基于杆状病毒的疫苗的制作方法

专利名称：：基于杆状病毒的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组(嵌合)杆状病毒及包含该病毒的疫苗组合物。
背景技术：
：以HPV(Humanpapillomavirus)为主要发生原因的宫颈癌在全世界女性的癌症中占12%的比率，也是在世界范围内有二分之一的死亡发生频度且死亡率高的疾病(Vaccine24:5235-5244(2006))。HPV至今为止分离了约100余种，且其中归类为高危险(highrisk)的16型HPV和18型HPV有70%以上在宫颈癌组织中被发现(Vaccine223004-3007(2004))。可以说，为了控制宫颈癌，对HPV感染有效的疫苗的研发正在兴起，特别可认为预防宫颈癌的预防性疫苗的开发非常重要。HPVLl蛋白质作为病毒样颗粒(viruslikeparticles:VLP)具有自装配的固有特征，其不携带病毒的遗传物而只形成外壳。以往的报告(JournalofVirology81(24)13927-13931(2007)；Virology321:205-216(2004)JournalofMedicalVirology80:841-846(2008))记载注射这样的VLP的情况下会发生针对其的充分的免疫应答，结果能诱导高效价中和抗体。为了基因的有效的体内转入，利用多种病毒载体的转基因系统正在被研发。利用了反转录病毒和腺病毒等的病毒载体正在以基因治疗为目的，为将HPV16L1基因转入动物宿主而被使用(Science260(5110):926_932(1993))。但是，这些病毒的使用存在下列问题产生复制依赖性病毒、细胞毒性、初级免疫应答及不需要的病毒基因的表达等。另一方面，杆状病毒转移载体具有以下重要的优点，即能够插入较大尺寸的外源基因；因为使用作为高等真核细胞的昆虫细胞而发生翻译后加工(post-translationalprocessing)过程，与从原核生物大肠杆菌生成的蛋白质不同，表达出的重组蛋白质的生物学和免疫学活性与原来的蛋白质显现相同效果。另外，因为杆状病毒在动物细胞内不能复制且不发生细胞毒性，所以已知是从生物学安全的病毒(Virology125:107-117(1983)；Hum.GeneTher.71937-1945(1996)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA96127-132(1999)；TrendsBiotechnol.20173-180(2002))。已知属于昆虫病毒集团的AcNPV(苜蓿银纹夜多角，Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)种动物细胞中不可复制，但能够进入细胞内从而转入基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:10099-10103(1995)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:2348-2352(1996))。先前已被报告AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒，Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus)基因组内的特定基因可被动物启动子调节从而使特定基因能在动物细胞内高水平表达(JournalofVirology,76(11):5729_5736(2002)；Vaccine26(20)2451-2456(2008))。最近，在杆状病毒的表面导入其它病毒Env来提高基因转移效率的多个研究正在尝试进行。已有报告例如使VSV(水泡性口炎病毒，vesicularstomatitisvirus)包膜G蛋白存在于杆状病毒表面(JournalofVirology,78(16)=8663-8672(2004)；JournalofUrology250(2)276-283(2006)；BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications289(2)444-450(2001)；JournalofVirology75(6)2544-2556(2001))；或将gp64蛋白质再添加于病毒表面来提高基因转移效果(HumanGeneTherapy,14(1):67_77(2003))。另有报告免疫接种杆状病毒载体来诱导对流感病毒的血凝素糖蛋白(hemagglutininglycoprotein)的免疫应答(JournalofImmunology,1711133-1139(2003))。贯穿本说明，多数论文和专利文献被参考并对其引用进行了标示。被引用的论文和专利文献的公开内容通过引用整体并入本说明书本，使本发明所属的
技术领域：
的水平和本发明的内容更明确地被描述。
发明内容技术课题本发明人致力于开发基于杆状病毒的、能够诱导对多种病原体更提高的免疫应答的疫苗。结果，本发明人将编码抗原基因和病毒外源包膜蛋白的核苷酸序列组合起来，制备了表达构建物及重组杆状病毒，并在利用其进行免疫时，确认不仅免疫应答大大提高，还能提供安全经济的疫苗，从而使本发明得以完成。因此，本发明的目的是提供重组杆状病毒。本发明的另一目的是提供疫苗组合物。本发明的另一目的是提供诱导针对特定抗原的免疫应答的方法。本发明的又一目的是提供编码人内源性反转录病毒(humanendogenousretrovirus；HERV)的包膜蛋白的核酸分子。本发明的另一目的是提供含编码HERV包膜蛋白的核酸分子的重组载体。本发明的又一目的是提供基于杆状病毒的基因转移体，该杆状病毒含编码HERV包膜蛋白的核酸分子。本发明的其他目的及优点将以下文的发明详述、权利要求和图而更加明确。解决课题的技术方案根据本发明的一个实施方式，本发明提供的重组杆状病毒，包含(a)编码病毒的外源包膜蛋白的核苷酸序列；(b)与上述包膜_编码序列运作性连接的第1启动子；(c)编码抗原蛋白质的核苷酸序列；及(d)运作性连接于所述抗原-编码序列的第2启动子。根据本发明的另一实施方式，本发明提供了包含上述本发明的重组杆状病毒作为有效成分的疫苗组合物。根据本发明的又一实施方式，本发明提供了在活体内诱导针对特定抗原的免疫应答的方法，包括将上述本发明的疫苗组合物施用于受试者的步骤。本发明人致力于开发基于杆状病毒的、能够诱导针对多种病原体的更提高的免疫应答的疫苗。其结果，本发明人将编码抗原基因和病毒外源包膜蛋白的核苷酸序列组合起来，制备了表达构建物及重组杆状病毒，并且在利用其进行免疫时，确认不仅免疫应答大大提高，还能提供安全经济的疫苗。本发明的最大特征是利用编码抗原基因的核苷酸序列和编码病毒(最优选人内源性反转录病毒(HERV))外源包膜蛋白的核苷酸序列的组合。本发明的重组杆状病毒可被使用于携带多种抗原基因。本说明书中的用语“抗原基因”又或“编码抗原蛋白质的核苷酸序列”，指的是编码可被免疫系统识别的抗原性蛋白质(例如，细胞或病毒表面抗原性蛋白质)的序列。根据本发明的优选实施例，上述抗原包含病毒病原体抗原、细菌病原体抗原、寄生虫(parasitic)抗原或癌抗原，且更优选病毒病原体抗原或癌抗原，以及最优选病毒病原体抗原。能用于本发明的病毒病原体抗原的例子包含源于下列的抗原正粘液病毒(Orthomyxovirus)(如流感病毒)；反转录病毒(如RSV(呼吸道合胞体病毒，respiratorysyncytialvirus)、SIV(猿猴免疫缺陷病毒，simianimmunodeficiencyvirus)禾口HIV)；疱疹病毒(如EBV(EB病毒，Epstein-BarrVirus))；CMV(巨细胞病毒，cytomegalovirus)或HSV(单纯疱疹病毒，herpessimplexvirus)；慢病毒(Lentivirus)；弹状病毒(如狂犬病(rabies))；picomoviruses(如脊髓灰质炎病毒)；痘病毒(Poxvirus)(如痘苗病毒)；轮状病毒(Rotavirus)；和细小病毒(Parvovirus)。更具体来说，病毒病原体抗原的例子为HPV抗原的例子包括HPV的L1、L2、E6或E7蛋白质；HIV抗原的例子包括nef、p24、gpl20、gp41、tat、rev、pol、env及gpl20的T细胞和B细胞表位(Palkeretal.，J.Immunol.，1423612-3619(1989))。HBV表面抗原的例子公开于Wuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，864726-4730(1989)。轮状病毒抗原的例子包括VP4(Mackowetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,87518-522(1990))和VP7(Greenetal.，J.Virol.,621819-1823(1988))；流感病毒抗原包括血凝素(hemagglutinin:HA)和核蛋白质；HSV抗原包括胸苷激酶(Whitleyetal.，In:NewGenerationVaccines,pages825-854)；-MU乱病毒抗原包括包膜蛋白；口蹄疫病毒抗原包括包膜蛋白；新城疫病毒抗原包括HN(血凝素-神经氨酸酶，hemagglutinin-neuraminidase)或F(融合蛋白，fusionprotein)。能用于本发明的细菌病原体抗原的例子包括源于下列的抗原分支杆菌属(Mycobacteriumspp.)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、沙门菌属(Salmonellaspp·)、志贺菌属(Shigellaspp.)、大肠杆菌(Ε·coli)、立克次体属(Rickettsiaspp·)、李其i特菌属(Listeriaspp.)、月市炎军团菌(Legionellapneumoniae)、假单胞菌属(Pseudomonasspp·)、弧菌属(Vibriospp.)禾口Borelliaburgdorferi。具体来说，能用于本发明的细菌病原体抗原的例子包括宋氏志贺菌(Shigellasonnei)的1型抗原(Formaletal.，Infect.Immun.,34746-750(1981))；霍舌L弧菌(V.cholerae)的0抗原(Forrestetal.，J.Infect.Dis.159:145_146(1989))；大肠杆菌(E.coli)的FA/I菌毛抗原(Yamamotoetal.，Infect.Immun.,50:925_928(1985))禾口热敏毒素的非毒性B-亚基(Klipsteinetal.，Infect.Immun.,40888-893(1983))；百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)WHH^ff^feΡS(pertactin)(Robertsetal.，Vacc.,1043-48(1992))；百日咳博德特菌(B.pertussis)的腺苷酸环化酶-溶血素(Guisoetal.，Micro.Path.,11:423_431(1991))；和破伤风梭菌(Clostridiumtetani)的破伤风毒素片段C(Fairweatheretal.，Infect.Immun.,581323—1326(1990))。能用于本发明的寄生虫抗原的例子包括源于下列的抗原疟原虫属(Plasmodiumspp.)、锥虫属(Trypanosomespp.)、贾第虫属(Giardiaspp.)、牛蝶属(Boophilusspp.)>EJH^M(Babesiaspp.)>H^EM(Entamoebaspp.)>jt^it^M(Eimeriaspp.)、利什曼原虫属(Laishmaniaspp.)、血吸虫属(Schistosomespp.)、布鲁丝虫属(Brugiaspp.)、Fascida属(Fascidaspp.)、恶丝虫属(Dirofilariaspp·)、吴策线虫属(Wuchereriaspp.)和盘尾丝虫属(Onchocereaspp.)。具体来说，能用于本发明的寄生虫抗原的例子包括疟原虫属的环子孢子抗原例如(Plasmodiumbergerii)的环子孢子抗原和恶性疟原虫(P.falciparum)的环子孢子抗原(Sadoffetal.，Sci.,240336-337(1988))；疟原虫属的裂殖子表面抗原(Spetzleretal.,Int.J.Pept.Prot.Res.,43:351-358(1994))；溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)的半乳糖-特异性凝集素(Mannetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,88:3248_3252(1991))；利什曼原虫属的gp63(Russelletal.，J.Immunol.，140:1274_1278(1988))；马来丝虫(Brugiamalayi)的副肌球蛋白(Lietal.，Mol.Biochem.Parasitol.，49:315-323(1991))；和曼森血吸^(Schistosomamansoni)白勺ΜΙΙ舞胃丰勾_(Shoemakeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,891842-1846(1992))ο能用于本发明的癌抗原的例子包括前列腺特异性抗原(Gattusoetal.，HumanPathol.,26123—126(1995))、TAG—72禾口CEA(癌胚抗原，carcinoembryonicantigen)(Guadagnietal.，Int.J.Biol.Markers，9:53_60(1994))、MAGE_1和酪氨酸酶(Coulieetal.，J.Immunothera.,14:104_109(1993))、p53(WO94/02167)、NY-ES01(癌-睾丸抗原，cancer-testisantigen)、AFP(α-月台蛋白，α-fetoprotein)禾口癌抗原125(CA—125)、或EPCA(早期前列腺癌抗原，EarlyProstateCancerAntigen)。根据更优选的实施例，用于本发明的抗原是病毒病原体抗原或癌抗原，且最优选是病毒病原体抗原。本发明中使用的抗原基因是病毒病原体抗原时，上述抗原优选为HPV(人乳头瘤病毒，humanpapillomavirus)抗原、HBV(乙型肝炎病毒，h印atitisBvirus)抗原、HCV(丙M月hepatitisCvirus)㈱帛、HIV(入;^贞^:Pg__，humanimmunodeficiencyvirus)抗原、轮状病毒抗原、流感病毒抗原、HSV(单纯疱疹病毒，herpessimplexvirus)抗原、禽流感病毒抗原、猪霍乱病毒抗原、口蹄疫病毒抗原或新城疫病毒抗原。上述抗原更优选为HPV，且又更优选HPV的Li、L2、E6或E7蛋白，最优选HPV的Li。HPVLl在体内或体外作为病毒样颗粒(viruslikeparticles,VLP)具有自装配的固有特征。Ll蛋白是在HPV蛋白质中是最为保守的蛋白质。根据本发明的优选实施例，本发明中使用的Ll序列源于选自下列的HPV:l、2、3a、4、5、6b、7、8、9、10、lla、12、13、58、16和18型的HPV，且更优选源于源于16型或18型的HPV的HPV。编码Ll蛋白质的核苷酸序列例如记载于GenBank登录号EUl18173(J.Virol.67(12):6929_6936(1993))、AY383628和AY383629(Virology321(2):205_216(2004))。本发明中使用的编码病毒外源包膜蛋白的核苷酸序列可来源于杆状病毒之外的多种病毒。包膜蛋白优选来源于以人细胞为宿主细胞的病毒，且更优选来源于人细胞表面存在相应受体的病毒，且最优选可诱导人细胞的受体介导的吞噬作用的病毒。根据本发明的优选实施例，本发明中使用的编码病毒包膜蛋白的核苷酸序列为，其中的包膜来源于甲病毒、副粘液病毒、弹状病毒、粘液病毒、冠状病毒、反转录病毒、纤丝病毒或沙粒病毒，而更优选来源于反转录病毒，最优选来源于人内源性反转录病毒(HERV)。HERV作为人体内实际存在的内源性病毒，大部分以无活性状态存在于人基因组中。包膜蛋白表达于重组病毒表面，其与人体细胞的受体相互作用而诱导吞噬作用。根据本发明的优选实施例，编码HERV包膜的序列是编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列，而更优选SEQIDNO:1的核苷酸序列。SEQIDNO:1的核苷酸序列经优化，以使HERV表面蛋白质(Env)在昆虫细胞中的表达佳。本发明的嵌合病毒基于杆状病毒。杆状病毒作为杆状的病毒在人细胞内无法由昆虫特异性启动子表达自身基因。因为这种原因，由于杆状病毒不诱发基于病毒基因表达的免疫应答，所以作为基因治疗剂的基本系统而正在受到关注。但是，杆状病毒载体内的外源基因在哺乳动物启动子控制之下会以高水平的表达。杆状病毒引发的感染也有不触发内源性人病毒复制的优点。不同于其它用作基因治疗剂的病毒，杆状病毒可在无血清培养基中很好地生长，具有适合大量生产的优点。重组杆状病毒的构建和昆虫细胞的培养在SummersandSmith.1986.AManualofMethodsforBaculovirusVectorsandInsectCultureProcedures,TexasAgriculturalExperimentalStationBull.No.7555,CollegeStation,Tex.；Luckow.1991.InProkopetal.,CloningandExpressionofHeterologousGenesinInsectCellswithBaculovirusVectors'RecombinantDNATechnologyandApplications,97-152;U.S.Pat.No.4，745，051；和EP0340359中有详细的记载，且上述文献通过引用并入本说明书中。举例来说，包含HERVEnv基因和HPVLl基因的嵌合杆状病毒将携带HERVEnv基因和HPVLl基因的转移载体转化到细胞。包含HERVEnv基因和HPVLl基因的表达构建物侧翼是转座子序列(例如Tn7)。用所述转移载体转化包含具有小型-attTn7靶位点的杆粒(杆状病毒穿梭载体)和具有转座酶基因的辅助质粒的细胞(如大肠杆菌)。转移载体一旦转化上述大肠杆菌细胞，就会发生转座，从而生成重组杆粒。接着，分离重组杆粒，并用其转化合适的昆虫细胞，从而产生嵌合杆状病毒。适合于本发明的昆虫细胞并无特别限制，例如，Sf9(草地贪夜蛾，Spodopterafrugiperda)、Spodopteraexiaua、云杉卷夜蛾(Choristoneurafumiferana)、甘兰尺虫蒦(Trichoplusiani)禾口海灰翅夜娥(Spodopteralittoralis)及果蝇等可被作为昆虫细胞使用。在本发明的重组杆状病毒中编码病毒包膜蛋白的核苷酸序列和编码HPVLl的核苷酸序列优选存在于适合的表达构建物中。上述的表达构建中，编码包膜蛋白的核苷酸序列和编码HPVLl的核苷酸序列优选与启动子运作性连接。本说明书中，用语“运作性连接”指的是核酸表达调控序列(例如启动子、信号序列或转录调控因子结合位点的排列)与其它核酸序列间的功能性结合，并且由此上述调控序列能够调控上述其它核酸序列的转录和/或翻译。本发明中与编码包膜蛋白的核苷酸序列或编码HPVLl的核苷酸序列连接的启动子可使用多种启动子。根据本发明的优选实施例，与上述包膜-编码序列运作性连接的第1启动子是在昆虫细胞中运作的启动子，且更优选杆状病毒IE-I启动子、IE-2启动子、p35启动子、plO启动子、gp64启动子或多角体蛋白启动子，且最优选多角体蛋白启动子。根据本发明的优选实施例，与HPVLl-编码序列运作性连接的第2启动子是来源于哺乳动物细胞基因组的启动子或来源于哺乳动物病毒的启动子，而第2启动子更优选为U6启动子、Hl启动子、CMV(巨细胞病毒，cytomegalovirus)启动子、腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSVtk启动子、RSV启动子、人延伸因子1α(hEFlα)启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL_2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、人GM-CSF基因启动子、TERT启动子、PSA启动子、PSMA启动子、CEA启动子、E2F启动子、AFP启动子或白蛋白启动子，而最优选的是人延伸因子1α(hEFlα)启动子。本发明中使用的表达构建物优选含多聚腺苷酸化序列。包括例如人延伸因子1α(hEFlα)多聚Α、牛性状激素终止子(Gimmi，Ε.R.，etal.，NucleicAcidsRes.176983-6998(1989))、源于SV40的多聚腺苷酸化序列(Schek，N，etal.,Mol.CellBiol.125386-5393(1992))、HIV-I多聚A(Klasens，B.I.F.，etal.，NucleicAcidsRes.261870-1876(1998))、β-珠蛋白多聚A(Gil，Α.，etal.，Cell49:399_406(1987))、HSVTK多聚A(Cole，C.N.andΤ.P.Stacy,Mol.Cell.Biol.5:2104_2113(1985))、或多瘤病毒多聚A(Batt,D.BandG.G.Carmichael,Mol.Cell.Biol.15:4783_4790(1995))，但不限于此。本发明的重组病毒中包膜-编码序列和HPVLl-编码序列可各自被包含为第1启动子_包膜_编码序列-多聚A序列和第2启动子-HPVLl-编码序列-多聚A序列形式的表达构建物。另外，也可以第1启动子_包膜-编码序列-第2启动子-HPVLl-编码序列-多聚A的形式被包含。根据本发明的优选实施例，本发明的重组病毒附加含有待表达的目的基因。对由本发明的重组病毒表达的目的基因无特别限定。本发明中的目的基因包括如作为诱导癌细胞的杀灭及最终减退肿瘤的癌症治疗基因的肿瘤抑制基因、免疫调节基因(如细胞因子基因，趋化因子基因和共刺激因子(costimulatoryfactor:T细胞活性必需的辅助分子例如Β7.1和Β7.2))、自杀基因、细胞毒素基因、细胞增殖抑制基因、原-细胞凋亡基因和抗_新生血管生成基因，但不仅限定于此。自杀基因是表达诱导细胞易于被外源因子杀伤的物质或诱发对细胞的毒性条件的核酸序列。作为所述自杀基因熟知的是腺苷激酶(TK)基因(美国专利第5，631，236号和第5，601，818号)。表达TK基因产物的细胞可由丙氧鸟苷(gancyclovir)施用而对选择性杀灭敏感。肿瘤抑制基因指编码抑制肿瘤形成的多肽的基因。肿瘤抑制基因是在哺乳动物中自然发生的基因，且该基因的缺失或失活被认为是肿瘤发生的先决条件。肿瘤抑制基因包括例如肿瘤抑制基因INK4系列之一，所述肿瘤抑制基因INK4系列包括APC、DPC4、NF-1、NF-2、MTSl、WTl、BRCAl、BRCA2、VHL,p53、Rb、MMAC-UMMSC-2、视网膜母细胞瘤基因(Leeetal.，Nature，329:642(1987))、腺瘤结肠息肉蛋白基因(adenomatouspolyposiscoliprotein；美国专利第5，783，666号)、位于染色体3ρ21·3的鼻咽喉肿瘤抑制基因(Chengetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,95:3042_3047(1998))、缺失的结肠肿瘤(DCC)基因、MTS1、CDK4、VHL、piIORb,pl6和p21，以及其治疗学有效的片段(例如，p56Rb、p94Rb等)。本领域技术人员明了除上述例示的基因外、本发明还可以使用其它所有已知的抗肿瘤基因。本说明书中的用语“细胞毒性基因(cytotoxicgene)”指的是在细胞内表达而显现毒性效果的核苷酸序列。这样的细胞毒性基因包含例如编码假单孢菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素等的核苷酸序列。本发明中的用语“细胞增殖抑制基因(cytostaticgene)”指的是能在细胞内表达并在细胞周期中使细胞周期停止的核苷酸序列。这样的细胞增殖抑制基因包括例如P21、视网膜母细胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的基因(如Pl6、pl5、pl8和pl9)、生长终止特异性同源异型框(growtharrestspecifichomeobox，GAX)基因(WO97/16459和WO96/30385)等，但不仅限定于此。另外，有用于治疗各种疾患的很多治疗基因也可由本发明系统携带。例如，包括编码细胞因子(如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-δ和干扰素-Y)、白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-19和IL-20)和集落刺激因子(如GM-CSF和G-CSF)的基因，还包括趋化因子基团(单核细胞趋化蛋白1(MCP-I)、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、单核细胞趋化蛋白4(MCP-4)、巨噬细胞炎性蛋白Ια(MIP-la)、巨噬细胞炎性蛋白1β(ΜΙΡ-1β)、巨噬细胞炎性蛋白1γ(ΜΙΡ-1Y)、巨噬细胞炎性蛋白3α(ΜΙΡ_3α)、巨噬细胞炎性蛋白3β(ΜΙΡ_3β)、趋化因子(ELC)、巨噬细胞炎性蛋白4(ΜΙΡ-4)、巨噬细胞炎性蛋白5(ΜΙΡ-5)、LD78β、RANTES,SIS-ε(ρ500)、胸腺活化调节的趋化因子(TARC)、嗜酸细胞活化趋化因子、1-309、人蛋白质HCC-1/NCC-2、人蛋白质HCC-3和小鼠蛋白质ClO等)。另外，还包括表达组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶的基因和提供持续性溶栓效果从而预防高胆固醇血症的LAL-生成基因。还已知有用于治疗病毒性、恶性、炎症性疾患或状态疾患(如囊性纤维化、腺苷脱氨酶缺乏症及AIDS)的很多多核苷酸序列。本说明书中的用语“原-细胞凋亡基因(pro-apoptoticgene)”指表达出而诱导程序性细胞凋亡的核苷酸序列。此种原_细胞凋亡基因的例子包括P53、腺病毒E3-11.6K(来源于Ad2和Ad5)或腺病毒E3-10.5K(来源于Ad)、腺病毒E4基因、Fas配体、TNF-α、TRAIL、p53通路基因和编码半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的基因。本发明的说明书中的用语“抗-新生血管生成基因(anti-angiogenicgene)”是指表达出而将抗_新生血管生成因子排出细胞外的核苷酸序列。抗_新生血管生成因子包括血管生成抑制因子、血管内皮生长因子(VEGF)的抑制因子(例如Tie2(PNAS，1998，95，8795-800))、内皮抑素等。上述目的基因的核苷酸序列可从DNA序列数据库如GenBank或EMBL获取。由本发明的重组病毒表面的包膜蛋白质可诱导人细胞中受体介导的吞噬作用，并且随着抗原蛋白质的表达在被注入的活体内诱发针对抗原蛋白质的免疫应答。更重要的是，本发明的重组杆状病毒不仅诱发体液免疫，还能非常好地诱发细胞免疫应答。结果，本发明的重组杆状病毒根据这种作用可以很好地发挥对多样疾患的预防效果。如下述实施例中论证的，与以往作为HPV疫苗的Gardasil相比，本发明的重组杆状病毒对HPV的体液免疫的诱导效能不仅与Gardasil基本一致，还具有Gardasil不具备的对HPV的细胞免疫的诱导效能，可发挥比Gardasil更优秀的HPV疫苗效能。本发明的疫苗组合物包括(a)药剂学有效量的上述重组杆状病毒；和(b)药剂学允许的载质(carrier)。本发明的疫苗组合物包含的重组杆状病毒可对多种抗原显现免疫诱导效能。根据本发明的优选实施例，本发明的疫苗组合物中重组杆状病毒包含HPV抗原基因，且上述疫苗组合物是特征在于是HPV疫苗组合物的疫苗组合物。本发明的HPV疫苗组合物可用于预防或治疗、优选预防由HPV感染诱发的多种疾患，优选宫颈癌、直肠癌、外阴癌、阴茎癌或头颈部癌。本发明最优选用于预防或治疗、优选预防宫颈癌。本说明书中的用语“药剂学有效量”是指达成预防或治疗、优选预防上述疾患效果所需的充分量。本发明的疫苗包含的药剂学允许的载质是制剂时通常被使用的，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钾、藻酸盐、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油等，但不限定于此。本发明的药剂学组合物除上述成分外还可追加包括润滑齐、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浊剂、防腐剂等。本发明的疫苗优选非经口施用，可利用例如静脉内施用、腹腔内施用、肌肉内施用、皮下施用或局部施用来施用。本发明的疫苗合适的施用量基于例如制剂化方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、疾病症状程度、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应敏感性等因素是多样的，并且一般熟练的医生能够根据目的疗效容易地决定施用剂量并给出处方。本发明的疫苗优选包含1XIO31XIO15Pfu/ml的重组病毒。本发明的疫苗可根据本发明所属
技术领域：
的普通技术人员容易实施的方法，用药剂学允许的载质和/或赋形剂制剂而成，故可制作成单位用量的形式或纳入多容量容器中进行制备。此时的剂型可以是油剂或水性介质中的溶液、悬浊液或乳化液形式，或者也可以是酏剂、粉末剂、颗粒剂、锭剂、胶囊剂的形式，也可进一步包含分散剂或稳定剂。根据本发明的另一实施方式，本发明提供重组杆状病毒，所述重组杆状病毒包含(a)编码病毒的外源包膜蛋白的核苷酸序列；(b)运作性连接于上述包膜-编码序列的第1启动子；(c)编码HPV(人乳头瘤病毒，humanpapillomavirus)的Ll的核苷酸序列；(d)运作性连接于上述Ll-编码序列的第2启动子。因为本发明的重组杆状病毒与上述疫苗所包含的重组杆状病毒一致，为避免本说明书的过于复杂，省略了关于两者共同内容的记载。根据本发明的另一实施方式，本发明提供的核酸分子，所述核酸分子编码人内源性反转录病毒(HumanEndogenousRetrovirus=HERV)的包膜蛋白，且包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。本发明人致力于构建了基于杆状病毒的更有效的基因转移系统。其结果，发明人将存在于待携带基因的目的细胞中且对该细胞不具毒性的内源性反转录病毒的表面蛋白导入基因转移系统，确认在该情况下可以大大提高该基因转移系统的转移有效性。为了开发改进的基因转移系统，本发明人首先使编码待导入基因转移系统的HERV的包膜蛋白的核酸分子变形，使其在杆状病毒的宿主细胞昆虫细胞的表达达到最佳。本发明中导入基因转移体的包膜基因来源于HERV。HERV插入在人体基因组中，但因为不具有整体的完备的基因而不被表达。本发明为使HERV的非表达基因在昆虫细胞中得以高水平表达，使天然(natural-occurring)的HERV包膜基因发生变形。本发明中的用语核酸分子优选指DNA分子。本发明中的HERV包膜-编码核酸分子解释为包含与序列表中记载的序列表现出实质上的一致性(substantialidentity)的序列。上述实质上的一致性，是指使上述11本发明的序列和任意其它序列以最大对应的方式比对，利用在本领域中通常使用的算法分析比对的序列时，表现出优选至少80%同一性的序列，更优选至少85%同一性的序列，又更优选至少90%同一性的序列，最优选至少95%同一性的序列。用于序列比较的比对方法由本领域公知。多种比对方法和算法记载于SmithandWaterman,Adv.App1.Math.2482(1981)；Needlemanandffunsch,J.Mol.Bio.48443(1970)；PearsonandLipman,MethodsinMol.Biol.24:307_31(1988)；HigginsandSharp,Gene73:237-44(1988);HigginsandSharp,CABIOS5151-3(1989)；Corpetetal.,Nuc.AcidsRes.1610881-90(1988)；Huangetal.，Comp.Appl.BioSci.8:155_65(1992)；禾口Pearsonetal.，Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403_10(1990))可访问NCBI(美国生物信息学中心，NationalCenterforBiologicalInformation)等,且可与网络上的序列分析程序(例如blastp、blasm、blastx、tblastn禾口tblastx)结合使用。BLAST可登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。利用该程序比较序列同一性的方法可从http//www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blasthelp,html中得到确认。根据本发明的另一实施方式，本发明提供了重组载体，其包含编码HERV包膜蛋白的上述核酸分子。本发明的载体因为包含上述HERV包膜-编码序列，为了避免使本说明书过于复杂，省略了关于其两者共同内容的记载。本发明的载体系统可通过上述多种在本领域公知的方法来构建，且其具体方法记载于Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)，且该文献通过引用并入本说明书。另一方面，本发明的载体是表达载体，在以真核细胞为宿主的情况下，可使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子、来源于哺乳动物病毒的启动子或来源于杆状病毒的启动子(例如，多角体蛋白启动子)，且作为转录终止序列，一般持有多聚腺苷酸化序列。作为本发明的载体的筛选标记物，包括本领域通常使用的抗生素抗性基因，有针对例如氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的抗性基因。根据本发明的优选实施例，本发明载体具有附图11的基因图谱。即，图11的载体如下HERV包膜基因的表达由多角体蛋白启动子调控；目的基因(优选HPV的16L1基因)的表达由hEFla启动子调控；作为终止信号具有hEFlα多聚A信号；以及转座子7的两臂位于表达盒的两侧。根据本发明的另一实施方式，本发明提供基于杆状病毒的基因载体(genecarrier)，其包含编码HERV包膜蛋白的上述核酸分子。本发明的基因载体来源于用上述重组载体感染昆虫细胞得到的病毒，故为了避免本说明书的过度复杂，将对上述重组载体相同内容的记载予以省略。最近用作基因转移系统的，主要是利用病毒的方法。使用病毒的基因转移系统使用腺病毒、反转录病毒、慢病毒及痘苗病毒等多种病毒。多数这类病毒因是为会对人引起新的感染或发生危险的病毒，使其人体使用受到限制，但杆状病毒因为无感染人体的能力，而只能在特异的昆虫中发生复制而被已知为是生物学上安全的病毒。以病毒的媒介的基因转移系统是通过病毒感染而发生的，而所述的感染决定于病毒表面蛋白与目的细胞及动物的受体之间的相互作用。本发明着眼于杆状病毒的这种优点将待作用于杆状病毒表面的动物体内存在的内源性病毒表面的蛋白质重组并使其插入，从而提供更提高的基因转移系统。已知内源性病毒普遍分布于以人为首的猪、鼠、猫及狗等为首的全部哺乳类为首。对本发明的基因载体来说，因为人的内源性反转录病毒的包膜蛋白结合在其表面，可将欲转入人细胞内的基因高效率地、安全地携带。因此，本发明的基因载体可以有益地利用于针对多种疾患和疾病的基因治疗剂的开发上。发明的有益效果本发明的特征和优点可归纳如下(a)本发明的疫苗包含重组杆状病毒，该重组杆状病毒包含编码抗原基因与病毒外源包膜蛋白的核苷酸序列。(b)本发明的重组杆状病毒基于表面的包膜蛋白可诱导人细胞受体介导的吞噬作用，由表达的抗原蛋白质(如HPVLi)诱发被注入的活体内的免疫应答。(c)再者，本发明的重组杆状病毒不仅可诱发体液免疫应答，还可很好地诱发细胞免疫应答。(d)结果，根据这种作用，本发明的重组病毒可以很好地发挥对被特定抗原诱导的多种疾患(如宫颈癌)的预防效果。(e)本发明的重组杆状病毒与以往的HPV疫苗Gardasil相比不仅对HPV的体液免疫诱导能力是基本一致的，而且还具有Gardasil所不具备的对HPV的细胞免疫诱导能力，可发挥比Gardasil更优秀的HPV疫苗效能。(f)本发明可提供安全和经济的疫苗。附图简述图1大致表明了本发明中使用的转移载体pAc-hEFlα16L1的制备过程的模式图。图1中，黑色箭头表示多角体蛋白启动子；白色箭头表示hEFlα启动子；小的黑色四角形表示hEFla多聚A信号。图2大致表明了本发明中使用的转移载体pAcHERVenv-hEFla16L1的制备过程的模式图。图Ib中，黑色箭头表示多角体蛋白启动子；白色箭头表示hEFlα启动子；小的黑色四角形表示hEFlα多聚A信号。图3是制备出的包含pAc-hEFla16L1和pAcHERVenv-hEFla16L1的嵌合杆状病毒的转移载体和病毒的预期模式图。图Ic中，黑色箭头表示多角体蛋白启动子；白色箭头表示hEFlα启动子；小的黑色四角形表示hEFlα多聚A信号。图47是比较了本发明中合成的HERV表面蛋白的基因序列和既有HERV表面蛋白的核苷酸序列的同一性的图。匪014590是HERV表面蛋白的基因的GenBank的登录号(accessionno.)。图8是分析被Ac-hEFlα16L1和AcHERVenvhEFlα16L1感染的Huh7细胞中HPV16L1基因的表达程度的RT-PCR结果的照片。“NTC”表示没加模板的对照组。AcHERVenv-hEFlα16L1作为包含猪内源性杆状病毒的包膜蛋白，已确认其基本上不感染Huh7人细胞。图9通过免疫细胞化学方法分析感染Ac-hEFlα16L1和AcHERVenv-hEFlα16L1的Huh7细胞和正常Huh7细胞的HPV16L1表达的照片。AcHERVenv_hEFlα16L1包含猪内源性反转录病毒的包膜蛋白，因此可以确认基本不感染Huh7人细胞。图10是为了定量感染了Ac-hEFlα16L1和AcHERVenvhEFlα16L1的Huh7细胞中HPV16L1mRNA的表达水平而用A-ACT法进行实时PCR定量分析的结果。AcHERVenv-hEFlα16L1包含猪内源性反转录病毒的包膜蛋白，因此可以确认基本不感染Huh7人细胞。图11是本发明的一个实施例中构建的载体基因图。Polh启动子、多角体蛋白启动子；HERVenv、HERV的包膜基因；且，Tn7R和Tn7L各是转座子7的右臂和左臂。AcHERVenv-hEFlα16L1的情况中，HPV的16L1基因位于目的基因的位置。图12显示了经本发明的嵌合杆状病毒免疫的血清中IgG抗体反应的ELISA分析结果。将样品以1100稀释，抗-小鼠IgGWl2，000稀释使用。在各组中从左至右的柱形各对应于1周、3周、5周、9周和14周。图13显示了经本发明中嵌合杆状病毒免疫的阴道洗涤液中IgA抗体反应的测定结果。将样品以150稀释，抗-小鼠IgA以11，000稀释使用。y轴显示在405nm下的吸光度值。在各组中从左侧至右侧各柱形对应于1周、3周、5周、9周和14周。图14显示了由经本发明的嵌合杆状病毒免疫的小鼠抗血清对HPV16PV(假病毒)的中和反应。图15是为测定细胞免疫应答进行的ELISP0T分析结果。对脾脏细胞进行ELISP0T分析探查了IFN-Y表达与否。将⑶8+T细胞用HPV16PV或HPV18PV来刺激。(A)是用Gardasil免疫的实验组，(B)是用AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1免疫的实验组，(C)是对照组。实施方式将通过以下实施例更加详细说明本发明。这些实施例只是为了更具体地描述本发明，本领域普通技术人员了解，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例限制。实施例材料及方法细胞准备将昆虫细胞Sf9(ATCC0^-1711)在271、含有10%85(胎牛血清，€6{31bovineserum,GibcoBRL)和1%青霉素/链霉素(GibcoBRL)的TC-100培养基(Welgene)中培养。293TT细胞(SchillerLab，美国NCI)在补充了10%FBS和潮霉素B(400μg/ml)(InvitrogenCorp.)的DMEM(Dulbecco改良的最小必需培养基，Dulbecco‘smodifiedminimalessentialmedium)中培养。人肝癌细胞系Huh7细胞(JCRB0403)在5%CO2和37°C温度下在含10%FBS(GibcoBRL)和青霉素/链霉素(GibcoBRL)的DMEM培养基中培养。HeLa细胞(ATCC)在含10%FBSU00U青霉素/ml以及100μg链霉素/ml的DMEM培养基中培养。编码HERV表面蛋白的基因的合成HERV(人内源性反转录病毒，humanendogenousretrovirus)作为人体中实际存在的内源性病毒大部分以非活性状态存在于人体的基因组。为获得HERV的表面蛋白质，直接合成了编码HERV表面蛋白的基因，并在合成时使基因的碱基序列最佳化，以适宜在昆虫细胞中表达(GeneScript)。将自主合成的编码HERV表面蛋白的基因插入pUC57载体(GeneScript)的EcoRV位置，从而制备了pUC57_HERVenv。包含转移载体(transfervector)的克隆过程的重组杆状病毒的制备是根据生产商(Invitrogen)的方案利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统实施的。为了利用重组杆状病毒系统在动物细胞中表达HPV16L1蛋白，在AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病_，autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus)本中_人了入延伸因子Ια启动子(hEFlα)和HPV16L1基因。首先，以质粒DNApl6LlL2(SchillerLab,USANCI；ChristopherB.Bucketal.,J.Virol.82(11):5190_5197(2008))为模板PCR扩增了在hEFla启动子后连接HPV16L1基因和hEFla多聚A信号的基因部分。使用的引物序列如下，正义引物5’-GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCA-3’；反义引物5’-TTAATTAACCCACGTTTCAACATG-3’。将PCR扩增产物克隆到PGEM-Teasy载体(Promega)中，然后在pGEM_Teasy/hEFlα16L1中将hEFlα16L1用EcoRI来切断，插入到pFastBacl(Invitrogen)转移载体的EcoRI位点，从而制备了pAc-hEFlα16L1载体(参考图1)。从pUC57_HERVenv用Sail切断，而将HERV表面蛋白基因插入到pFastBacl。用NotI切断pGEM-Teasy/hEFlα16L1后，将hEFlα16L1插入到pFastBacl-HERVenv转移载体中，从而制备了pAcHERVenv-hEFlα16L1载体(参考图lb)。为了确认克隆的转移载体的ORF(开放阅读框，openreadingframe)，利用ABI基因序列分析仪(ABI)分析了基因序列。重组杆状病毒的制备将克隆的重组转移载体各转化DHlOBac(Invitrogen)而制备了重组杆粒(bacmid，杆状病毒穿梭载体)。重组杆粒的鉴别可使用M13引物(Invitrogen)通过PCR来确认。确认过的新种类的杆粒为了制备重组杆状病毒，利用脂质体(Invitrogen)转染Sf9细胞。4天后收集在被感染的细胞中生成的病毒，反复感染新的Sf9细胞，生成高滴度的病毒。并且将被选用的重组病毒各自命名为AcHERVenv-hEFlα16L1和Ac-hEFlα16L1(参考图lc)。最终制备好的重组杆状病毒的滴度在Sf9细胞中使用菌斑试验来确认。同时，携带HPV18L1基因的重组杆状病毒(AcHERVenv-hEFla18L1)除使用了HPV18L1基因(GenBank登录号AY383629)外，使用与针对上述HPV16L1的重组杆状病毒(AcHERVenv-hEFla16L1)相同的方法来制备。利用重组杆状病毒的向Huh7细胞的基因导入将Huh7细胞以1\105细胞/孔分注于24孔平板中，在371培养。培养12小时后，用PBS洗涤，以100M0I感染Ac-hEFla16L1^PAcHERVenv-hEFla16L1病毒。在37°C中培养10小时后，更换为新的含10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，并培养48小时。从各病毒中表达的HPV16L1的表达程度可从以下实验获知。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析使用RNeasymini试剂盒(Qiagen，Valencia,CA)从被导入基因的Huh7细胞中纯化总RNA，用脱氧核糖核酸酶I(DNaseI，Promega，Madison,WI)处理来除去DNA。纯化的RNA用M-MuLV反转录酶(Bioneer，USA)来合成cDNA。将2.5μ1的cDNA加入到7.5μ1的聚合酶链式反应的反应混合物中(PCRreactionmixture)，使用热循环PCR(GeneAmpPCRsystem9700,Perkin-ElmerCetus,USA)进行PCR。PCR条件如下进行1次于94°C、3分钟的热启动后；30个循环的在94°C、30秒的变性反应后，62°C、20秒的退火反应以及72°C、20秒的延伸过程。反应中使用的引物是正义引物5’-CAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGG-3，；反义引物5，-GGCTGCAGGCCGAAGTTCCAGTCCTCCA-3，，预期获得约275bp的扩增产物。为保证样品间的RT-PCR效率，使用了持家基因18SrRNA(核糖体RNA)。PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶来测定。由实时PCR的定量分析(Q-PCR)为了测定被感染细胞中的HPV16L1mRNA表达水平，按照以往的报告(Dharetal.，2001)进行了基于实时PCR的定量分析(Q-PCR)。总HPV16L1mRNA的表达水平使用实时PCR机(RoterGene3000,CorbettResearch，Australia)，通过进行4次重复实验确定。PCR反应混合液中添加有5μ1的DyNAmoHSSYBRGreenqPCR试剂盒反应液和5μ1样品溶液(引物和模板)。引物由16L1正义引物:5，-CAGCGAGACCACCTACAAGA-3，及反义引物5’-GCTGTTCATGCTGTGGATGT-3’构成。可预期约138bp的扩增产物。初期DNA变性过程为在95°C、5分钟；以于94°C、10秒变性反应；于62°C、20秒的退火以及于72°C、20秒进行延伸反应的45个循环，从而得到PCR扩增产物。PCR完成后，进行了目标分子的拷贝数和熔解曲线分析(meltingcurveanalysis)，使用了软件Roter-Genever.6.0(RoterGene3000,CorbettResearch,Australia)禾呈序。免疫细胞化学法(ImmunocytochemistiT)将Huh7细胞分注于载玻片上，使用Ac-hEFlα16L1和AcHERVenv_hEFlα16L1病毒各100Μ0Ι进行转染。将已转染48小时的细胞用4%的甲醛于4°C固定12小时并用PBS(磷酸盐缓冲液，phosphatebufferedsaline)洗涤后，加入含0.5%TritonX-100的PBS，在37°C培养10分钟。接下来，用PBS洗涤后，用含5%正常山羊血清的PBS于37°C封闭30分钟。其后，与HPV16L1单克隆抗体(Camvir-I)—起于4V反应1天。将反应后的细胞用PBS洗涤30分钟后，用小鼠IgG-辣根过氧化物酶抗体反应1小时后，用PBS洗涤，然后使用共聚焦激光扫描显微镜(confocallaserscanningmicroscope,FV-1000spectral,Olympus,Japan)确认HPV16L1蛋白质存在与否。GardasilGardasil(MERCK&C0，USA，MSD，Korea)作为HPV四价(Quadrivalent，6、11、I6和18型)疫苗，在本实验中充当免疫应答的阳性对照组。/JN1,雌性的4周龄BALB/c小鼠是从Orient-Bio(Korea)购入的，并将其在过滤嘴条件下自由接近水和饲料来进行饲育。小鼠的免疫将重组杆状病毒用灭菌PBS稀释为总体积100μ1后，以107PFU(噬斑形成单位，plaqueformingunit)的量注射于小鼠的小腿肌肉中使免疫。将24只BALB/c小鼠分为8个组(表1)。根据所选择的起始/追加方案对各组小鼠进行注射。免疫以2周间隔进行3次，在各免疫后1周时收集血液和阴道洗涤液(vaginalwashes)。分析前，将抗血清进行了热变性。表1实验组免疫(2周的间隔)第1次第2次第3次1组GardasilGardasilGardasil2组AcHERVev-hEFlal6Ll或AcHERVev-hEFlal8LlAcHERVev-hEFl16Ll或AcHERVev-hEFlal8LlAcHERVev-hEFlal6Ll或AcHERVev-hEFlal8Ll3组AcHERVenv-hEFlal6Ll或AcHERVev-hEFlal8LlAcHERVev-hEFlal6Ll或AcHERVev-hEFlal8LlGardasil4组AcHERVev-hEFlal6Ll或AcHERVev-hEFlal8LlGardasilGardasil5組AcHERVGardasiIGardasil6组AcHERVAcHERVGardasil7组AcHERVAcHERVAcHERV8組PBSPBSPBSELISA将60μ1由HPV16Ll和麦芽糖结合蛋白(MBP)结合而成的蛋白质MBP-Ll(Bioprogen,Korea)以1μg/ml加入ELISA板的各孔中，于4°C处理1416小时。每孔用含0.1%Tween-20的PBS(封闭缓冲液)中的5%脱脂乳于37°C封闭2小时。用包含0.05%Tween-20和0.05%NP-40的PBS洗涤后，将用封闭缓冲液以1100稀释过的血清样品加入孔中，置于室温反应1小时。为了检测IgG，将抗-小鼠IgG-HRP(SC-2030，SantaCruzBiotechnology,Inc.，SantaCruz,CA)用封闭缓冲液以12，000稀释后加于孔中。为了检测IgA，将抗-小鼠IgA-HRP(SC-3791，SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)用封闭缓冲液以11，000稀释后加于孔中。将0.IM的柠檬酸盐缓冲液(PH4.7)中的邻苯二胺基质加入到孔中，测定了450nm处的吸光度。假病毒的制备根据SchilleHJ.Virol.78(2):751_757(2004))提议的方法通过执行293TT细胞的共转染来制备PV(假病毒)。首先，转化16小时前将293TT细胞种于25T瓶中，用L1/L2-质粒和pfVB质粒(表达强化的绿色荧光蛋白(GFP))的混合物使用脂质体(Invitrogen)来进行转化。使用的质粒的核苷酸图可在http://ccr.cancer.gov/Staff/17links,asp？profileid=5637中确知。用各9μg的pfwB和pl6Ll/L2转化细胞来制备HPV16PV。另外，用各9yg的pfwB和pl8Ll/L2转化细胞来制备了HPV18PV。46小时后，更换转化细胞的培养基。转化48小时后收集细胞，等分上清液，并储存于-80°C直到下次实验。中和反应分析将经免疫注射的小鼠稀释血清和PV的混合物于室温温育1小时。接种16小时前，向以1XIO4接种的HeLa细胞接种混合物温育2天后，在荧光显微镜下观察GFP的表达。用将GFP表达水平降至经正常小鼠血清处理的样品的1/2的血清最高稀释度的倒数来显示中和效价。IFN-Y酶联免疫斑分析(enzyme-linkedimmunospot:ELISP0T)将96孔平板于4°C用100μ1PBS中的200ng的抗-小鼠γ干扰素(IFN-γ)捕获抗体(BDBioscience)包被过夜。将平板用100μ1的培养基(含10%FBS的RPMI1640)于37°C封闭2小时后，将脾细胞以1XIO6细胞/孔的密度一式两份接种。接着以2XIO6IFU接种PV，并于37°C温育24小时。用含0.05%Tween20的PBS洗涤3次而除去细胞。接着，将100μ1含10%FBS的PBS中的20ng经无菌过滤的生物素化的抗小鼠IFN-γ检测抗体加入各孔中，将平板于室温下放置2小时。用含0.01%Tween20的PBS洗涤3次平板，加入100μ1抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶的11，000稀释液。其后将平板于室温下温育1小时，用含0.01%Tween20的PBS洗涤3遍，再用PBS洗涤3遍。向平板中加入100μ1的AEC基质试剂(BDBiosciences,CA,USA)后反应10分钟。将平板用蒸馏水洗涤以终止反应。将斑点用ELISP0T读取器(AIDElispotReaderver.4，Germany)定量。将只含培养基而脾脏细胞未经处理的孔设定为阴性对照组。背景孔的计数从样品减除。实验结果HERV表面蛋白基因的合成用于制备转移载体的HERV表面蛋白(Env)基因是自主合成而制备的，并为使能够在昆虫细胞内有效果地表达，以匹配昆虫基因密码子的方式优化了基因。使如此合成的HERV表面蛋白的氨基酸序列保持与既有报道的HERV表面蛋白氨基酸序列一致的同时，只变更了一部分基因序列。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2是为了使用于本实验而合成的1617bp的HERV表面蛋白的基因序列和氨基酸序列。另通过图47比较了既有HERV表面蛋白基因序列和合成的本发明的基因序列。由图47所示，可知约73.5%的基因序列具有同一性。重组杆状病毒的制备为制备重组杆状病毒，计划构建pAc-hEFlα16L1和pAcHERVenv_hEFlα16L1两种转移载体，并预测了预期的杆状病毒的形式(图3)。为了追加杆状病毒表面蛋白，在多角体蛋白启动子(polyhedrinpromoter)后插入了HERV表面蛋白(Env)基因，并使构成为HPV16L1基因由hEFlα调节表达。HERV的Env诱导人细胞受体介导的吞噬作用。图1显示了pAc-hEFlα16L1的克隆方法；图2简略地显示了pAcHERVenv_hEFlα16L1的克隆方法。使用相同方法克隆了pAcHERVenv-hEFlα18L1。在以受昆虫病毒启动子调节的方式制备的HERV表面蛋白的情况下，会具有在昆虫细胞中显示极高表达量，但在动物细胞中不能很好表达的特征。与此相反，在HPV16L1蛋白的情况下，会因为持有作为人启动子的人延长因子Ia启动子(hEFla)，在动物细胞中表达有效活化，但在昆虫细胞中完全不表达或仅可极少量表达。利用克隆出的各质粒制备重组杆粒并转染Sf9细胞而生产了高滴度的病毒。向Huh7的HPV16L1基因转导效率测定为获知基于杆状病毒表面变形的HPV16L1基因的转移效率，用Ac-hEFla16L1和AcHERVenv-hEFla16L1病毒以各100M0I感染了Huh7细胞。用RT-PCR确定HPV16L1mRNA的表达水平。如图8通过电泳可从感染Ac-hEFla16L1和AcHERVenv_hEFla16L1的细胞中确认275bp的HPV16L1扩增产物。但HPV16L1基因的扩增程度存在差异。杆状病毒是表面具有HERV表面蛋白的AcHERVenv-hEFla16L1时，HPV16L1基因的扩增产物量与表面未经变形的杆状病毒相比高。接下来，为了在显微镜下确认感染Ac-hEFla16L1和AcHERVenv_hEFla16L1病毒的Huh7细胞中HPV16L1的表达，进行了免疫细胞化学分析。将已转染48小时的细胞用HPV16L1单克隆抗体(Camvir-I)和小鼠IgG-辣根过氧化物酶抗体染色，用共聚焦激光扫描显微镜确认HPV16L1蛋白的存在与否。如图9中所示，与未感染病毒的Huh7细胞相比，可确认用HERVenv-hEFla16L1和Ac-hEFla16L1病毒感染的细胞中全部可见荧光。但因为无法确切区分两种样品中基于HPV16L1表达的荧光程度的差异，进行了如下的追加实验。为了确切地数值化通过感染的HPV16L1基因转移效率，进行了基于实时PCR的定量分析(Q-PCR)。Q-PCR分析的准确性可通过指定标准曲线进行确认。实验通过4次重复而确立并且如图10，使用Roter-Genever.6.0用Δ-ΔCT法来进行相对定量。如下述表1所示，当把感染Ac-hEFla16L1病毒的细胞的拷贝数设为1时，可确认感染AcHERVenv-hEFla16L1病毒的细胞中的基因拷贝数高4.17倍。表219II-I-HCOCMO-I-HO<lI<lCDOCNJIτ-Ητ-ΗCN3OO寸寸-ΗCDLO<lCO卜LO13栽绺LO寸σ-I-H寸CMOC-I-H寸寸OC-I-H涖I~IOOCMCMCMCJI~IOOOiOCCNJCMLOOCLOCMCOOiCOCM-I-HCD-I-H-I-HCD-I-H-I-H[Χωι>①>ωχο<-I-H[Xωι>①>ω%<Τ9ΤTdaM0V小鼠中的免疫应答将IO7PFU的AcHERVenv，AcHERVenvhEFlα16L1，或AcHERVenv-hEFlα18L1注射于肌肉内，并将Gardasil施用组设为阳性对照组，作为阴性对照组，分成AcHERVenv施用组和PBS施用组，比较了各实验组的免疫应答。进行ELISA分析从经免疫的小鼠血清中测定了HPV16L1-特异性IgG抗体或HPV18L1-特异性IgG抗体。免疫前，如所预想，在只注射AcHERVenv的组和只注射PBS的组的血清中观察到显著低水平的IgG抗体。如图12所示，第一次免疫后只有Gardasil施用组(组1)可见IgG抗体应答，而施用AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1的组(组2)中未见明确的IgG抗体应答。使用gardasil进行两次免疫获得的血清中的IgG抗体应答与第一次免疫时相比增加了约2.7倍(HPV16)或2倍(HPV18)，且用gardasil进行第三次免疫时比第二次增加1.3倍(HPV16)或1.3倍(HPV18)；比第一次增加约3.5倍(HPV16)或2.5倍(HPV18)(组1)。在用AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1两次免疫得到的血清中，IgG抗体应答比第一次免疫时增加3倍(HPV16)或2倍(HPV18)，用AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1进行第三次免疫时比第二次增加1.1倍(HPV16)或1.1倍(HPV18)；比第一次增加3.3倍(HPV16)或2.4倍(HPV18)(组2)。从而可知注射了AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1的小鼠血清中的IgG抗体应答与注射Gardasil的情况接近。另外，第一次免疫后，第9周和第14周后也可观察到IgG抗体应答，从而可知免疫力持续了。分泌性IgA应答是使用免疫过的小鼠阴道洗涤液进行ELISA来测定的，确认不仅在注射Gardasil的实验组中、注射AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1的组中也有IgA抗体的分泌(图13)。在第一次免疫后接着进行第二次、第三次免疫后，确认IgA抗体的分泌增加了，而且第一次免疫后，第9周和第14周以后也观察到IgA抗体应答，由此可见免疫力持续了。从而可以获知用AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1进行免疫可在小鼠中诱发粘膜免疫应答。小鼠抗血清对16、18型HPV及BPVPV的中和根据HeLa细胞中对GFP表达质粒的抑制感染性HPV16或HPV18PV的感染的程度测定了抗血清的中和活性。将血清最大程度地稀释(5倍血清稀释)，用GFP表达水平与未经血清处理的样品相比减少50%或90%时的倒数表示中和抗体效价。各实验组的经稀释血清对HPV16或HPV18PV的中和活性如图14所示。图14是被中和50%时的中和效价，且第一次免疫后再进行第二次、第三次免疫后的中和抗体效价在所有实验组中都显示高。第三次免疫后，组1和2中的中和抗体效价是156、250，且可知施用Gardasil的组和施用本发明开发的AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1的组中以显著差异地显示高水平的B细胞体液免疫。另外，按照中和活性50%的标准在组3和4中用AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1起始后用Gardasil追加时，可确认中和效价由234、375提高到了312、500。特别是，用AcHERVenv-hEFlα16L1起始后再用Gardasil追加2次的情况的组4中，可确认中和效价以312、500出现最高。由此结果可见，用AcHERVenv-hEFlα16L1起始可提高Gardasil的追加效果。细胞免疫应答分析为了确认被免疫小鼠中的T细胞免疫应答，进行了ELISP0T分析。在使用AcHERVenv-hEFα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1进行三次免疫的组2中，可观察到从IXIO6个小鼠脾脏细胞中可生成约500个斑点，而在经Gardasil免疫的组1或阴性对照组中却观察不到由IFN-Y分泌产生的斑点。在分别注射Gardasil、AcHERVenv-hEFα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1以及PBS的小鼠中，可确认在经AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1免疫的小鼠中可发生强的HPV16特异性T细胞应答(IFN-γ的分泌)，而经Gardasil免疫的实验组完全不引发细胞免疫应答(图15)。结论是，AcHERVenv-hEFα16L1或AcHERVenv-hEFlα8L1嵌合杆状病毒因为可以安全地将DNA疫苗有效地转入动物体内，在体液免疫方面、可以显示与既有疫苗Gardasil几乎相同的效果，而且，与单独接种Gardasil相比，接种AcHERVenv-hEFα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1嵌合杆状病毒与Gardasil的联合疫苗时可获得更高的中和抗体效价。在细胞免疫方面，Gardasil由于是注入蛋白质而不能像预期的那样引起细胞免疫，但AcHERVenv-hEFlα16L1或AcHERVenv-hEFlα18L1嵌合杆状病毒在APC(抗原呈递细胞，antigenpresentationcell)中作为DNA疫苗可表达Ll基因，诱导极强的细胞免疫能力，故可以说在疫苗效能方面是比Gardasil更优秀的新的安全经济的疫苗。以上详述了本发明的特征部分，但本领域普通技术人员明晰，这样的具体技术仅为优选的实施例，而本发明的范围不局限于此。因此，本发明的实质范围是根据随附的权利要求和其等同物而被定义的。参考文献AbeT,TakahashiH,HamazakiH,Miyano-KurosakiN,MatsuuraY,TakakuH.(2003)Baculovirusinducesaninnateimmuneresponseandconfersprotectionfromlethalinfluenzavirusinfectioninmice.JournalofImmunology,1711133-1139.AultKA,GiulianoAR,EdwardsRP,TammsG,KimLL,SmithJF,JansenKU,AllendeM,TaddeoFJ,SkulskyD,BarrE.(2004)AphaseIstudytoevaluateahumanpapillomavirus(HPV)type18LlVLPvaccine.Vccine22(23—24):3004_7.BaskinLS,YucelS,CunhaGR,GlickmanSE,PlaceNJ.(2006)Aneuroanatomicalcomparisonofhumansandspottedhyena,anaturalanimalmodelforcommonurogenitalsinus:clinicalreflectionsonfeminizinggenitoplasty.JUrol.175(1):276_83.Barsoum,J.,Brown,R.,McKee,M.andBoyce,F.M.(1997)EfficienttransductionofmammaliancellsbyarecombinantbaculovirushavingthevesicularstomatitisvirusGglycoprotein.HumGeneTher8,2011-2018.Blissard,G.W.andWenz,J.R.(1992)Baculovirusgp64envelopeglycoproteinissufficienttomediatepH—dependentmembranefusion.JVirol66,6829-6835.Boyce,F.M.andBucher,N.L.(1996)Baculovirus-mediatedgenetransferintomammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA93,2348-2352.Condreay,J.P.,ffitherspoon,S.Μ.,Clay,W.C.andKost,T.A.(1999)Transientandstablegeneexpressioninmammaliancellstransducedwitharecombinantbaculovirusvector.ProcNatlAcadSciUSA96,127-132.DaftarianP,MansourM,BenoitAC,PohajdakB,HoskinDff,BrownRG,KastWM.(2006)EradicationofestablishedHPV16_expressingtumorsbyasingleadministrationofavaccinecomposedofa1iposome-encapsulatedCTL-Thelperfusionpeptideinawater-in-oilemulsion.Vaccine.24(24):5235_44.Dhar,A.K.,Roux,M.M.andKlimpel,K.R.(2001)Detectionandquantificationofinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirusandwhitespotvirusinshrimpusingreal-timequantitativePCRandSYBRGreenchemistry.JClinMicrobiol39,2835-2845.FacciabeneA，AurisicchioL，LaMonicaN.(2004)Baculovirusvectorselicitantigen-specificimmuneresponsesinmice.JournalofVirology,78(16)8663-8672.GambhiraR，KaranamB，JaguS，RobertsJN，BuckCB，BossisI，AlphsH，CulpT，ChristensenND,RodenRB.(2007)Aprotectiveandbroadlycross-neutralizingepitopeofhumanpapillomavirusL2.Journalofvirology,81(24)；13927-13931.Hofmann，C.，Sandig，V.，Jennings，G.，Rudolph，M.，Schlag，P.andStrauss，M.(1995)Efficientgenetransferintohumanhepatocytesbybaculovirusvectors.ProcNatlAcadSciUSA92，10099-10103.KondoK，OchiH，MatsumotoT，YoshikawaH，KandaT.(2008)Modificationofhumanpapillomavirus-likeparticlevaccinebyinsertionofthecross-reactiveL2-epitopes.JournalofMedicalVirology80,841846.Kost,T.A.andCondreay,J.P.(2002)Recombinantbaculovirusesasmammaliancellgene-deliveryvectors.TrendsBiotechnol20，173—180·KumarM，BradowBP，ZimmerbergJ.(2003)Large-scaleproductionofpseudotypedlentiviralvectorsusingbaculovirusGP64.HumGeneTher.14(1)67-77.Lin,S.W.，Hensley,S.Ε.，Tatsis,N.，Lasaro,Μ.0.andErtl,H.C.(2007)Recombinantadeno—associatedvirusvectorsinducefunctionalIyimpairedtransgeneproduct-specificCD8Tcellsinmice.JClinInvest117，3958—3970·Lung0，WestenbergM，VlakJM,ZuidemaD，BlissardGW.(2002)PseudotypingAutographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus(AcMNPV):FproteinsfromgroupIINPVsarefunctionallyanalogoustoAcMNPVGP64.JournalofVirology,76(11):5729_5736.MangorJT，MonsmaSA，JohnsonMC，BlissardGW.(2001)AGP64_nul1baculoviruspseudotypedwithvesicularstomatitisvirusGprotein.JournalofVirology75(6):2544_2556.Monahan,P.E.，Jooss，K.andSands，M.S.(2002)Safetyofadeno-associatedvirusgenetherapyvectors:acurrentevaluation.ExpertOpinDrugSaf1,79-91.Monsma,S.A.,Oomens,A.G.andBlissard,G.W.(1996)TheGP64envelopefusionproteinisanessentialbaculovirusproteinrequiredforcell-to-celltransmissionofinfection.JVirol70，4607—4616.MulliganRC.(1993)Thebasicscienceofgenetherapy.Science260(5110)926-932.ParkSW,LeeHK,KimTG,YoonSKiPaikSY.(2001)Hepatocyte-specificgeneexpressionbybaculoviruspseudotypedwithvesicularstomatitisvirusenvelope23glycoprotein.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications289(2)444-450.PastranaDV,BuckCB，PangYY，ThompsonCD，CastlePE，FitzGeraldPC，KrKjaerS，LowyDR,SchillerJT.(2004)Reactivityofhumanserainasensitive,high-throughputρseudovirus-basedpapillomavirusneutralizationassayforHPV16andHPV18.Virology321，205-216.RatishGambhira，BalasubramanyamKaranam，SubhashiniJagu,JeffreyN.Roberts,Christopher.Buck,IoannisBossis，HannahAlphs，TimothyCulp，NeilD.Christensen，andRichardB.S.Roden(2007)AProtectiveandBroadlyCross-NeutralizingEpitopeofHumanPapillomavirusL2.JournalofVirology81(24):13927-13931.Sandig，V.，Hofmann，C.，Steinert，S.，Jennings，G.，Schlag，P.andStrauss，M.(1996)Genetransferintohepatocytesandhumanlivertissuebybaculovirusvectors.HumGeneTher7，1937—1945.Tjia，S.T.，zuAltenschildesche,G.M.andDoerfIer,W.(1983)Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus(AcNPV)DNAdoesnotpersistinmassculturesofmammaliancells.Virology125，107—117.Vogt，S.，Ueblacker,P.，Geis，C.，Wagner,B.，Wexel,G.，Tischer,Τ.，Kruger,Α.,Plank,C.,Anton,Μ.,Martinek,V.,Imhoff,Α.B.andGansbacher,B.(2008)EfficientandstablegenetransferofgrowthfactorsintochondrogeniccellsandprimaryarticularchondrocytesusingaVSV.Gpseudotypedretroviralvector.Biomaterials29(9)1242-9.WilsonS，BairdM，WardVK.(2008)Deliveryofvaccinepeptidesbyrapidconjugationtobaculovirusparticles.Vaccine26(20):2451_2456.VSchirrmacheriCHaasiRBoniferiTAhlertiRGerhardsandCErtel.(1999)Humantumorcellmodificationbyvirusinfection:anefficientandsafewaytoproducecancervaccinewithpleiotropicimmunestimulatorypropertieswhenusingNewcastlediseasevirus.GeneTheraphy6(1):63_73.权利要求重组杆状病毒，其含(a)编码病毒外源包膜蛋白的核苷酸序列；(b)运作性连接于所述包膜编码序列的第1启动子；(c)编码抗原蛋白的核苷酸序列；及(d)运作性连接于所述抗原编码序列的第2启动子。2.权利要求1的重组杆状病毒，其特征在于，所述抗原是病毒病原体抗原、细菌病原体抗原、寄生虫抗原或癌抗原。3.权利要求2的重组杆状病毒，其特征在于，所述抗原是选自下列的病毒病原体抗原HPV(人乳头瘤病毒)抗原、HBV(乙型肝炎病毒)抗原、HCV(丙型肝炎病毒)抗原、HIV(人免疫缺陷病毒)抗原、轮状病毒抗原、流感病毒抗原、HSV(单纯疱疹病毒)抗原、禽流感病毒抗原、猪霍乱病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和新城疫病毒抗原。4.权利要求3的重组杆状病毒，其特征在于，所述抗原是HPV抗原。5.权利要求4的重组杆状病毒，其特征在于，所述抗原是HPV的L1、L2、E6或E7蛋白。6.权利要求4的重组杆状病毒，其特征在于，所述HPV的抗原蛋白源于选自下列的HPV1型、2型、3a型、4型、5型、6b型、7型、8型、9型、10型、Ila型、12型、13型、16型和18型HPV。7.权利要求1的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒包膜源于甲病毒、副粘液病毒、弹状病毒、粘液病毒、冠状病毒、反转录病毒、纤丝病毒或沙粒病毒。8.权利要求7的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒包膜源于反转录病毒。9.权利要求8的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒包膜是人内源性反转录病毒(HERV)的包膜。10.权利要求9的重组杆状病毒，其特征在于，编码所述HERV包膜的序列含编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列。11.权利要求1的重组杆状病毒，其特征在于，所述第1启动子是在昆虫细胞中运作的启动子。12.权利要求11的重组杆状病毒，其特征在于，所述在昆虫细胞中运作的启动子是杆状病毒IE-I启动子、IE-2启动子、p35启动子、plO启动子、gp64启动子或多角体蛋白启动子。13.权利要求1的重组杆状病毒，其特征在于，所述第2启动子是源于哺乳动物细胞基因组的启动子或源于哺乳动物病毒的启动子。14.权利要求13的重组杆状病毒，其特征在于，所述第2启动子是:U6启动子、Hl启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、RSV启动子、人延伸因子la(hEFlα)启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、人GM-CSF基因启动子、TERT启动子、PSA启动子、PSMA启动子、CEA启动子、E2F启动子、AFP启动子或白蛋白启动子。15.疫苗组合物，其含权利要求114中任一项的重组杆状病毒作为有效成分。16.权利要求15的疫苗组合物，其特征在于，所述重组杆状病毒含HPV(人乳头瘤病毒)抗原基因，且所述疫苗组合物是HPV疫苗组合物。17.在活体内诱导针对特定抗原的免疫应答的方法，包括将药剂学有效量的权利要求15的疫苗组合物施用于受试者的步骤。18.权利要求17的方法，其特征在于，所述疫苗组合物所含的重组杆状病毒携带HPV(人乳头瘤病毒)抗原基因，且所述方法是预防和治疗由HPV感染诱发的癌症的方法。19.核酸分子，其编码人内源性反转录病毒(HERV)的包膜蛋白，且含SEQIDNO1的核苷酸序列。全文摘要本发明涉及重组杆状病毒，其含(a)编码病毒外源包膜蛋白的核苷酸序列；(b)运作性连接于所述包膜-编码序列的第1启动子；(c)编码抗原蛋白的核苷酸序列；及(d)运作性连接于所述抗原-编码序列的第2启动子；及含所述重组杆状病毒的疫苗组合物。本发明的重组杆状病毒优于诱导针对特定抗原(如HPV的L1)的体液免疫的能力；且优于诱导细胞免疫的能力，从而发挥提高的疫苗效能。文档编号C12N15/48GK101952436SQ200980101971公开日2011年1月19日申请日期2009年1月9日优先权日2008年1月9日发明者N·朴,吴裕耕,李禧姃,金永奉申请人:建国大学校产学协力团;韩国生物科技有限公司