专利名称：发酵乳的制造方法
技术领域：
本发明涉及通过使具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cell wall-enveloped proteinase, PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌
共发酵而得到的发酵乳的制造方法。本申请要求2008年6月11日在日本申请的日本特愿2008-152949号的优先权， 并将其内容援引于此。
背景技术：
已知双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌、即双歧杆菌是在人的肠道内形成的肠道
菌群的优势菌种之一，具有恢复肠内细菌平衡的整肠作用、免疫增强作用、抗肿瘤作用寸。因此，近年来，随着消费者的健康意识的提高，对双歧杆菌发酵乳等含有活双 歧杆菌的食品的需求正在增加。双歧杆菌在乳类培养基中的增殖性差。因此，为了使发酵乳中含有一定量的、 例如IX IO7CFUAnL的双歧杆菌，通常需要添加酵母提取物等各种增殖促进物质。但 是，前述增殖促进物质通常价格昂贵，还可能有损风味。公开了 通过使其与除双歧杆菌以外的乳酸菌的混合发酵来改善双歧杆菌的 生长性、保存存活性而不必添加前述生长促进物质等的各种方法。关于改善制造发 酵乳时的双歧杆菌的生长性的方法，例如公开了(1) 一种酸奶及其制造方法，其特征 在于，含有乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococcus lactis subsp.cremoris)及双歧杆菌属(例如参照专利文献1。)。此外，关于改善发酵乳的双歧杆菌的保存存活性的方法，例如公开了(2) —种 双歧杆菌发酵乳的制造方法，其特征在于，在以乳作为主要成分的培养基中，混合培养 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、以及不生成丁二酮及乙偶姻的乳酸乳球菌乳酸亚种 (例如参照专利文献2。)。专利文献1 日本专利第3364491号公报专利文献2 日本专利第3068484号公报
发明内容
发明要解决的问题然而，在上述(1)的方法中，未必可以说具有充分的促进双歧杆菌的生长及缩 短发酵时间的效果。另外，在存在乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种这2种菌 的条件下可促进双歧杆菌的生长，但关于分别单独使用乳酸乳球菌乳酸亚种或乳酸乳球 菌乳脂亚种时的效果，完全没有记载。
另一方面，在上述(2)的方法中，通过使用由特定的双歧杆菌和特定的乳酸菌 组成的混合菌，确认到增殖促进效果和存活性改善效果这两方面，但关于除短双歧杆菌以外的双歧杆菌、例如食品中通用的长双歧杆菌，完全没有记载。本发明的目的在于提供一种发酵乳的制造方法、及通过前述制造方法制造得到 的发酵乳，其使用了能够改善双歧杆菌的增殖性的乳酸菌。用于解决问题的方案本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，使具有细胞壁局部存在性蛋白酶PrtP的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)与双歧杆菌混合发酵时，能够促进 双歧杆菌的增殖，从而完成了本发明。S卩，本发明提供一种发酵乳的制造方法，其特征在于，使用具有细胞壁局部存 在性蛋白酶(cell wall-enveloped proteinase, PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和双 歧杆菌(Bifidobacterium)属菌使发酵底物(fermentation base)发酵。另外，本发明提供一种发酵乳的制造方法，在前述方法中，前述双歧杆菌属菌 为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。另外，本发明提供一种发酵乳的制造方法，在前述方法中，前述长双歧杆菌为 长双歧杆菌ATCC BAA-999菌株和/或长双歧杆菌模式菌株(type strain) ATCC15700菌株。另外，本发明提供通过前述任一项记载的发酵乳的制造方法制造得到的发酵 乳。发明的效果根据本发明的发酵乳的制造方法，能够有效地制造含有前所未有的大量双歧杆 菌、特别是长双歧杆菌的发酵乳。另外，通过本发明的发酵乳的制造方法制造得到的发 酵乳，其整肠效果更好，在健康管理上也有用。
图1是表示将PCR产物通过电泳法进行分离并通过染色进行检测而得到的区带 图案的图，所述PCR产物是以来源于乳酸乳球菌各菌株的DNA作为模板、并使用检测 PrtP酶基因的引物进行PCR而得到的。
具体实施例方式本发明中所用的乳酸菌是具有PrtP酶的乳酸乳球菌。PrtP酶是存在于细胞膜且 活性部位露出细胞表面的酶。作为具有PrtP酶的乳酸菌，报道了例如乳酸乳球菌乳脂 亚禾中(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚禾中(Lactococcus lactis subsp. lactis)等乳球菌属菌中若干具有PrtP的菌株。迄今为止，来源于乳酸乳球菌的PrtP酶中，已知的有巧型(几乎不分解α-酪蛋 白，且从C末端的附近很好地分解β-酪蛋白)、P111型(从C末端及N末端这两个方向 很好地分解α -酪蛋白及β -酪蛋白)及其中间型(P/Pm型)(例如参照Reid，JR.等， Applied and Environmental Microbiology, 1"4 年、第 6O 卷第 3 号、第 8Ol 洲6 页。)。具体而言，作为来源于乳酸乳球菌的PrtP酶，可列举出NCBI (National center for Biotechnology Information)中基因序列登录号为 AY542690、AY542691 等的 PrtP 酶等。某种乳酸菌是否是具有PrtP酶的乳酸菌，可如下进行确认例如利用PCR(Polymerase Chain Reaction)等基因分析技术，调查是否具有编码PrtP酶的PrtP基
因。
由于PrtP酶在细胞外具有酶活性部位，因此能够分解培养基中的蛋白质。例如 乳酸菌在乳类培养基中增殖时，PrtP酶分解乳类培养基中的乳蛋白质，提供乳酸菌的生 长所需要的寡肽、氨基酸。因此，具有PrtP酶的乳酸乳球菌具有增殖快、发酵性强的特 征，在10% (W/W)还原脱脂奶粉培养基中在25 30°C的温度范围内培养16小时时， 即能够使培养基凝固。利用这种增殖性、发酵性高的特征，能够检测具有PrtP酶的乳酸 乳球菌。此外，通过检测PrtP酶活性，也能够检测具有PrtP酶的乳酸乳球菌。本发明中使用的乳酸乳球菌只要具有PrtP酶，则没有特别限定，优选为乳酸乳 球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种等。这是由于，在发酵乳等以双歧杆菌作为原料 的乳制品中，它们一直以来作为原料而被使用，因此认为安全性高。作为具有PrtP酶 的乳酸乳球菌，例如有乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种 JCM20101菌株等。以下，对本发明中使用的具有PrtP酶的乳酸乳球菌及双歧杆菌增殖促进作用进 行更详细的说明。1.乳酸乳球菌的菌株是否具有PrtP酶的检测对乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC 100676T(ATCC 19257t)菌株、乳酸乳球菌乳脂亚 种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007(NCD0 497)菌株、乳酸乳球菌乳 酸亚种JCM20101菌株、及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株是否具有PrtP酶进行确 认。具体而言，在添加有0.5%乳糖及葡萄糖的Difco(注册商标)M17Broth(Becton， Dickinson公司制造)中接种各菌株3%，在30°C下培养16小时。通过离心分离 得到菌体，使用DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasy Blood and Tissue kit) (QIAGEN 公司制造)提取DNA，通过PCR法确认是否存在PrtP基因。PCR根据参考文 献(Journal of Appieid Microbiology、2006 年、第 100 卷、第 1307 1317 页。) 中记载的方法进行。引物使用正向引物GBf(GCAAATACGGTGACGGCTGCGA) 及反向引物 GB2r(TGAGCATTATAATAGGTCTTCTTCC)的弓I 物对、 或正向引物GHf(CAAATACGGTGACGGCTGCTAA)及反向引物 GH2r (TAGCATTATAATAGGTCTTCGTCA)的弓 | 物对。图1是表示通过电泳法分离PCR产物并通过染色检测到的区带图案的图。图1 中，“1”是分子量标准(molecular weight marker)跑出来的条带，“2”是乳酸乳球菌 乳脂亚种NBRC100676T菌株的PCR产物跑出来的条带，“3”是乳酸乳球菌乳酸亚种 JCM20101菌株的PCR产物跑出来的条带，“4”是乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007菌 株的PCR产物跑出来的条带，“5”是乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株的PCR产物跑 出来的条带，“6”是乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株的PCR产物跑出来的条带。 该结果确认乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌 株中存在PrtP基因。另一方面，确认乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌 乳酸亚种NBRC12007菌株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株各菌株中不存在PrtP基 因。
2.乳酸乳球菌在乳类培养基中的发酵性试验首先，在添加有0.5%乳糖及葡萄糖的Difco(注册商标)M17Broth(Becton，
Dickinson公司制造)中接种各菌株3%，在30°C下培养16小时。通过离心分离收集菌体，洗涤后，悬浮于与原先的培养液等量的下述组成的乳类培养基中，得到种子培养物 (seed culture)。接着，将含有(W/W)葡萄糖、10% (W/W)还原脱脂奶粉的乳类培养基在 95°C下杀菌30分钟，接种前述各菌株的种子培养物3%，在30°C下培养16小时。将所 得培养液骤冷，测定凝固状况、pH及所含的乳酸菌数。乳酸菌数的测定通过市售的加有 BCP的平板计数琼脂培养基(荣研器材公司制造)平板来进行。测定结果示于表1中。具有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种NBRC100676T菌 株及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20101菌株中，pH降低至5.0以下，培养基凝固。另外， 所含的乳酸菌数也为3X 108CFU/g以上，获知增殖性和发酵性非常良好。相对地，不具 有PrtP酶基因的乳酸乳球菌乳脂亚种ATCC-9625菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种NBRC12007 菌株、及乳酸乳球菌乳酸亚种JCM20128菌株的各菌株中，pH为5.5以上，培养基没有 凝固，乳酸菌数为IXlO8CFlVg以下。[表1]
权利要求
1.一种发酵乳的制造方法，其特征在于，使用具有细胞壁局部存在性蛋白酶 (cell wal卜enveloped proteinase, PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、禾口双歧杆菌 (Bifidobacterium)属菌使发酵底物发酵。
2.根据权利要求1所述的发酵乳的制造方法，所述双歧杆菌属菌为长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)。
3.根据权利要求2或3所述的发酵乳的制造方法，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌 ATCC BAA-999菌株和/或长双歧杆菌模式菌株ATCC15700菌株。
4.通过权利要求1 3中任一项所述的发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳。
全文摘要
提供一种发酵乳的制造方法、及通过所述制造方法制造得到的发酵乳，其使用了能够改善双歧杆菌的增殖性的乳酸菌。一种发酵乳的制造方法、及通过所述发酵乳的制造方法制造得到的发酵乳，其特征在于，使用具有细胞壁局部存在性蛋白酶(cell wall-enveloped proteinase，PrtP)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和双歧杆菌(Bifidobacterium)属菌使发酵底物发酵。
文档编号A23C9/127GK102014644SQ20098010154
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月17日 优先权日2008年6月11日
发明者清水金忠, 米泽寿美子 申请人:森永乳业株式会社