔1-3天培养基要分批添加。添加富集培养基要分批进行(弹丸式添加)。添加培养基时可以是连续的，尤其是在生物反应器中时。在流加实验时，可使用两个不同的培养基。然而， 也有可能使用一个或两个以上的不同培养基。只要细胞活力大于50%，培养基就可进行接种。因此，培养时间大约是10-18天。每天都要从培养基中取样品并进行分析，例如细胞计数和代谢物测量。抗体在培养基的上清液中的浓度采用ELISA或蛋白A HPLC方法来测定。储备液是从测试物质和基础培养基和/或添加的培养基来制备的，所述添加的培养基作为补充，以达到最终浓度。除非另有说明，所有的化学品均购自SigmaGt. Louise， M0)。在本发明的实施例中，给出了 Sigma化学品目录号。在给含有测试物质的生产瓶接种之前，储备培养细胞要进行离心分离。在相应的培养基中，细胞球是悬浮的。以这种方式， 通过接种培养避免了物质传输的影响。然而，在实际生产的条件下，接种培养的离心分离是不需要的，并且也不必作的。实施例1 分别测试多胺和铁及组合测试多胺和铁该实施例表示高浓度多胺和铁的组合的协同效应。制备一种不含铁和多胺的细胞培养基时。相应量的储备液吸入到培养基中以调整测试物质(即多胺和铁)的最终浓度。 然后，所制备的培养基进行细胞接种。该实验以流加方式进行的。使用的富集培养基是不含多胺和铁的。图1表示铁是细胞生长必不可少的物质。最重要的是，如果精胺和铁两种物质同时以高浓度使用，那么可以刺激细胞生长。令人惊讶的是，两种物质对细胞生长显示出了协同效应。实施例2 在分批过程中，亚精胺作为多胺的来源以高浓度进行实验本实验的目的表明，对于细胞生长，亚精胺和精胺具有相似的积极促进效应。制备一种含有100mg/l的焦磷酸铁(III)水合物(P6526)和不含有多胺的细胞培养基。制备了一种亚精胺(S4139)的储备液。相应量的亚精胺储备液吸入到培养基中以调节亚精胺的最终浓度，这一点可从图2的图例中看出。然后，所制备的培养基进行细胞接种。该实验是以分批方式进行的。图2表示在一分批过程中，如果亚精胺可用，细胞会达到较高浓度。是我们惊讶的是，亚精胺的毒性在高浓度测试时未发现。实施例3 在细胞高密度流加过程中，需要较高浓度的精胺吗(FBI 17) ？通常情况下，在流加过程中细胞浓度的峰值高于分批过程的。因此，同分批过程的相比，对于营养浓度的需求要高。尤其是在细胞高密度的过程中，如细胞浓度超过IXiO7/ ml，就需要更多精胺和铁。制备一种含有100mg/l的焦磷酸铁(III)水合物(P6526)和不含有多胺的细胞培养基。精胺(S4264)的储备液制备成浓度为40g/l。相应量的储备液吸入到培养基中以调节精胺的最终浓度，这一点可从图3的图例中看出。然后，所制备的培养基进行细胞接种。 该实验是以流加方式进行的。所有的培养基添加专有的富集培养基，所述富集培养基含有有利于细胞生长和细胞活力的底物，例如氨基酸和葡萄糖。富集培养基中不含多胺，含有焦磷酸铁(III)水合物，其浓度为800mg/l。图3表示随着精胺浓度的增加细胞生长更好。在给定铁浓度的情况下，精胺的优选浓度在实施例中是从40mg/l到120mg/l。实施例4 对于饱和高浓度精胺，需要较高浓度的铁吗(SF57) ？在实施例3中发现，精胺浓度为40mg/l时效果最好。细胞培养基制备成浓度恒定为40mg/l的精胺溶液。焦磷酸铁(III)水合物(P6526)储备液制备成浓度为5g/l和50g/ 1。相应量的储备液吸入到培养基中以调整培养基中铁的最终浓度，这一点可从图4的图例中看出。然后，所制备的培养基进行细胞接种。该实验是以分批方式进行的。图4表示在精胺存在下，细胞能承受极高浓度的铁。实施例5 在一分批过程中，精胺与硝酸铁结合的分析(SF107)该实施例表示铁和含有替代铁的精胺的协同效应。制备一种不含有铁和多胺的细胞培养基。制备九水硝酸铁(CAS :7782-61-8)和精胺的储备液。相应量的储备液吸入到培养基中以调整测试物质的最终浓度，这一点可从图5的图例中看出。然后，所制备的培养基进行细胞接种。该实验是以分批方式进行的。图5表示在分批过程中，如果精胺和铁两种物质都是在高浓度时使用，细胞达到较高浓度，表明了两种物质的协同效应。实施例6 在流加过程中，精胺与柠檬酸铁结合的分析(FB188)该实验分析了在流加过程中细胞高密度时，精胺结合柠檬酸铁(III)的协同效应。铁来自于柠檬酸铁(III) (CAS number :3522-50-7)。细胞培养基在制备时不含铁和多胺。精胺储备液制备成40g/l (S4264)。柠檬酸铁(III)储备液制备成50g/l。相应量的储备液吸入到培养基中以调整培养基中精胺和柠檬酸铁(III)的最终浓度，这一点可从图6的图例中看出。富集培养基中不含铁和多胺。细胞转移到准备好的培养基中。实验是以流加方式进行的。所有培养基添加含有便于细胞生长和细胞活力的物质，例如氨基酸和葡萄糖。在第6天，所有培养基进一步以柠檬酸铁(III)进行补充以达到最终浓度400mg/ 1。图6表示达到最佳细胞生长精胺和铁都是必须的。此外，一个非常高的精胺和铁的浓度是必要的，在细胞高密度流加过程中特别需要如此高的精胺和铁的浓度，其中细胞浓度超过 lX107/ml.。实施例7 在流加过程中，精胺与不同浓度的柠檬酸铁结合的实验(FB171-3)该实验的目的是测试精胺和其它铁对细胞生长的积极促进作用是否明显。在本实验中，测试在流加过程中柠檬酸铁与含有精胺和不含精胺结合时的影响。制备一种不含铁和多胺的细胞培养基。精胺储备液制备成40g/l。柠檬酸铁(III)储备液制备成 50g/l(CASnumber :3522-50-7)。相应量的储备液吸入到培养基中以调整精胺和柠檬酸铁(III)的最终浓度，这一点可从图7的图例中看出。接种细胞在不含多胺和铁的培养基中培养3天以消耗细胞内的铁和多胺池。那么这些细胞被用作菌种。实验是以流加方式进行的。所有培养基添加便于细胞生长和细胞活力的物质，例如氨基酸和葡萄糖。该富集培养基不含多胺，含有浓度为 3200mg/l的柠檬酸铁(III)。图7表明精胺与其它铁一起也具有积极促进作用。此外，在精胺存在下，细胞能允许铁浓度高达800mg/l。
实施例8 在流加过程中，精胺与磷酸铁(III)结合的实验(171-2)该实验的目的是看看其它铁是否同先前分析的促进细胞生长的聚胺浓度具有一样的积极促进作用。在本实验中，测试了含有精胺和不含精胺的磷酸铁(III) (F152;3)。制备一种不含铁和多胺的细胞培养基。精胺储备液制备成40g/l(S4^4)。磷酸铁(III)储备液制备成50g/l。相应量的储备液吸入到培养基中以调整精胺和磷酸铁(III)预期的最终浓度，这一点可从图8的图例中看出。然后用所制备的细胞进行接种。实验是以流加方式进行的。 所有培养基添加含有便于细胞生长和细胞活力的物质，例如氨基酸和葡萄糖。该富集培养基不含多胺，含有浓度为800mg/l的磷酸铁(III)。图8表明精胺与磷酸铁(III) 一起也具有积极促进作用。令人惊奇的是，在精胺存在下，如此高的铁浓度对细胞是没毒性的，而是促进细胞生长。实施例9 在流加过程中，精胺结合右旋糖酐铁的实验(174-1)该实验的目的是看看其它铁是否同先前分析的促进细胞生长的聚胺浓度具有一样的积极促进作用。在本实验中，采用右旋糖酐铁(D8517)进行测试。制备一种浓度为 40mg/l的精胺细胞培养基，该培养基不含铁。浓度为100g/l的右旋糖酐铁溶液购自Sigma。在开始试验之前，细胞在没有铁的培养基中培养2天。以这种方式。细胞内的铁池消耗了。然而，上面细胞对铁的需要对于精胺和右旋糖酐铁的功能是不必要的。细胞缺铁会饿死。这些细胞转移到上述制备的培养基中。实验是以流加方式进行的。富集培养基不含精胺和铁。所有培养基添加便于细胞生长和细胞活力的物质，例如氨基酸和葡萄糖。在第6天，所有培养基进一步以右旋糖酐铁进行补充以达到最终浓度250mg/l。图9表示在精胺存在下，达到最佳细胞生长高浓度的右旋糖酐铁是必须的。令人惊奇的是，如此高的铁浓度对细胞是没毒性的，而是促进细胞生长。
权利要求
1.一种培养基添加剂，所述培养添加剂含有至少一种多胺浓度至少为20mg/l和至少一种铁源浓度至少为ang/1。
2.根据权利要求1所述培养添加剂，其特征在于所述多胺的浓度至少为35mg/l。
3.根据权利要求1所述培养添加剂，其特征在于所述多胺的浓度至少为50mg/l。
4.根据权利要求1至3中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述铁源的浓度至少为 5mg/L·
5.根据权利要求1至4中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述铁源的浓度至少为 240mg/l。
6.根据权利要求1至5中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述铁源的浓度至少为 480mg/l。
7.根据权利要求1至6中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述铁源含有!^(II)1 子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述铁源含有!^e(III)1 子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述铁源可选自下面一种或多种化合物、或它们的盐、或它们的水合物或无水形式磷酸铁(III)、焦磷酸铁 (III)、硝酸铁(III)、硫酸亚铁(II)、三氯化铁(III)、乳酸亚铁(II)、柠檬酸铁(III)、柠檬酸铁(III)铵、右旋糖酐铁、乙二胺四乙酸铁钠盐。
10.根据权利要求1至9中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述多胺可选自下面一种或多种化合物、或它们的盐、或它们的水合物或无水形式亚精胺、精胺、去甲精胺、去甲精眯、高精胺、高精眯和尸胺。
11.根据前述权利要求中任一项所述培养添加剂，其特征在于所述多胺是精胺。
12.—种培养基，含有前述权利要求中任一项所述的培养添加剂。
13.根据权利要求12所述培养基，其特征在于所述多胺的浓度为30mg/l-120mg/l。
14.根据权利要求12或13所述培养基，其特征在于所述培养基中至少有一种铁源， 浓度为 50mg/l-450mg/l。
15.根据权利要求12至14中任一项所述培养基，其特征在于所述多胺的浓度为 30mg/l-120mg/l 和所述铁源的浓度为 50mg/l_450mg/l。
16.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述培养基或培养添加剂包括一种水溶液、一种碳源和一种氮源。
17.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述的培养基或培养添加剂至少含有一种以下物质金黄三羧酸(ΑΤΑ)、二氯乙酸(DCA)、琥珀酸和它们的盐及衍生物。
18.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述的培养基或培养添加剂含有下面三种物质a)金黄三羧酸(ATA)、b) 二氯乙酸(DCA)、c)琥珀酸和它们的盐及衍生物。
19.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述培养基或培养添加剂不含血清。
20.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述培养基或培养添加剂不含谷氨酰胺。
21.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述培养基或培养添加剂不含蛋白。
22.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述培养基或培养添加剂不含水解产物。
23.根据前述权利要求12至21中任一项所述培养基，其特征在于，所述培养基是富集培养基。
24.根据前述权利要求中任一项所述培养基或培养添加剂，其特征在于所述培养基或培养添加剂是以试剂盒的形式提供的。
25.一种制备培养基的方法，其特征在于根据任一权利要求1至11或16至M中任一项所述培养添加剂添加至液体培养基中。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述液体培养基是一种包括一种水溶液、一种碳源和一种氮源的常规的培养基。
27.根据权利要求25或沈所述的方法制备的一种培养基。
28.权利要求1至11或16至M所述的制备培养基的培养添加剂的应用。
29.一种在培养基中培养细胞的方法，其特征在于a)根据权利要求12至M中任一项或权利要求27所提供的细胞和培养基，b)在所述培养基中适宜培养所述细胞的条件下，在所述培养基中培养细胞。
30.根据权利要求四所述的方法，其特征在于所述细胞在所述培养基中培养时间超过两个通道或多于4天进行培养。
31.根据权利要求四或30所述方法，其特征在于所述方法是一个连续过程、一个半连续过程、一个分批过程、一个分流批量过程、一个流加过程或一个灌注过程。
32.根据权利要求四至31中任一项所述方法，其特征在于所述方法是一种从所述细胞中生产至少一种蛋白的方法。
33.一种在培养基中培养细胞的方法，其特征在于a)提供了细胞和第一培养基，b)在所述第一培养基中适宜培养所述细胞的条件下，在所述第一培养基中培养细胞， 用细胞接种所述第一培养基之前、或之后、或培养期间，向第一培养基中添加根据权利要求 1至11或16至M中任意所述的培养添加剂，这样培养细胞期间形成了第二培养基。
34.一种在培养基中培养细胞的方法，其特征在于a)提供了细胞和第一培养基，b)在所述第一培养基中适宜培养所述细胞的条件下，在所述第一培养基中培养细胞，c)用细胞接种所述第一培养基之前、或之后、或培养期间，在第一培养基中加入至少一种多胺或至少一种铁源或两者。所有多胺的总量和所有铁源的总量生成权利要求1至M中任意项所述的浓度，所述多胺的总量是指已存在的和添加到步骤a)、b)和c)中的，所述铁源的总量是指已存在的和添加到步骤a)、b)和c)中的。
全文摘要
本发明涉及一种改进的包括多胺和铁的细胞培养添加剂，一种含有该细胞培养添加剂的培养基和一种使用该细胞培养添加剂提高细胞生长、细胞活力或细胞产率的方法。
文档编号C12N5/00GK102317440SQ200980102217
公开日2012年1月11日 申请日期2009年1月7日 优先权日2008年1月9日
发明者克斯廷·厄勒斯, 奥拉夫·克吕格尔, 拉尔斯·科伯 申请人:塞尔卡有限公司