培养基自动优化技术的制作方法

专利名称：培养基自动优化技术的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及高通量筛选方法领域。本发明涉及一种计算机实现的筛选系统和方法，其可以用于识别引发期望响应的试剂混合物，尤其根据诸如抗体分泌、细胞数量和达到抗体分泌峰值的时间的各种响应识别优化细胞培养条件的二种或三种蛋白胨的最佳集和/或子集。
背景技术：
对于治疗中使用的用来治疗或医治人的疾病的细胞，希望在体外培养基里保持细胞时控制细胞命运例如细胞存活、增殖和分化。因此需要控制细胞表面受体和配体的相互作用。例如，为了获得对细胞和存在于体外培养基底上的配体之间的相互作用的控制，可以对适当的培养基例如聚苯乙烯涂上聚合物，使培养基中即便使用血清蛋白后者也不允许细胞附着。从而这种涂层消除对血清蛋白的无控的和任意的吸收。接着可以在该涂层上固定适宜与细胞表面受体相互作用的生物活性配体，同时保持这些配体的生物活性。业内人士周知这个概念。例如，已知把透明质酸或藻酸用作为表面涂层，可以在该涂层上固定细胞粘附配体，方法是利用在该涂层和细胞粘附配体之间产生稳定共价键的化学物质。这防止细胞粘附配体溶解并脱离表面。另外，该涂层本身不支持细胞粘附。在2002年9月30日提交的共同待决、共同拥有的美国专利申请No.10/259,797中对此做出进一步说明，其整个内容收录在此作为参考。
另外，为了达到期望的细胞命运可能需要特殊的试剂混合物。已知大量的生长效应因子分子。它们包括生长因子、激素、肽、小分子和细胞外结合分子。但是，为寻找正确生长效应因子或生长效应因子组合以便对给定的细胞类型达到期望的细胞命运，这将是冗长的工作。
因此，需要一种通量更高的系统和方法以识别用于为给定细胞类型达到期望的细胞命运的试剂。对于常规细胞培养系统中不存活的细胞或只在通过强烈改变它们的分化状态才存活的细胞，这是特别感兴趣的，其主要例子是初级哺乳细胞。技术上尤其需要一种计算机实现的统计设计试验方法和系统，以便为了达到期望的细胞系统地探查所需的因子混合之间的交互作用。这种通量更高的系统和方法应包括从列出几种可能的试剂例如蛋白胨开始，并且实施一种优化策略以便根据各种响应识别优化细胞培养条件的二种或三种蛋白胨的最佳子集。这些响应可以包括抗体分泌、细胞数量和抗体分泌峰值周期。

发明内容
从而，本发明的一个目的是提供一种自动系统和方法以便识别在细胞中造成表现型改变的试剂。该方法包括在阵列中提供受器并且提供包含类因子名、因子水平和试验运行的统计设计。该方法还包括根据该统计设计的计算机表达在一些选定的受器中置入单种试剂的不同混合物以及利用软件程序产生该设计的计算机表达。该软件自动地把试剂的身份变换到类因子名上，把试剂的浓度或数量变换到因子水平上，并且把该阵列内的受器的位置变换到试验运行上。一旦根据该设计的计算机表达把不同的混合物正确地置入各受器中，置入的混入物和能改变它们的表现型的完整细胞接触。
本发明的另一个目的包括提供一种方法，以获取指示相接触的细胞中的表现型改变的数据，并且利用包含算法的处理器比较获取的数据和统计设计，以识别哪些试剂混合物和/或哪些单种试剂在造成所接触的细胞中的表现型改变上是有效的。该方法还包括在一个或更多的数据库中存储该统计设计、各试剂身份、该设计的计算机表达、获取的试验数据以及该算法的比较结果。
本发明的再一个目的包括提供一种用来实现刚刚描述的方法的系统，该系统包括受器阵列，其中一些选定的受器用于接受(i)单种试剂的不同混合物和(ii)含有细胞的液体。该系统还包括含有类因子名、因子水平和试验运行的统计设计，并且包括用于产生该设计的计算机表达的软件程序。该软件程序自动地把试剂身份变换成类因子名，把试剂的浓度或数量变换成因子水平并且把该阵列内的受器的位置变换成试验运行。该系统还包括获得的指示细胞中的表现型改变的试验数据，并且包括一个含有比较试验数据和统计设计以便识别在造成细胞中的表现型改变上是有效的混合物和/或单试剂的算法的处理器。该系统中还包括一个或更多的数据库，用于存储该统计设计、试剂身份、该设计的计算机表达、获取的试验数据以及算法比较结果。
本发明的又一个目的是应用培养基自动优化技术以便用户能利用MPM/CATSBA软件和自动液体处理平台优化培养基成分(例如因子)。利用各专用因子，该MPM/CATSBA软件在多孔板格式下自动建立统计设计的试验，并且生成必要的文件从利用自动液体处理平台(例如，Biomek FX，Biomek 2000，Tecan Genesis或任何类似平台)准备正确的试验条件。该软件以及它驻留的数据库用于自动地分类和分析数据(例如，荧光性，吸收性，细胞计数等等)的各种格式。该软件的用户可以在自动方式下进行所有相关的统计分析并且自动地生成和在数据库中自动地存储所有相关的报告。在完成全部相关的统计分析后，用户具有为元(meta)分析和数据挖掘而组合来自多个试验的结果的能力。


从下面的连同附图一起阅读的详细说明，本发明的这些以及其它的目的、优点和新颖特征会更容易地理解，附图中图1A和1B是依据本发明的一实施例的示例自动进程的流程图，通过该进程可以在高通量方式下识别能在细胞中引起表现型改变的最佳混合物和/或最佳试剂；图2是依据本发明的一实施例的示例进程的流程图，利用从图1A和1B进程中导出的信息从本进程可以建立和/或修改生物模型；图3示出为生物系统上的试剂混合物(M)的作用假设的示例细胞路径的模型实例；图4是依据本发明的一实施例的计算机系统例子的方块图，该系统可用来实现图1-3的方法；图5的方块图示例说明该依据本发明的一实施例的系统的组成部分实例；图6示出表示依据本发明的一实施例的示例测试孔；图7示意表示96孔板布置例子，其包括单试剂的不同混合物，其中利用统计设计建立该布置，在该统计设计中类因子代表各种单试剂并且类因子的组合形成依据本发明的一实施例的不同的混合物。
图8A和8B是情景例子的方块图表示，可以利用它们开发依据本发明的一实施例的方法的统计设计。
图9A和9B是另一个情景例子的方块图表示，可以利用它们开发依据本发明的一实施例的方法的统计设计。
图10是依据本发明的一实施例利用图9A和9B的情景开发的带有用于96孔板的布置的混合物设计的计算机电子表格表示例子，其中根据给出的因子数划分孔中的总液体容积；
图11示出依据本发明的一实施例的基于图10中的电子表格的统计设计的96孔板的布置例子；图12是依据本发明的一实施例的在图11中示出的布置下附着到该96孔板的各孔上的荧光标记的细胞的荧光显微镜图像；图13是依据本发明的一实施例的图12中的显微镜图象分析后得到的细胞核计数-孔号图的例子；图14是依据本发明的一实施例的利用对图9-13的信息进行混合物-模型分析得到的Ln(无血清下细胞计数+1)-基准混合偏差曲线例子；图15是依据本发明的一实施例的利用对图9-13的信息进行混合物-模型分析得到的Ln(10％血清下细胞计数+1)-基准混合偏差曲线例子；图16a到16d是电子表格例子，示出依据本发明的一实施例的用于96孔板的布置的Plackett-Burman统计设计；图17示出依据本发明的一实施例的图16中的统计设计例子里的因子身份的例子；图18是示例曲线，示出依据本发明的一实施例的第一种材料随时间的分泌和细胞增殖；图19是示例曲线，示出依据本发明的一实施例的第二种材料随时间的分泌和细胞增殖；以及图20是示例曲线，示出依据本发明的一实施例的第一和第二种材料随时间的组合分泌和细胞增殖。
具体实施例方式
如本文定义那样，“试剂”是生长效应因子分子，它们结合细胞并且调节目标分子或组织的存活、分化、增殖和成熟。供在本发明的各实施例中使用的适当试剂的例子包括蛋白胨、生长因子、细胞外基质分子、肽、激素和细胞因子，它们可以在溶液中或者结合在培养表面，例如孔表面、支架表面、珠表面等等上。
术语“试剂固定材料”文中定义为可以作为培养表面和试剂之间的链接的生物相容性聚合物。
如本文定义那样，术语“固定”、“固定的”等是把试剂，即生长效应因子分子，变成固定在培养表面上，例如孔表面或孔内含有的支架表面上。该术语预期包括试剂被动吸收到培养表面上，以及试剂直接或间接地共价附着到培养表面上。
“因子”是试验中变量的名称并且代表从一次试验或一次运行(例如一个孔)到下一个试验或运行改变的要素。在本发明的各实施例中，“因子”是单试剂或单试剂的混合物的类名。根据统计设计组合因子以形成试验中的不同混合物。
如本文定义那样，“统计设计”是一种试验设计，其帮助用户找出可调整变量(即因子)的组合以产生最佳试验结果，以显著地减少为达到目的所需的试验次数。在本发明的各实施例中，利用代表被试验的试剂的类因子名生成适当的统计设计。该设计包含因子水平，其可以是因子的数量和/或浓度或者可以转换成因子的实际数量和/或浓度。设计还包含编号的试验运行。试验运行规定要试验的因子和水平的组合，并且每次运行可以对应多孔板上的单个孔。试验运行可以变换到多孔类板上的各个孔上。
如文中使用那样，术语“预处理”和“预处理的”指的是对表面或其它材料添加官能团，它们化学上参与随后和试剂固定材料(即生物相容聚合物)形成的共价键。例如，微量滴定孔的表面可以受到氨基处理以形成富胺表面，试剂固定材料可结合在该富胺表面上。
如文中定义那样术语“阵列”、“受器阵列”等是多个单一的容器例如管或孔，它们配置在有序的排列中，例如按行和列。
如本文定义那样术语“表现型的”、“表现型改变”等包括生物体的由遗传结构或环境影响决定的可观测的物理或生物化学特征。这包括根据遗传和环境影响之特定特征，例如抗体分泌、细胞数量和达到抗体分泌峰值的时间的表达。
如前面说明那样，为了达到期望的细胞命运，可能需要单试剂的混合物。例如，和细胞表面受体结合并且调节这些细胞的存活、分化、增殖或成熟的生长效应因子分子包括生长因子、细胞外基质分子、肽、激素和细胞因子，而它们各又存在许多例子。从而这可能是为达到期望的细胞命运寻找和细胞接触的正确的生长效应因子或生长效应因子组合的乏味任务。
本发明的各实施例通过提供一种高通量的计算机实现的方法解决了本领域为给定细胞类型识别最优试剂的需求。具体地，该下面更详细说明的系统和方法验证了几种可能的试剂(例如蛋白胨)的列表并且根据各种响应，例如抗体分泌、细胞数量和达到抗体分泌峰值的时间，识别优化细胞培养条件的二种或三种蛋白胨的最佳子集。
图1A和1B是依据本发明的一实施例的进程例子，通过该进程可以识别能引发细胞的表现型上的变化的独特混合物和/或单试剂。在下面说明的该实施例中，使用的格式是微孔阵列。这种阵列通常很适宜自动化，因为容易买到自动加样器和板读出器。
在流程图10的第一步骤中，用户在框100利用商用软件例如可从SAS Institute(Cary，NC)买到的JMPTM建立试验设计或者根据该系统的软件已包含的算法生成统计设计。框100的设计包括类因子名、因子水平、试验运行以及试验运行对类微孔阵列的变换。在框102把该统计设计存储在数据库中。用户接着在框104把特定试剂以及这些特定试剂的浓度和/或数量输入到该软件中。接着在框106把用户输入存储在数据库中。
在框107，用户可以选择特定的统计设计。随后，在框108可以利用一个软件程序以产生该特定统计设计的计算机表达。设计的计算机表达可以是例如可以变换成96孔布置的电子表格。具体地，该用来生成计算机表达的软件程序把特定试剂的名称变换成设计中的类因子名，把试剂的浓度和/或数量变换成设计中的因子水平，根据特定试剂以及浓度和/或数量建立试验运行，并且把孔位置变换成特定微孔阵列上的试验运行。接着在框110把计算机表达存储在数据库中。
在框112，根据该设计的计算机表达为机器人系统生成计算机程序。在图1B的流程图15中示出的框144，该机器人系统根据该设计的计算机表达把试剂分配到各孔中，从而在该微孔阵列的一些选定的孔中产生不同的混合物，包括二和三种试剂的子集。最优地，该机器人系统可以向该微孔阵列中的一些其它孔分配单种试剂。除了试剂添加，该机器人系统还可以完成回收和冲洗步骤。替代地，可以人工地完成这些步骤中的一部分或全部。通过诸如藻酸或透明质酸的生物相容聚合物这些试剂可以共价地束缚在孔上或其它培养表面上，或者这些试剂可呈现在溶液中。
一旦已经正确地把试剂放到孔中，该机器人系统在框116把含有完整细胞的液体分配到该微孔阵列的孔中。在框118获取指示细胞的表现型上的改变的试验数据。在框120把获取的数据存储在数据库中，从而使试验数据和该设计的计算机表达相链接。接着在框122利用一个包含比较存储的试验数据和存储的统计设计的算法的处理器以识别最佳混合物和/或最佳试剂，尤其识别哪些二或三种试剂的子集引发期望的生物响应(即，引发细胞中的表现型改变)。任选地，可以利用另一个算法比较多次试验上的试剂混合物或单种试剂的性能以确定趋势或模式。在这二种情况中，可以在框124把算法比较的结果存储在数据库中和对用户显示，并且可以周期性地更新比较结果。
图1A和1B中示出的数据库可以是单个集成的或联合的数据库。在框126，如果需要可以利用最佳混合物组的一个子集或者最佳试剂组的一个子集重复该进程的各个步骤。另外，如果需要，可以利用最佳试剂组和来自最佳混合物组的试剂的子集的组合子集重复这些步骤(未示出)。此外，在步骤128可以在改变最佳混合物组中的试剂的浓度和/或数量下重复该进程的步骤。另外，可以最优地使用从框122的算法比较获取的信息以在框130建立或者修改生物模型。
现参照图2，该流程图表示依据本发明的一实施例的一示例进程，通过该进程利用来自图1B的框122和124的信息可以建立生物模型或者修改已有的模型。在流程图20的第一步骤中，在框200从各种来源，例如论文、期刊、书藉、专家、试验、内部信息等等，收集科学信息。科学信息可以包括但不限于基因表达数据，蛋白表达数据，细胞表现型数据，信号转导数据，关于细胞路径的数据，以及它们的组合。可以在一个或更多的数据库中存储这样的科学信息。信息可以是计算机提取的，例如通过互联网。
在框202提取的信息和从图1B的框122识别的试剂混合物和/或单种试剂比较。根据该比较可以在框204开发或修改生物模型。该生物模型可以定义该表现型改变涉及到的生物系统以及生物系统之间的任何有关的交流机制。例如，在框204可以识别和细胞中的表现型改变关联的特定细胞路径、蛋白或基因。在一实施例中，图1B中说明的处理器还包括第一应用程序，用于计算和识别的单试剂混合物关联的细胞表现型改变中所涉及到的细胞路径、蛋白或基因的似然性。利用提取的科学信息确定细胞路径、蛋白或基因。
在图2中，该生物模型可以是计算机可执行的模型，在框206运行该模型，在框208检查它的精确性并且如果需要在框210加以修改。一旦确定该模型是准确的，可以在框212使用它。在Fink等的专利No.5,808,918中说明生物系统的计算机可执行模型的一个例子，该专利的整个内容收录作为参考。希望该模型能支持计算、更新、比较和可视化。
图3示出对试剂混合物(M)在生物系统上的作用假设的细胞路径示例模型。在图3的模型30中，通过和假设生物路径300、302的相互作用试剂混合剂(M)在细胞上起作用。混合物(M)和这些路径之间的弧代表混合物(M)在这些路径上的可能作用。假定混合物(M)在细胞上的整个作用可以用混合物(M)在这二个路径的一个或更多个上的作用的组合表达。如本文采用那样，通常把细胞路径理解成，细胞成分的集合是和该集合中的每个细胞成分按照某种生物机制受该集合中的一个或更多的其它细胞成分的影响相关的。构成特定细胞路径的细胞成分可以从细胞生物状态的任何一个方面描述，例如从转录状态，或从翻译状态，或从活动状态，或者从生物状态的混合方面。
细胞路径的细胞成分可以包括mRNA水平，蛋白丰度，蛋白活性，蛋白或核酸改变程度(例如，磷酸化或甲基化)，这些类型的细胞成分的组合，等等。通过某些生物机制每个细胞成分受该集合中的至少一个的其它细胞成分影响。不论直接地还是间接地，一个细胞成分对另一个的影响用二个细胞成分之间的一条弧表示，并且整个路径用一个把各细胞成分链接到该路径的弧网表示。
在图3中，生物路径300包括蛋白P1(即，例如P1的丰度或活性)以及基因G1、G2和G3(即，例如mRNA转录水平)。生物路径300还包括用把P1引到这三个基因的弧表示的蛋白P1在这三个基因上的直接或间接的影响。该影响例如可能由于蛋白P1可以和这些基因的启动子结合并且增加它们的转录本的丰度而造成。在图3中还示出细胞路径302。在该路径中，蛋白P2和P3都直接影响基因G。基因G转而可能间接地影响基因G4、G5和G6。
为了确定某些路径，可以在存在引发细胞中的表现型改变的单试剂混合物下测量特别感兴趣蛋白或基因以及细胞生物状态的各个方面，例如转录状态、翻译状态或活动状态。这对应图1B的框122。在一个例子中，通过在存在着识别的单试剂的混合物下识别细胞所表达的基因和/或蛋白可以识别细胞路径或机制。在另一个例子中，通过在存在着识别的单试剂的混合物下识别细胞上活化的受体可以识别细胞路径或机制。
图4示出适于实现图1到3说明的方法的计算机系统的一个实例。在方块图40中，计算机系统400示出为在所示的实施例中包括内部部件并且与外部部件链接。这些内部部件包括和主存储器404互连的处理器402。在一个实例中，计算机系统400可以是时钟速率为200Mhz或更高的并带有32Mb或更大的主存储器的英特尔公司的奔腾(Pentium)处理器。外部部件可以包括一个或更多的硬盘406，它们典型地和该处理器以及存储器封装在一起。外部部件还包括接口板405、微孔板读出器407以及微孔阵列409，它们一起允许向计算机系统400传送试验数据。外部部件还包括机器人系统411，其根据用户选择的统计设计把试验因子，例如图4中示出的十种细胞外基质蛋白(ECM)置入微孔阵列409的受器中。
其它外部部件可包括可以是监视器和键盘的用户接口部件408，连同可以是“鼠标”的指点器件410，或其它图形输入部件(未示出)。典型地，计算机系统400还可以和网络链路412连接，该链路可以是至其它本地计算机系统、远程计算机系统或因特网的以太网链路的一部分。网络链路412允许计算机系统400和其它计算机系统一起共享数据和处理任务。
在存储器404中装入若干标准的和业内人士周知的软件组件以及若干对本发明的实施例特定的软件组件。这些软件组件共同使得计算机系统400根据本发明的至少一个实施例的方法工作。这些软件组件典型地存储在硬盘406中。软件组件414代表操作系统，其负责管理计算机系统400和网络互连。适用的操作系统的实例是视窗98或视窗NT。设置软件组件415以分析来自微孔板读出器407的图象，而软件组件416代表系统400上常规存在的普通语言和功能，以辅助用于实现专用于该实施例的方法的程序。可以用来编程这些分析方法的语言包括Java，但是也可以包括C、C++、Fortran，Visual Basic或其它计算机语言。
在一个实例中，可以在包括要使用的算法的数学软件包中编程该方法，该以允许方程的符号输入和处理的高级规范，从而用户不必程式化地编程各个方程或算法。这样的软件包括可从Mathworks(Natick，MA)买到的Matlab，可从Wolfram Research(Champaign，IL)买到的Mathematica，可从Mathsoft(Seattle，WA)买到的S-Plus，可从Mathsoft(Cambridge，MA)买到的MathCAD，以及可从RFoundation买到的“R”。从而，软件组件418代表按过程式语言或符号软件包编程的方法。
在图4的系统中，软件组件418还包括若干如图5的方块图50示出那样彼此交互的软件组件。软件组件500代表数据库，其最好是一个含有操作计算机系统400所需的数据的集成或联合数据库。这种数据最好包括统计设计、统计设计的计算机表达、试验数据、算法结果、测试的特定试剂的名称、测试的试剂的量和/或浓度、以及试验中要使用的孔的位置。
软件组件502代表用户接口(UI)，其最好是图形用户接口(GUI)，它是表示操作系统，例如视窗2000或X11的图形方式。用户接口502为计算机系统400的用户提供有关统计设计、专用试剂、试剂的浓度和/或量、以及试验数据可选的控制和输入。该用户接口还可以包括用于从硬盘驱动器406，从可移动媒体(例如CD-Rom)，或者从在诸如互联网的网络上和该直接系统通信的不同计算机系统装入例如试验数据的信息的手段。
软件组件504代表可以称为“UI服务器”的控制软件，其控制该计算机系统的其它软件组件。软件组件506代表包括执行这些分析方法的算法的数据简化和计算组件。例如，构件506可以包括比较获得的试验数据和统计设计以识别最佳混合物组和/或最佳试剂的算法。数据可被输入到软件中并且自动地和统计设计链接，从而数据是被完全注释的并且对于统计分析是准备就绪的。另外，组件506可以包括对多次试验比较混合物或试剂的性能以确定趋势或模式的算法，可存储该趋势或模式并且若需要可周期地更新。在一实施例中，软件组件506包括线性回归算法。这是一种对统计设计中使用的每种特定试剂估计系数的方法。
软件组件418还可以包括用于生成统计设计的计算机表达的软件组件508，以及用于机器人系统的、根据数据库500中存储的统计设计把试剂正确地置入阵列409的各孔中的软件组件510。例如，用户可以通过用户接口502选择选项以产生计算机文件，这些文件可以输入到机器人样本准备平台，例如Tecan Genesis的Biomek FX、Biomek2000中或者任何类似平台中。还可以利用这些计算机文件自动地准备微孔阵列上的正确试验条件，培养细胞，以及完成液体分配、液体回收或清洗步骤以进行表现型的化验。
还可以在远离实际进行试验的实验室的顾客位置处实现上面说明的方法。这可能涉及基于环球网(web)的接口或者向顾客分发胖客户软件应用程序。试验室和顾客之间的交互水平可以是不同的。例如，顾客可以完成控制该进程，或者作为可替代方案，顾客只能周期地就获得最优试剂混合物的进展接收来自实验室的报告。
现参照图6，图中示出示例的试验孔60和65，每个孔包括设置在阵列(未示出)中的受器10。受器10包括可被预处理过的表面12。在一个实例中，表面12是氨基等离子体处理过的，从而形成可以在其上附着试剂固定材料16的富胺表面14。如后面会进一步说明的那样，试剂固定材料16最好是和胺化表面14偶联的生物相容性聚合物。
在示出的实施例中，单试剂20例如20a-20d的混合物18共价地固定到试剂固定材料16上。但是，要试验的一些或者全部试剂可以在溶液之中，而不是结合到培养表面上。在本方法的一个例子中，单试剂的混合共价地固定到培养表面上的试剂固定材料上，例如受器表面或受器内含有的支架上，在又一例子中，单试剂的混合可以被动地吸收到培养表面上。此外，该混合中的一些或者全部单试剂可以在溶液中，并且如前面说明那样适当的用于试验的试剂包括但不限于生长因子，细胞外基质分子，肽，激素和细胞因子。另外，可以对孔添加作为试剂的小分子、金属、螯合剂或酶。
根据后面更详细讨论的统计设计把单试剂20的混合置入各受器10中。如图6中所示，受器10a中的试剂20a-20d的组成和第二受器10b中由单试剂20e-20h构成的组成不同。但是，应注意，一个以上的受器可以包含相同的试剂。例如，一种给定的试剂在由其它试剂的某种组合的包围下可能对达到期望的细胞命运具有积极的作用，而当由不同的试剂组合包围时该同一种试剂可能对达到期望的细胞命运具有中性作用或者没有作用。因此，在和其它试剂的不同组成中提供某种试剂在评定这些效应上是有益的。
再次参照图6，一旦根据统计设计以不同的混合把各试剂置入不同的受器10中，这些混合物18和完整的细胞22接触。各试剂20和各细胞22结合并且能在接触的细胞中产生期望的生物响应。根据获得的试验数据确定在该细胞类型中引发期望的响应时给定的试剂混合物或者该混合物中各种试剂的效果。该数据可以利用包括但不限于免疫细胞分析、显微术或功能分析的方法获取。
现参照图7至9更详细地说明统计设计的各个方面。尤其参照图7，各受器10示成处于图7的布局70中，并对应于一个微孔阵列24，例如由行A-H和列1-12组成的96孔板。如图7中所示，通过类因子名表示图6中的单试剂20或混合物18的身份，其中这些因子是试验中的变量。例如，在图7中示出的实施例里，类因子1-10代表栏28中指示的十种单细胞外基质蛋白。在该实例中，类因子1是胶原蛋白I，类因子2是胶原蛋白III，等等。这些因子中的每一个可和一个或更多的其它因子组合以便为该板布局产生各种混合。
现参照图7中示出的实施例说明图8A、8B、9A和9B，其中每个类因子1-10对应于给定浓度或量(即因子水平)的单种试剂。
如图8A和8B中所示，呈现一种情景，其中把受器10内的总液体容积划分成10个容积相等的间隔32。96孔板的每个孔可以包含有全部十个因子(例如，各个单试剂)或者包含这些因子的子集。如图8A中所示，在情景80下，存在全部十个因子并且所有十个因子占据一个液体间隔32。在图8A中示出的孔10中的总因子浓度从而为[10/10]＝[1]这对每个孔提供等同于[1]的总因子浓度。
图8B表示同一96孔板上的不同孔情景。在情景85中，只呈现十种因子中的五种。同样，把液体容积划分成十个相等的间隔32。在85中，当存在某个因子时，用该因子填充液体间隔。但是，在85中，十个容积间隔中的五个不充填因子而是填充“位置占有物”例如培养基。在图8B中，总因子浓度等于[5/10]＝
从而，在图8B中示出的孔里总因子浓度等同于每个孔为
。80中的总因子浓度不等于85中的总因子浓度。从而，每个受器中试剂组的总浓度可以是不同的。另外，在80以及85两者中，各孔之间单个因子的浓度是相同的。例如，因子1(其可代表单种胶原蛋白I配体)的浓度在80的孔中以及85的孔中是相同的。
现参照图9A和9B，呈现了另二种情景，其中对表面化学要求给予特别考虑。具体地，在这些情景中孔之间保持因子的总密度不变，但仅允许在孔之间改变因子成分。换言之，孔之间因子的浓度可以是不同的，但是每个孔总体上具有相同量的固定的因子。
如图9A和9B中所示，根据存在的因子的数量划分给定孔中呈现的总液体容积。同样，出于简明，可以假定一个因子对应于一个单种试剂，尽管所示出的实施例不受一个单种试剂的限制。如图9A的情景90所示，存在全部十个因子并且总因子浓度等于[10/10]＝[1]总因子浓度等同于每个孔为[1]。
在图9B的情景95中，只存在十个因子中的五个，但是这五个因子中的每个因子的液体体积32是图9A中示出的每个因子的体积32的二倍。因此，图9B中示出的总因子浓度和图9A中示出的总因子浓度相同，即每个孔的总因子浓度等同于[1]。
从而，每个受器中试剂的总浓度是相同的。根据图9A和9B可以看出，尽管图9A中示出的孔和图9B中示出的孔之间的总因子浓度是恒定的，而这些孔之间单个因子的浓度可以是不同的。具体地说，对于可以用胶原蛋白I表示的因子1，图9B中的该单试剂的浓度应是图9A中示出的浓度的二倍。从而，在又一些其它实例中，受器之间各种试剂的浓度可以不同。应注意，图8和9中描述的每种情景是可行的，并且可以用于筛选单试剂的混合物。
上面说明的方法利用一种格式例如微孔阵列并列地就它们与给定细胞类型键合并在细胞中引发期望的响应的能力方面筛选各种试剂的多种不同混合。该方法包括根据统计设计把试剂的不同混合物置入多孔板的一些选定的孔中。该方法还包括把单种试剂置入其它孔中的可任选步骤。
该方法还包括向各个孔递送包含细胞类型的液体样本。在不同孔中细胞和样本之间的适当培育时间之后，可以直接或间接地检测细胞和孔构件之间相互作用的证据。例如，可以利用功能化验、免疫细胞化学或显微方法获取数据，以测量诸如抗体分泌、细胞数量和抗体分泌峰值的响应。
供和本发明的各实施例一起使用的适合的统计设计包括但不限于以下设计分式因子设计、D最优设计、混合设计和Plackett-Burman设计。统计设计还可以是基于收敛准则的空间填充设计、格栅设计或拉丁方格设计。
如前面说明那样，试剂可以结合在培养表面(例如受器表面或支架表面)上或者可在溶液中。例如，在一个例子中，培养表面(可以是预处理的)涂着试剂固定材料。希望试剂固定材料是不支持细胞附着并且可以充当培养表面和试剂之间的灵活链接或系留的生物相容性聚合物。适当聚合物的例子包括诸如聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇、聚羟基乙基异丁烯酸酯、聚丙烯酰胺的合成聚合物和诸如透明质酸和藻酸的天然聚合物。
培养表面(例如孔表面)是从以下但不限于以下选择的聚苯乙烯，聚乙烯乙烯基乙酸酯，聚丙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚环氧乙烷，玻璃，多硅酸盐，聚碳酸酯，聚四氟乙烯，碳氟化合物以及尼龙。培养基也可以全部地或部分地包括生物可降解材料例如聚酐，聚乙醇酸，诸如聚乳酸、聚乙醇酸及聚乳酸-乙醇酸共聚物的聚羟酸，聚原酸酯，聚羟基丁酸酯，聚磷氮烯(polyphosphazene)，聚丙基富马酸酯以及生物可降解聚氨基甲酸乙酯。
还可以预处理培养表面。例如，可以通过氨环境中对聚合物的等离子放电处理准备承载伯胺的细胞培养表面。在一个例子中，利用标准固定化学，例如如前用引用的共同待决、共同拥有美国专利申请No.10/259,797中说明那样，可以把试剂固定材料共价地附着到这些胺化表面上。
商业上采用的形成组织培养处理的聚苯乙烯的两种处理是还称为电晕放电的大气等离子体处理和真空等离子体处理，业内人士周知这二种处理。等离子是气体离子和自由原子团的高活性混合物。可以利用氨基等离子体处理或氧/氮等离子体处理形成富胺表面，利用上面引用的美国专利申请No.10/259,797中说明的碳二亚胺生物偶联物化学通过羧基可以在该富胺表面上偶联生物相容性聚合物例如透明质酸(HA)或藻酸(AA)。即使细胞培养物中存在高浓度例如10-20％的血清蛋白，所形成的表面也不允许细胞附着。
一种可以用于通过试剂固定材料共价链接试剂的预处理过的组织培养聚苯乙烯产品的例子是可从Betton Dickinson Labware买到的PRIMARIATM组织培养产品，其是利用对聚苯乙烯的氧氮等离子体处理形成的并且其造成掺入含有氧和氮的官能基，例如氨基和酰胺基。
利用蛋白/肽上的胺基以及HA或AA上的羧基或者HA或AA上的通过利用诸如高碘酸钠的氧化形成的醛基，可以顺序地共价地把诸如细胞外基质蛋白、肽等的试剂偶联到HA或AA表面上。
在一个例子中，通过E.Junowicz和S.Chanm在Biochimica et.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)上标题为“TheDerivatization of Oxidized Polysaccharides for ProteinImmobilization and Affinity Chromatography”发表的文章中描述的高碘酸盐过程可以活化人胎盘透明质酸的末端糖，该文的整个内容收录作为参考。该过程必须对透明质酸溶液添加高碘酸钠或钾，从而活化末端糖，该末端糖可以和试剂上的自由氨基例如细胞外基质蛋白上的末端氨基化学地交联。
在另一个例子中，生物相容性聚合物例如HA或AA上的自由羧基利用作为交联剂试剂的碳二亚胺可以化学地和该试剂上的自由氨基交联。业内人士周知其它的标准固定化学术，它们可以用于使培养表面和生物相容性聚合物结合并且使生物相容性聚合物和试剂结合。在M.Dekker，NY，1991出版的Richard F.Taylor编辑的“ProteinImmobilizationFundamentals and Applications”(其整个内容收录作为参考)或者上面引用的共同待决美国专利申请No.10/259,797中提供补充的细节。
利用标准的固定化学术可以通过生物相容性聚合物把试剂约束到胺化组织培养表面上或者可以通过生物相容性聚合物约束到羧化表面或羟化表面上。附着试剂的例子包括溴化氰、琥珀酰亚胺，醛，甲苯磺酰氯，抗生物素蛋白-生物素，可光致交联试剂，环氧化物和顺丁烯二酰亚胺。同样，应注意这些试剂可以呈现在溶液中不必和培养表面结合。
如前面说明那样，本方法提供包含在一些选定受器中的与培养表面结合或者可以处在溶液中的试剂混合物。此外，其它受器可以含有单独试剂，并且可以在任意期望的比例下组合这些试剂。可以例如通过要分配到受器里的组成中的试剂浓度控制各受器中存在的不同试剂的相对数量。
另外，在通过生物相容性聚合物使试剂共价地附着到受器表面上的情况下，可以通过调整结合到培养表面上的生物相容性聚合物的能力控制装载密度。这可以通过控制聚合物上的可以和试剂起反应的活性基团的数量或者通过控制培养表面上的生物相容性聚合物的分子密度实现。此外，可以首先单独地使试剂和生物相容性聚合物(即系绳)链接，接着可以在期望的比例下混合这些“装入的”系绳并且附着到预处理后的基底上。
试剂可以在溶液中和/或和表面结合。例如，可以通过生物相容性聚合物把各试剂共价地固定到最好是富胺的预处理过的组织处理表面上。替代地，可以通过表面对试剂的被动吸收把这些试剂固定到受器表面上。还可以把各试剂预先固定到固体支持例如珠上，然后再把珠添加到受器上。随后可以检测和受体中的珠接触的细胞类型的响应。可以组合含有单种试剂的珠以形成试剂混合物。替代地，可以将单试剂的混合物固定到珠上。
还可以把各试剂固定到或者渗透到支架上，可把支架放到受器中并且接着和含有细胞的液体接触。在共同待决、共同拥有的于2002年9月30日提交的美国专利申请No.10/259,817中描述了供上面说明的实施例使用的适当支架以及在其上或在其中固定试剂的方法，该申请的整个内容收录作为参考。
上面说明的各实施例中使用的受器可以取任何有用的形式，但希望是微孔或管。这种微量滴定孔和管的配置是特别有用的并且允许在有效和方便的方式下同时自动进行大量样本的检验。由于自动加样器和板读出器，微量滴定孔能高度自动化。也可以使用其它固相，尤其是其它塑性固体支持。
在一个例子中，这些受器构成96孔微量滴盘定板(即，微孔阵列)的各个孔。业内人士周知用于试剂添加和清洗步骤的自动移液设备以及用于这种微量滴定板的已有彩色读出器。这种自动部件的一个例子包括移液台和检测设备(例如板读出器)，其中该移液台能在恒温环境(即温控环境)下在规定的时间点顺序地完成对各孔添加和移出试剂的操作。
如前面说明那样，这些实施例中使用的试剂包括生长效应因子分子，它们把受体固定到细胞表面上或者通过离子通道或迁移吸收受体并且调节目标细胞或者组织的生长、复制或分化。在一个例子中，这些试剂是细胞粘附配体和/或外来因子。在另一些例子中。这些试剂可以是细胞外基质蛋白、细胞外基质蛋白片段，肽，生长因子，细胞因子以及它们的组合，包括下面更详细说明的包含着用来优化细胞培养条件的二种和三种蛋白胨的集和子集的例子。
优选的试剂是生长因子，细胞外基质分子，细胞因子，肽，激素，金属，螯合剂或酶。生长因子的例子包括但不限于脉管内皮衍生生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生成因子(TGFα，TGFβ)，肝细胞生长因子，肝素结合因子，胰岛素样生长因子I或II，成纤维细胞生长因子，红细胞生成素神经生长因子，骨形成蛋白，肌肉形成蛋白，以及业内人士知道的其它因子，在Springer-Verlag，NY出版的由M.B.Sporn和A.B.Roberts编辑的“Peptide Growth Factors and Their Receptors I”一书中说明其它的适用生长因子，该书的整个内容收录作为参考。
可以利用业内人士周知的方法从组织中分离这些生长因子。例如，可以通过重组手段使生长因子从组织中分离或者产生生长因子。表皮生长因子可以从鼠的颌下腺分离并且Genentech公司(San Francisco，CA)重组地产生TGF-β。还可以从以下供应商买到天然的和重组形式的其它生长因子，例如Sigma Chemical公司(St.Louis，MO)，R&D系统公司(Minneapolis，MN)，BD Biosciences公司(San Jose，CA)以及Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。
各实施例中使用的细胞外基质分子包括玻连蛋白，腱生蛋白，血小板反应蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白和蛋白多糖。在Analytical Biochemistry 1661-13(1987)登出的Kleinman等的标题为“Use of Extracellular Matrix Components for Cell Culture”一文中描述了其它的细胞外基质分子。
可用于上面说明的方法中的其它试剂包括细胞因子，例如白细胞介素、GM-集落刺激因子以及诸如胰岛素的激素。在前面引用的文献中说明这些试剂并且是市场上可买到的。
各实施例中使用的细胞可以是任何可潜在地响应试剂的或者生长需要试剂的细胞。例如，细胞可以从建立的细胞系中得到或者从隔离的组织分离。合适的细胞包括大部分上皮和内皮细胞类型，例如实质细胞，诸如肝细胞，胰岛细胞，成纤维细胞，软骨细胞，成骨细胞，外分泌腺细胞，肠源细胞，胆管细胞，甲状旁腺细胞，甲状腺细胞，肾上腺-小丘脑-垂体入口的细胞，心肌细胞，肾上皮细胞，肾小管细胞，肾基膜细胞，神经细胞，血管细胞，形成骨、软骨、平滑肌和骨胳肌的细胞。
其它有用的细胞可包括干细胞，它们可响应选定的试剂混合物历经表现型上的改变。另一些适当的细胞包括血细胞，脐带血衍生细胞，脐带血衍生干细胞，脐带血衍生先祖细胞，脐带衍生细胞，胎盘衍生细胞，骨髓衍生细胞以及来自羊水的细胞。利用受器例如96孔微量滴定板的孔中的试剂可以遗传工程化和/或培养这些细胞。这些细胞的培养可以采用业内人士知道的许多细胞培养技术中的任何技术，例如在Wiley-Liss公司(NY，1994)出版的Freshney的“Cell Culture，A Mannal of Basic Technique”，第三版中说明的技术。业内人士周知其它细胞培养基和技术并且也可以用于上面说明的本发明的实施例中。
可以在溶液中的或者附着到诸如微量滴定板的标准组织培养容器上的试剂存在下培养细胞。还可以利用约束到珠或纤维(最好直径在10微米量级)上试剂在悬浮液中培养细胞。当添加到培养基中，这些颗粒会附着在细胞上，从而刺激它们的生长并且提供附着信号。
在一种特定应用中，上面说明的系统和方法可应用于根据各种响应识别优化细胞培养条件的二种或三种蛋白胨的最佳子集。从列出几种可能的蛋白胨开始，根据各种响应，例如抗体分泌、细胞数量和达到抗体分泌峰值的时间，可以开发识别优化细胞培养条件的二种或三种蛋白胨的最佳子集的优化策略。以下刊物进一步讨论优化技术发表于Journal of Bimolecular Screening，5(4)213-225，August 2000的Taylor等人的“Automated Assay Optimization with IntegratedStatistics And Smart Robotics”；发表于Drug Discovery Today，6(12)637-646，June 15，2001的Wolcke等人的“Miniaturized HTSTechnologies-μHTS”；以及发表于Drug Delivery Today，1(7)277-286，July 1996的Lutz等人的“Experimental Design ForHigh-Throughput Screening”，它们的整个内容各收录作为参考。
可以作为一种自动培养基优化技术提供该系统和方法，以使用户能利用MPM/CATSBA软件和机器人液体处理平台优化培养基成份(即因子)。利用这些特定因子，该软件可以自动建立多孔板格式下的统计设计的试验。接着该软件生成必要的文件以利用机器人液体处理平台(例如，Biomek FX，Biomex 2000，Tecan Genesis，或任何类似平台)准备正确的试验条件。接着可从利用该软件以及其驻留的数据库自动分类和分析各种格式的数据(即，荧光性，吸收性，细胞计数，等等)。该软件的用户可以接着在自动形式下完成所有相关的统计分析并且自动产生所有相关的报告并存储在数据库中。在完成所有相关统计分析后，用户具有为了元分析和数据挖掘组合来自多次试验的结果的能力。
在该例子中，该系统和方法在第一步骤中启动基本细胞培养条件的化验过程和判定。具体地说，用户通过GUI在该软件(即MPM/CATSBA)中规定因子(即蛋白胨)以及它们的浓度，如图1A的框100中指出那样。如框107中所指示，用户选择适当的统计设计，该软件自动地建立包含特定因子和它们的浓度的正确试验方案，如框108中指出那样。接着用户在该软件中选择一个选项，该选项自动地建立可通过机器人样本准备平台(例如，Biomek FX，Biomek 2000，Tecan Genesis，或任何类似平台)输入的必要的计算机文件，如框112指出那样。
在第二步骤中，在96孔板中提供稀释系列，以便一次一个地确定蛋白胨的最优浓度。如图1B的框114中指出那样，利用这些计算机文件自动地在该96孔板上准备正确的试验条件。一旦正确地把各试剂置入各孔中，在框116该机器人系统把含有全部细胞的液体分配到该微孔阵列的各孔中。化验结果输入到该软件中并且自动地和各试验的描述链接，从而数据是完全被注释的从而准备用于统计分析。
具体地，在框118获取将指示细胞的表现型改变的试验数据，并在框120将该试验数据存储在数据库中，从而使试验数据与设计的计算机表达链接。接着在框122，利用一个包含用于比较存储的试验数据与存储的统计设计的算法的处理器，以识别引发期望的生物响应(即在细胞中引发表现型改变)的最佳浓度。该算法的比较结果可在框124存储在数据库中并对用户显示，并且可以周期地对其更新。
96孔板中产生的试验用于识别二种和/或三种蛋白胨的最佳子集，并在摇瓶中检验。即，96孔板中的最优试验确定最佳子集中的蛋白胨的最佳浓度，用摇瓶验证。
在摇瓶检验后得出相对于客户培养基的最佳子集/最佳浓度以及96孔板的适当对照。再次回到图1A和1B，包含客户培养基以及所使用的适当对照的数据库可以是一个集成的或者联合的数据库。在框126，可以利用最佳混合的子集或者最佳试剂组的子集重复该进程的各个步骤。另外，如果需要，可以利用最佳试剂组的组合子集以及来自最佳混合的试剂组子集重复这些步骤。另外，在框128，可以在改变最佳混合组中的各试剂的浓度和/或数据的情况下重复该进程的各步骤，以通过补充的验证和质量控制(QC)加大最佳条件。可以最优地使用框122中的从算法比较获取的任何信息以在框130建立或修改生物模型。
用户可以在自动方式下对该软件应用提供的信息进行所有相关的统计分析。接着可以生成报告和把结果存储在数据库中。根据统计分析的结果，用户可以回到第一步骤以开始下次试验或者可能进入加大最佳培养基配方的操作。
在该特定例子中，这些试剂或因子限于蛋白胨，但是上面说明的系统和方法通常可应用于可对细胞培养基添加的任何试剂或因子。在上面说明的实施例的自动优化应用中，下面更详细说明的结果表采用八蛋白胨组，但是可以改变蛋白胨的数量，尽管这会要求修改具体的设计参数但是不会影响整个策略。
该特定的例子指向检测二种或三种蛋白胨的最佳子集组，但是最佳子集评估中包括的蛋白胨的数量可以增加或者减少，尽管这会如上面指出那样可能要求修改特定设计参数不过策略是一样的。另外，下面的例子和96孔板相结合，但是板的实际格式是可改变而整个策略仍是有效的。如果使用更大或更小的板，需要相应地修改设计。
在该例中，该系统和方法指向每次二种或三种蛋白胨的蛋白胨以确定哪些子集最佳。在八种蛋白胨下，其中每次提供至少二种不同的浓度水平，如表1中所示该实施例可完成所有高浓度和低浓度(即高/高和低/低)下的双式组合(即8中选2＝28)，并留下几个孔用作对照。另外，由于蒸发不使用外侧的孔。例如，在表1中，在3.0mg/mL(低浓度CG大豆)和4.0mg/mL(高浓度CG大豆)的浓度下评估CG大豆，而其余的蛋白胨例如植物蛋白胨浓度分别为9.0mg/mL(即低浓度植物蛋白胨)和10.0mg/mL(即高浓度植物蛋白胨。)
在第二板上，如表2中所示，该系统和方法指向其中一块板上每种蛋白胨各个单种浓度下的三式组合(即8中选3＝56)，并且提供几个孔用作对照。每个板上的对照允许板的比较并且允许补充的统计分析。例如，在表2中，CG大豆浓度为3.0mg/mL(即单种CG大豆浓度)下和别的蛋白胨，例如9.0mg/mL浓度下的植物蛋白胨(即单种植物蛋白胨浓度)和2.0mg/mL浓度的植物蛋白胨UF(即单种植物蛋白胨浓度)，一起被评估。
在表1中示出的示例阵列中，从八种蛋白胨的组中检测二种蛋白胨的最佳子集，其中一些控制孔和重复孔来自板2。
表1


在表1中，评估中使用八种蛋白胨，包括CG大豆，植物蛋白胨，植物蛋白胨UF、3，精选大豆蛋白胨，小麦，酵母分离物(yeastolate)以及酵母分离物plus。在低浓度或者高浓度下包含各种蛋白胨。例如，在包括充当低浓度的3.0mg/mL以及充当高浓度的4.0mg/mL的浓度下使用CG大豆。这些值可以在蛋白胨之间改变，如作为对比所示，在包括充当低浓度的9.0mg/mL以及充当高浓度的10.0mg/mL的浓度下使用植物蛋白胨。孔IP编号指示其中放入指出的蛋白胨浓度组合的微孔阵列的孔。
如表1中所示，根据自动过程中在图1A的步骤100-112中建立的计算机表达，机器人系统把选定的期望蛋白胨浓度的组合置入微孔阵列中的各孔中。如上面指出那样，表1代表一种使用八种蛋白胨的应用，其为把所有二种蛋白胨(即，从8选2＝28)的低浓度和高浓度的双式组合置入单个板的各孔中产生充足的空间。
该系统和方法接着获取指示所接触的细胞中的表现型改变的试验数据。具体地，在该例子，指示数据包括抗体的生长(即增殖)和分泌(即IgG分泌/细胞增殖)。接着该系统可以以和试验设计的计算机表达相关联的方式把试验数据存储到数据库中。这样做，可以接着应用一个算法比较试验数据和统计设计以识别最佳蛋白胨组合，并且更具体地识别一种最佳的双蛋白胨组合以包含在后面更详细说明的子集浓度评估中。接着可以对来自八种蛋白胨的组中的三种蛋白胨的组合重复该过程。
在表2中示出板2的示例阵列，其中在以来自板1的若干控制孔和重复孔作为补充的情况下检测三种蛋白胨的最佳子集。
表2


在表2中，评估中再次使用表1的八种蛋白胨，包括CG大豆，植物蛋白胨，植物蛋白胨UF，3，精选大豆蛋白胨，小麦，酵母分离物以及酵母分离物plus。在该评估中，在每种蛋白胨各为单种浓度下包含各种蛋白胨。例如，在3.0mg/mL的单浓度值下使用CG大豆。如上面指出那样，蛋白胨之间浓度值可以改变，如对植物蛋白胨比较示出那样，在9.0mg/mL的单浓度值下使用该蛋白胨。还如上面指出那样，孔ID编号指示其中置入指示的蛋白胨组合浓度的微孔阵列孔。
如图2中示出那样，机器人系统再次在自动过程中根据图1A的步骤100-112建立的计算机表达把期望的蛋白胨浓度选定组合置入微孔阵列的各孔中。如上面指出那样，表2代表一种使用八种蛋白胨的应用，其为把各具有单浓度的三种蛋白胨的三式组合(即从8选3＝56)置入单个板的各孔中产生充足的空间。
如表1一样，该系统和方法接着获取指示相接触的细胞中的表现型改变的试验数据，并在与该试验设计的计算机表达相链接的情况下把试验数据存储在数据库中。这样做，可以接着应用一个算法比较试验数据和统计设计以识别最佳蛋白胨组合，并且更具体地识别三种最佳三蛋白胨组合以包含在后面更详细说明的子集浓度评估中。
在该例子，应用该系统和方法以确定从八种的组中选出的二种和三种蛋白胨的子集组合的最优浓度(即优化)。上面的最佳子集试验的结果提供数个二种或三种蛋白胨的组合，它们一起被确定为是这些检验中最佳的。如下面更详细说明那样，会对这些蛋白胨的组合进行另一次自动试验，在该试验中利用图1B的框126和/或128中指出的标准统计方法为每个子集确定最佳浓度。
下面的表3的方案是一个用于优化板的通用模板，以检查从表1产生的一个双蛋白胨的最佳子集以及从表2产生的三个三蛋白胨的最佳子集。不同集中的蛋白胨可重叠。对于每个蛋白胨集，在板中布署一个中央混成设计。利用该板的内部的60个孔，可以对二种和三种蛋白胨的最佳子集评估最优浓度。
表3


在表3中，各值反映所使用的蛋白胨的编码等级。表3中的蛋白胨是按类因子FO1、FO2、......、F11指定的。尽管在该例中只包括八种蛋白胨，在不同的子集中蛋白胨可以重叠。在该例子中，FO1和FO2代表从表1确定的现在要优化的二种蛋白胨的该最佳子集中所包含的蛋白胨。子集FO3-FO5、FO6-FO8以及FO9-F11代表从表2确定的现在要优化的三种蛋白胨的三个最佳子集。
表3的孔ID编号指示其中置入所指出的蛋白胨组合的浓度的微孔阵列的孔，列“设计ID”指示哪些子集浓度是在改变的。例如该设计ID列对于所有其中改变二种蛋白胨的子集的浓度的孔具有等于1的值。该设计ID列对于其中改变三种蛋白胨的三个子集的浓度的孔分别具有为2、3和4的值(即，F03-F05，F06-F08，以及F09-F11)。在表3中出现NA，则说明在该孔中不包含所指示的因子或蛋白胨。
参照表3，第一列指示96孔板中每次试验运行的孔ID编号。在该例中存在60次运行。表3中标记为“F01、F02、......、F11”的列中的数字(-1.41，-1，0，1，1.41，等)分别表示该因子或蛋白胨的等级或浓度的编码值。根据收集到的信息，对每种蛋白胨判定可能的最优浓度的范围，在该范围内相信存在着最优浓度。利用下面将更详细说明的例如响应表面方法学(RSM)的技术对该范围分配相对值。
在该例中，对于列F01和F02，值-1.41和1.41分别对应于被假定跨越最前二种蛋白胨的可能的最优浓度范围的最大浓度和最小浓度。蛋白胨的和编码值-1、0、1对应的浓度位于最大和最小浓度-1.41和1.41之间，并且可以通过简单的线性变换确定。例如，编码值零对应于最大和最小浓度之间的中间浓度。
对于列F03到F11，值-1.68和1.68对应于被假定为跨越按F03至F11分配的相应的蛋白胨的可能最优浓度范围的最大浓度和最小浓度。可以如上面说明那样确定和-1、0以及1对应的浓度。后面会更详细地说明定义这种范围并且接着分配相对值的过程的一个具体例子。
例如，如果从表1发现二种蛋白胨的最佳组合是浓度为3.0mg/mL的CG大豆和浓度为9.0mg/mL的植物蛋白胨，则可以接着把这些值应用到表3的优化。如上面对表3指出的那样，F01和F02代表包含在从表1确定的要被优化的二种蛋白胨的最佳子集中的蛋白胨。
在优化试验中，确定每种蛋白胨的浓度范围，确信最优浓度存在于该范围中并且对该范围分配相对值。在确定该范围时，可以把目前的最佳值(即来自表1)选成为中心值，并且接着可以选择更大和更小的值，以便为了探查最优值而定义围绕这些当前最佳值的范围。该范围应足够宽以包括对真的最优选值的最佳估计，但又应足够窄以提供好的统计模型。在许多应用中这可能要求熟练用户，例如细胞生物学家和统计学家进行输入。
对于上面的例子，可以根据下面定义的范围对用于表3中的CG大豆的范围规定相对值。
X0＝0→对应于3.0mg/mL浓度的CG大豆X-1＝-1→对应于2.0mg/mL浓度的CG大豆X+1＝+1→对应于4.0mg/mL浓度的CG大豆其中X0代表用于CG大豆的范围的中心，X-1代表下部范围中的增量，而X+1代表上部范围中的增量。编码值中一个单位的变化为浓度值中的1mg/mL，从而X-1.41＝-1.41→3.0-(1.41×1.0)＝1.59mg/mL浓度的CG大豆X+1.41＝+1.41→3.0+(1.41×1.0)＝4.41mg/mL浓度的CG大豆其中X-1.41代表CG大豆的范围的下界，而X+1.41代表该范围的上界。同样，对于植物蛋白胨的值，可以应用相同的过程。
Y0＝0→对应于9.0mg/mL浓度的植物蛋白胨Y-1＝-1→对应于7.0mg/mL浓度的植物蛋白胨Y+1＝+1→对应于11mg/mL浓度的植物蛋白胨编码值中一个单位的变化为浓度值中的2mg/mL浓度的植物蛋白胨，从而Y-1.41＝-1.41→9.0-(1.41×2.0)＝6.18mg/mL浓度的植物蛋白胨Y+1.41＝+1.41→9.0+(1.41×2.0)＝11.82mg/mL浓度植物蛋白胨对表2中找到的三种蛋白胨的最佳组合应用类似的过程。如前面对表3指出那样，子集F03-F05、F06-F08和F09-F11代表从表2确定的要进行优化的三种蛋白胨的三个最佳子集。
例如，如果从表2找出三种蛋白胨的最佳组合是浓度为3.0mg/mL的CG大豆、浓度为2.0mg/mL的植物蛋白胨UF以及浓度为7.0mg/mL的小麦，则可以接着对表3的优化应用这些值。如前面一样，对于应当含有最优值的区段选择一个作为最佳估计的范围。下面给出对这三个蛋白胨范围之一的示例计算。可以根据如下定义的范围对表3中用于小麦的范围分配相对值。
Z0＝0对应于浓度为7.0mg/mL的小麦
Z-1＝-1对应于浓度为6.5mg/mL的小麦Z+1＝+1对应于浓度为7.5mg/mL的小麦从而编码值上中一个单位的变化为浓度值中的0.5mg/mL，由此，Z-1.68＝-1.68→7.0-(1.68×0.5)＝7.0-.84＝6.16Z+1.68＝+1.68→7.0+(1.68×0.5)＝7.0+.84＝7.84在上述实施例的许多应用中，在二个和三个变量的优化试验里可以为同一个因子选择不同的浓度水平。即，在某个因子在二种和三种蛋白胨的最佳组合中都存在并且在表3中的多个位置都使用的情况下，该单种蛋白胨的范围在表3中不必是一样的。
在表3的第一行中提供该例中的类因子名并且它们对应于表1和2中列出的蛋白胨的各种子集。具体地，用从表1中对各种蛋白胨的评估得出的二种蛋白胨的最佳子集里的实际的蛋白胨来替代类因子F01和F02。用从表2中的对各种蛋白胨的评估得出的三种蛋白胨的第一最佳子集里的实际的蛋白胨替代类因子F03、F04和F05，依此类推。由于在多个最佳子集中可能出现同一种蛋白胨，所以该同一个蛋白胨可能对应于多于一个的类因子名F01，F02，...F11。
利用表1和2，机器人系统在自动过程中把具有期望的蛋白胨浓度变化的选定子集置入微孔阵列的各孔中。表3的评估产生足够的空间，用于把具有最小、或低的(即-1.41)、中低的(即-1)、中间的(即0)、中高的(即1)以及最大的、或高的(即1.41)浓度水平的双蛋白胨的双式组合，并以及把具有最小、或低的(即-1.68)、中低的(即-1)、中间的(即0)、中高的(即1)以及最大的、或高的(即1.68)浓度水平的三蛋白胨的三式组合置入到单个板的各孔中。但是这些浓度不必需对应于表1和表2中为同一种蛋白胨示出的浓度，而是如前面指出那样，是假设为跨越特定蛋白胨的可能的最优浓度范围的浓度。
该系统和方法接着获取指示相接触的细胞中的表现型改变的实验数据，并且在具有与该试验设计的计算机表达的链接的情况下把试验数据存储在数据库中。这样做，接着可以应用一个算法比较试验数据和统计数据以识别最佳的蛋白胨浓度值。
可以用一个子集再重复试验，以便获得在细胞中产生期望的响应的最优的因子子集。另外，可以改变各试剂的浓度而重复试验。还可以利用各种统计上具有明显的主效应的单试剂的子集或者通过组合最佳单试剂的子集和最佳混合中识别出的子集来进行相随的试验。
在图18、19和20中示出上面的实施例提供的结果的例子。在图18、19和20中示出二种蛋白胨组合的最佳孔分析。具体地说，分析利用八种培养基成份试验得出的数据，并且最佳孔分析示出三种一贯地具有阳性效果的蛋白胨植物蛋白胨、小麦和精选大豆蛋白胨。
图18示出表1的孔ID编号D10提供的结果，其中浓度为3mg/mL的3和浓度为8.0mg/mL的小麦组合。类似地，图19示出表1的孔ID编号D11提供的结果，其中浓度为3.0mg/mL的3和浓度为3.0mg/mL的精选大豆蛋白胨组合。图20示出表1的孔ID编号C11提供的结果，其中浓度为3.0mg/mL的精选大豆蛋白胨和浓度为8.0mg/mL的麦组合。分析表明，这三种蛋白胨在HB67细胞及IgG分泌和增殖上具有阳性作用。接着可以利用表3的自动优化模板进一步评估这三种蛋白胨的子集以确定最佳浓度。
和常规试验相比可以在较短的时间完成上面说明的实施例。具体地说，可以在单个板(即表1)上评估二种蛋白胨的全部最佳子集，并且可以在另一个独立板(即表2)上评估三种蛋白胨的全部最佳子集。其中包含重复的这二个板提供结果(即子集)，这些结果可以同时地在又一个独立板(即表3)上的单次试验中予以评估。与不在多孔板中进行的常规试验相比，这种自动实现要快得多和有效得多。由于在同一个板上评估所有的每种尺寸(即，二种和三种)的子集，所得到的数据具有更直接的可比性和更可靠。另外，相随的优化试验允许在同一个板上在同一次试验中优化二种和三种蛋白胨的若干子集。这比在分离的板上、分离的时间和/或替代格式的多孔板上进行试验更加有效。
通过使用软件包例如MPM/CATSBA，本发明的上述各实施例可通过自动实现优化策略来消除细胞培养和细胞试验中固有的人为误差。这些实施例允许软件以自动方式实现根据复杂的统计设计进行物理板布局。接着这些复杂的板布局能以比目前更加有效的方式自动进行评估并确定最佳子集问题的解。尤其，在该例中，优化策略的自动实现用于根据抗体分泌、细胞数量和达到抗体分泌峰值的时间有效地识别蛋白胨组合的最佳子集，并且接着识别优化细胞培养条件的最佳蛋白胨浓度。
通过对试验设计的组合了解以及通过机器人自动准备样本，上述实施例把计算机与传统的细胞培养相结合，并且利用该技术优化生物系统，这与简单地优化化验条件是不同的。
利用该软件自动地产生所有板布局、液体处理命令和数据分析功能。这种自动平台为试验进程消除大部分人为误差。在采用该技术之前，人工地把试验编程到机器人液体处理平台中或者手工地在半敞开台上建立试验。由于人的操纵以及编程的错误，这二种试验方法很可能含有固有误差。
另外，MPM软件自动地分析所有数据并且可用于建议相随的优化试验。该系统允许以更有效的多的方式解决更加复杂的培养基优化问题。此外，在设计以及实现上，拾取最佳子集并且联立地优化这些子集的浓度的策略是新颖的。这产生以自动的方式建立复杂的板布局的能力并且导致和人工系统非常不同的试验和观测。例如，在培养基成分的某些组合下可以观察协同作用。
上面的实施例还提供快得多的移液速度，这些都提供更大的成本节约、改进数据分析时间以及机器人编程时间。试剂成本节约是通过以下方式计算的每种试验方法所需的重复次数乘以所需的优化试验次数，接着再用常规结果除以上面的优化结果。
可以从远离进行试验的实际实验室的客户位置实现上面说明的实施例。这可能涉及基于万维网的接口或者涉及向客户分发胖客户软件应用程序。交互水平的范围可以从简单地动态生成显示目前的优化状态的报告到客户完全控制进程。另外，这些实施例可应用于定制的培养基优化服务以及定制的数据、试剂和试验设计管理服务。
下面更详细地说明依据本发明的各实施例的其他统计设计的试验。
例子例1 透明质酸和富胺组织培养表面的偶联Becton Dickinson Labware公司利用氧/氮等离子形成PRIMARIATM组织培养产品。具体地，聚苯乙烯产品的氧/氮的等离子体处理造成含氧和氮的官能基例如氨基和胺基的结合。对于该试验，利用技术上周知的碳二亚胺生物偶联化学(例如在Richard S.Taylor编辑的“Protein ImmobilizationFundamentals and Applications”，M.Dekkerr，NY，1991中说明或者在2002年9月30日提交的共同待决、共同拥的美国专利申请No.10/259,797中说明)通过HA上的羧基把HA偶联到PRIMARIATM多孔板的富胺表面上。
例2 ECM蛋白和透明质酸的偶联ECM试剂共价地附着到来自例子1的约束在培养表面的HA聚合物上。具体地，利用E.Junowicz和S.Charm的“The Derivatizationof Oxidized Polysaccharides for Protein Immobilization and AffinityChromotography”，Biochimica et.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)中说明的高碘酸盐过程通过氧化在HA上形成醛基。该过程要求对HA溶液添加高碘酸钠，以活化末端糖。随后，利用标准固定化学术(例如Richard F.Taylor编辑的“Protein ImmobilizationFundamentals and Applications”，M.Ddkker，NY，1991或2002年9月30日提交的共同待决美国专利申请No.10/259.797中说明的固定化学术)把活化的HA偶联到ECM蛋白上的胺基。
例3 利用统计设计试验(混合设计)同时筛选10种不同的ECM蛋白在本例中该统计设计是混合设计。利用该设计识别在细胞响应上具有阳性作用的因子对或单种因子并且允许我们检查二个ECM之间的交互作用。在该例子，10种各代表一个单“因子”的ECM用来形成ECM混合以置入图7中所示的96孔板的各孔中。这些ECM共价地附着到培养表面上的生物配物聚合物上(见例1和2)。注意，在没有对该试验的统计设计下，为了对给定的细胞类型试验这十种ECM中的一种和另一种，总共需要210(1024)次单试验或者十一个96孔板。
在本例中，选择一个10个粘附配体的组并且选取96孔阵列作为该筛选的格式。为了消除不均匀蒸发产生的边界效应，该试验只使用96孔阵列的60个内孔。由此该板的外行或外列上的孔可用于适当的控制。
根据它们充当细胞培养试剂的常规用途以及市场上的易购性和价格选择以下10种粘附配体胶原蛋白I(CI)，胶原蛋白III(CIII)，胶原蛋白IV(CIV)，胶原蛋白VI(CVI)，弹性蛋白(ELA)，纤连蛋白(FN)，玻连蛋白(VN)，层粘连蛋白(LAM)，聚赖氨酸(PL)以及聚鸟氨酸(PO)。
在表面化学要求的特殊考虑下开发统计设计。具体地，在该试验中采用图9中示出的情景，其中各孔间保持粘附配体的总密度并且只允许改变粘附配体的成分。换言之，各孔间某个单种粘附配体的浓度可以是不同的，但是每个孔固定上的总粘附配体数量是相同的。前面对此情景做了进一步的说明。在图10的电子表格中示出这种设计的一个例子。该电子表格充当存储在数据库中的该设计的计算机表达。图10的顶行列出该具体筛选中使用的十种因子(A-K)以及它们的对应身份。在该示出的电子表格中，因子A代表纤维蛋白，因子B代表胶原蛋白I，等等。第一列是转换到96孔板的某个孔中的试验点的列表，在本情况中共52个孔。该电子表格中的数字是因子水平。在该例子中，这些水平是添加到特定孔中的因子的实际体积(按μL)。在该具体设计中，按三种体积例如5μL，25μL或50μL对地添加因子。本情况中孔的总容积是50μL。这样，对于那些按50μL添加一种因子的孔，孔的最终成分由共价地固定在孔表面上的单种粘附配体构成。相应地，如果对某个孔添加25μL的某因子并且还添加25μL的第二因子，则最终孔成分是二种共价固定在孔表面上的不同的细胞粘附配体的混合构成。当添加5μL的某因子并且还添加9种各为5μL的其它因子，则在这些孔中产生孔表面上的全部10种细胞粘附配体的混合构成。这些含有全部10种粘附配体的试验点称为“中间点”并且是该例中的统计设计的组成部分。
现参照图11，图中示出96孔板的布局，其是图10中所示的具体统计设计转换得到的。具体地，该96孔板包括图10指出的孔成分，例如固定在每个孔的底上的细胞粘附配体组合。具体地，按如下图10中的试验运行和图11的行/列对应图10设计中的运行1-10分别代表图11阵列上的行B，列2-11；运行11-20代表行C，列2-11；运行21-30代表行D，列2-11；行31-40代表行E，列2-11；运行41-50代表行F，列2-11；以及运行51和52分别代表行G，列2和3。如通过图10的统计设计和图11的对应96孔板布置所示，这是本发明的一个其中除了试剂混合之外还可以在受器中置入单种试剂的实施例。
例4 专用于MC3T3-E1成骨细胞的ECM筛选MC3T3-E1细胞源自Duke大学的L.D.Qnarles博士并且由北卡罗来纳大学(Chapel Hill)的Gale Lester博士友好提供。利用标准细胞培养技术这些细胞生长。MC3T3-E1是一种充分表征和迅速生长的成骨细胞系，由于它积极地附着到最常使用的组织培养表面上而被选择。
按照技术上周知的方法利用胰蛋白酶-EDTA从细胞培养瓶取出细胞。对细胞计数、离心沉降并且重悬浮在不含有血清的培养基中(或者替代地含有10％的胎牛血清的培养基中)。根据图11中示出的和在前面例3中说明的布置把细胞置96孔微阵列的各孔中。接种浓度为每个孔大约10,000个细胞。在板中37℃下温育细胞过夜。下一个白天，去除未附着在孔表面上的固定试剂中的培养基和细胞。通过对福尔马林至少暴露15分钟固定任何附着的细胞。使用碘丙锭荧光标记所述固定的粘附细胞的核。利用荧光显微镜(Discovery-1，UNIVERSALImaging公司，为位于Downingtown，PA的Molecular Devices公司的子司)获取附着在ECM筛选板的各孔上的荧光标记细胞的图象。图12中示出从一个96孔板获取的图象的例子。具体地，除了行G，列4-11充当对照孔外，该布局和图11中示出的布局相同。在图12中，把10％的含胎牛血清溶液中的MC3T3-E1细胞置入含有已约束到透明质酸表面上的试剂的各孔中，但孔G4-G9只含有透明质酸表面以及孔G10和G11只由组织培养级聚苯乙烯构成。如预期那样，孔G4-G9中的仅仅透明质酸的表面防止细胞附着。在该情况中，孔G10和G11中的对聚苯乙烯表面的细胞附着出奇地低。相反，一些含有细胞粘附配体的孔显示强的细胞附着，如可以通过大量白点看出那样，每个白点代表一个附着细胞的细胞核。
利用一个图象分析软件包(Meta Morph，Universal Imaging公司，Molecular Devices公司的子公司，Downingtown，PA)对图12中的荧光标记细胞核计数，在图13中示出对不含有胎牛血清的培养基以及含有10％的胎牛血清的培养基中的细胞的细胞核计数。在图13中，孔1-10对应图12中的行B，列2-11；图13中的孔11-20对应图12中的行C，列2-11；等等。
在图13中，存在10％的胎牛血清下，对一些孔观察到细胞附着。不存在血清下，细胞附着减少，但是在一些孔中仍观察到细胞附着。在这二种情况中，一些含有根据统计设计的试验的细胞粘附配体的孔中的细胞附着超过在纯组织培养级聚苯乙烯(图12中的孔59和60)中培养的细胞。该得到的结果能证实一些支持MC3T3-E1附着的表面好于最常用作于细胞培养支持的组织培养级聚苯乙烯。
为了优化表面可以遵循二个指导，即，“最佳孔”组成或“最佳因子组”。在对试验结果的严格统计分析后确定“最佳因子组”。
在“最佳孔”方法下，选出带有最佳试验结果的孔进一步进行优化。在图13示出的例子中，应选择细胞核数量最高的孔40(或孔E11)。根据图11中示出的板布局，该孔含有VI型胶原和III型胶原的混合。为ECM筛选板准备中的固定步骤选择的VI型胶原以及III型胶原的浓度是根据利用ECM(纤连蛋白)模型对MC3T3-E1的初始浓度依赖性研究。注意，对于一种研究的细胞类型最优的浓度对另一种细胞类型可能不是最优的。另外，对某给定细胞类型最优的特定ECM的浓度对于另一种ECM可能不是最优浓度，即使使用相同的细胞类型时。类似地，“击中孔”中的混合物的成分可能不是最优的。例如，为“最佳孔”的孔E11由VI型胶原和III型胶原的50/50混合构成。可以进行相随的试验以优化为固定步骤选择的二种配体的浓度，以及为某给定的细胞类型优化结合到“击中”孔的表面上的混合物的组成(50/50混合可能不是最优组成)。
在“最佳因子组”方法下，利用统计模型分析试验结果，对于上面说明的例子，MC3T3-E1数据的混合物模型分析表明，当不存在血清，在胶原IV、层粘连蛋白以及聚-L-赖氨酸(边缘效应)为足够数量时它们看来增加细胞计数，如图14中所示。所有这些线相交的点对应中间点，在这些中间点上所有10种ECM各按5μL出现。该图提供取决于孔的组成如何偏离该基准“中间点”混合细胞计数会如何改变的指示，如可看出那样，当胶原蛋白IV或层粘连蛋白的数量增加时，细胞计数增加。
参照图15，在10％的血清下，图14中看到的聚L赖氨酸的作用消失，仅仅胶原蛋白IV和层粘连蛋白继续显示细胞计数上的阳性作用。
注意“最佳孔”和“最佳因子组”二种方法都是有效的，但是每种方法可以导致不同的表面组成。在本例中，“最佳孔”方法会导致VI型胶原蛋白和III型胶原蛋白构成的表面，而“最佳因子”方法会导致胶原蛋白VI和层粘连蛋白构成的表面。
例5 利用统计设计的试验(Plackett-Burman设计)筛选30种不同的试剂设计本例说明图16(a-d)中所示的Plackett-Burman(PB)设计，其是利用SAS Institute(Cary，NC)的商用软件包JMPTM生成的。具体地说，利用SAS/JMP V 4.0.5中的定制设计功能产生该筛选设计。该软件包是一个GUI导向的包，从而不示出代码。参照图16a，第一列是转换到96孔板的各孔中的试验点(运行)的列表，在本例中共60个孔。该电子表格自身中的数字(-1或1)(图16a-16d)是因子水平的指示。在本例中，“1”指示存在该因子而“-1”指示不存在该因子。另外，在本例中，如果一给定孔中存在某因子，则对于该孔的总容积它总是为相同的浓度。根据对应试验运行中包含的试剂的编号，各个孔之间试剂的总浓度可以是不同的。在图16a-16d的首行中提供类因子名。图17示出该试验中每个类因子F01-F03的身份。例如，第一列中的试验运行1可代表96孔板的孔1。从图16(a-d)示出的统计设计，可以看出孔1中存在以下因子(即水平为“1”)F01，F08，F09，F11，F12，F14，F16，F20，F23，F25，F26，F27和F29。
建议的数据获取和统计分析根据图16(a-d)的电子表格中示出的设计把细胞置入96孔板的各孔中。接种密度约为每个孔10,000个细胞。37℃下在板中温育细胞过夜。下一个白天，去除未附着在孔表面上的固定试剂中的培养基和细胞，并且通过对福尔马林至少暴露15分钟固定任何附着的细胞。如例4中说明那样，荧光标记固定的附着细胞的核并且利用荧光显微镜获取图象。利用一个图象分析软件包(Meta Morph，Universal Imaging公司)对荧光标记的细胞核计数并且对细胞得到核计数结果。根据这些结果，选出带有最佳试验结果(例如，细胞核数量最高)的孔供进一步优化。通过检查给出最佳结果的那些孔的内容，获得有关哪些因子和/或因子组产生有益作用的信息。通过在该设计中包括许多因子，可以确定因子之间的潜在的更复杂的交互作用。相随的筛选试验可以集中在第一轮筛选中发现的特别感兴趣的因子组合上。
第一次筛选之后，评估和审查主效果。“主效果”指的是单种试剂独立起的效果。交互效果指的是多于一种的试剂一起作用(不独立地)时的组合效果。此刻，典型地不在统计模型中评估试剂之间的相关交互作用，而是期望试剂之间的交互作用会产生最佳试验运行，即最佳的孔。在第一轮筛选之后，识别最佳的孔以及这些孔中包含的因子(水平“1”)。对每个最佳的孔，利用该孔中包含的所有因子，不论它们在初步统计分析中具有阳性、中性或阴性效果，可以进行相随的试验。可以利用最佳孔中识别出的试剂的子集重复试验，从而达到用于在细胞中产生期望响应的最优因子子集。另外，可以在改变最佳孔中各试剂的浓度的情况下重复试验。还可以利用统计上具有明显的主效果的单试剂的子集或者通过使最佳单试剂的子集与最佳混合中识别的子集组合来进行相随的试验。
已经提出通过细胞外环境中因子之间的高阶交互作用来管理经细胞外条件的细胞表现型的控制。确信本文给出的Plackee-Burman设计对主效果提供好的统计评估，并且还提供在各次试验运行中观察各因子的各种组合的机会，在此情况下，可以期望高阶交互作用会产生超过最佳孔中各试剂各自的主效果所预期的试验运行的特定试验运行以作为“最佳的孔组”。
尽管上面只详细地说明了本发明的一些示范实施例，业内人士容易理解，在不实质背离本发明的新颖的教导和优点的情况下，在这些示范实施例中许多修改是可能的。从而，预期所有这样的修改包含在由后面的权利要求书定义的本发明的范围之内。
权利要求
1.一种提供优化策略以便根据各种响应识别优化细胞培养条件的多种物质的最优浓度的自动方法，该方法包括步骤生成把多种物质中的每一种变换成相应的类因子名的统计设计；生成进一步把每种所述物质的至少一种浓度变换成相应的因子水平的所述统计设计；生成进一步把多个受器的相应位置变换到第一受器阵列中的所述统计设计；根据所述统计设计生成第一表达，并且作为响应把一种所述物质的相应浓度以及另一种所述物质的相应浓度作为相应的组合物质置入所述第一受器阵列里的至少一个所述受器中；使所述置入的组合物质与感兴趣的细胞接触；以及获取指示由于所述感兴趣的细胞与所述组合物质的接触而产生的、所述感兴趣的细胞中的表现型改变的数据，并且作为响应确定产生期望的表现型改变的最优组合物质以及所述最优组合物质的所述物质的最优浓度。
2.权利要求1所述的提供优化策略的方法，其中所述置入包括把相应的二种所述物质的相应浓度作为相应的组合物质置入各相应的所述受器中；所述接触包括在所述受器中使所述感兴趣的细胞与每种所述组合物质接触；以及所述获取包括获取指示由于所述感兴趣的细胞与所述相应的组合物质的接触而产生的、所述感兴趣的细胞中的相应表现型改变的相应的所述数据，并且作为响应确定产生所述期望的表现型改变的所述最优组合物质以及所述最优组合物质的所述物质的所述最优浓度。
3.权利要求1所述的提供优化策略的方法，其中所述组合物质包括下述之一具有第一浓度值的所述的一种所述物质的所述相应浓度与具有第二浓度值的所述的另一种所述物质的所述相应浓度的组合；以及具有第三浓度值的所述的一种所述物质的所述相应浓度与具有第四浓度值的所述的另一种所述物质的所述相应浓度的组合。
4.权利要求3所述的提供优化策略的方法，其中所述的一种所述物质的所述第一浓度值小于或等于所述的一种所述物质的所述第三浓度值；以及所述的另一种所述物质的所述第二浓度值小于或等于所述的另一种所述物质的所述第四浓度值。
5.权利要求1所述的提供优化策略的方法，还包括步骤生成进一步把多个受器的相应位置变换到第二受器阵列中的所述统计设计；根据所述统计设计生成第二表达，并且作为响应把一种所述物质的相应浓度、另一种所述物质的相应浓度以及再一种所述物质的相应浓度作为相应的三组合物质置入所述第二受器阵列的至少一个所述受器中；使所述置入的三式组合物质与感兴趣的细胞接触；以及获取指示由于所述感兴趣的细胞与所述三式组合物质的接触而产生的、所述感兴趣的细胞中的表现型改变的第二数据，并且作为响应确定产生第二期望的表现型改变的最优三式组合物质以及所述最优三式组合物质的所述物质的最优浓度。
6.权利要求5所述的提供优化策略的方法，其中所述置入包括把相应的三种所述物质的相应浓度作为相应的三式组合物质置入所述第二受器阵列的相应的所述受器中；所述接触包括在所述第二受器阵列的所述受器中使所述感兴趣的细胞与所述三式组合物质的每种物质接触；以及所述获取包括获取指示由于所述感兴趣的细胞与所述相应的三式组合物质的接触而产生的、所述感兴趣的细胞中的相应的表现型改变的相应的所述第二数据，并且作为响应确定产生所述第二期望的表现型改变的所述最优三式组合物质以及所述最优三式组合物质的所述物质的所述最优浓度。
7.权利要求6所述的提供优化策略的方法，其中所述三式组合包括具有第一浓度值的所述的一种所述物质的所述相应浓度和具有第二浓度值的所述的另一种所述物质的所述相应浓度以及具有第三浓度值的所述的再一种所述物质的所述相应浓度的组合。
8.权利要求5所述的提供优化策略的方法，还包括步骤生成进一步把多个受器的相应位置变换到第三受器阵列中的所述统计设计；根据所述统计设计生成第三表达，并且作为响应，把所述最优组合物质置入所述第三受器阵列里的至少一个受器中并把所述最优三式组合物质置入所述第三阵列里的至少一个其它受器中；使所述置入的最优组合物质以及所述置入的最优三式组合物质与感兴趣的细胞接触；以及获取指示由于所述感兴趣的细胞与所述最优组合物质以及与所述最优三式组合物质的接触而产生的、所述感兴趣的细胞中的表现型改变的第三数据，并且作为响应，确定产生第三期望的表现型改变的所述最优组合物质以及所述最优三式组合物质的所述各物质的最优浓度。
9.权利要求8所述的提供优化策略的方法，其中所述置入包括在所述第三阵列中，把所述最优组合物质置入到多个所述受器中以及把所述最优三式组合物质置入到多个其它所述受器中。
10.权利要求8所述的提供优化策略的方法，其中所述置入还包括在所述第三阵列中把至少一个其它三式组合物质置入到其它所述受器中；所述接触还包括使所述置入的一个其它的三式组合物质与所述感兴趣的细胞接触；以及所述获取包括获取指示由于所述感兴趣的细胞与所述最优组合物质、所述最优三式组合物质以及所述一个其它三式组合物质的接触而产生的、所述感兴趣的细胞中的表现型改变的所述第三数据，以及作为响应，确定产生所述第三期望的表现型改变的所述最优组合物质、所述最优三式组合物质以及所述一个其它三式组合物质的所述各物质的最优浓度。
11.一种提供优化策略以便根据各种响应识别优化细胞培养条件的多种物质的最优浓度的自动方法，该方法包括步骤生成把多种物质中的每一种变换成相应的类因子名的统计设计；生成进一步把每种所述物质的至少一种浓度变换成相应的因子水平的所述统计设计；生成进一步把多个受器的相应位置变换到第一、第二和第三受器阵列的每一个中的所述统计设计；根据被置成与所述第一受器阵列里的所述受器中的所述物质的相应二式组合接触的所述感兴趣的细胞的响应，确定最优组合物质；根据被置成与所述第二受器阵列里的所述受器中的所述物质的相应三式组合接触的所述感兴趣的细胞的响应，确定最优三式组合物质；以及根据被置成与所述第三受器阵列里的某些所述受器中的所述最优组合物质接触的以及与所述第三受器阵列里某些其它所述受器中的所述最优三式组合物质接触的所述感兴趣的细胞的响应，确定最优物质浓度。
12.权利要求11所述的提供优化策略的方法，其中所述确定步骤根据在所述第一、第二和第三受器阵列里的所述受器中观察到的所述感兴趣的细胞的相应表现型改变，确定所述最优组合物质、所述最优三式组合物质以及所述最优物质浓度。
13.权利要求11所述的提供优化策略的方法，其中所述二式组合各包括二种所述物质的每种物质的相应浓度，并且所述三式组合各包括三种所述物质的每种物质的相应浓度。
14.权利要求13所述的提供优化策略的方法，其中所述二式组合中的所述二种所述物质的所述相应浓度包括下述之一所述二种物质中的一种物质的相应第一浓度值以及所述二种物质中的另一种物质的相应第二浓度值；以及所述二种物质中的一种物质的相应第三浓度值以及所述二种物质中的另一种物质的相应第四浓度值；以及所述三式组合中的所述三种所述物质的所述相应浓度包括所述三种物质中的每一种物质的相应第五浓度值。
15.权利要求14所述的提供优化策略的方法，其中所述二种物质中的所述一种的所述第一浓度值小于或等于所述二种物质中的所述一种的所述第三浓度值；以及所述二种物质中的所述另一种的所述第二浓度值小于或等于所述二种物质中的所述另一种的所述第四浓度值。
16.一种提供优化策略以便根据各种响应识别多种物质的最优浓度的自动方法，该方法包括步骤利用以统计方式建立的第一板布局识别至少一个二物质组合子集以供包含在子集优化浓度评估中；利用以统计方式建立的第二板布局识别至少一个三物质组合子集以供包含在子集优化浓度评估中；以及利用以统计方式建立的第三优化板布局从所述识别的所述二物质组合子集以及所述三物质组合子集中识别至少一个最优物质浓度。
17.权利要求16所述的提供优化策略的自动方法，还包括在组合第一和第二物质并且至少一个物质的浓度水平在高、低浓度水平之间改变的情况下进行所述的从多种物质识别至少一个二物质组合子集。
18.权利要求16所述的提供优化策略的自动方法，还包括在组合第一、第二和第三物质的情况下进行所述的从多种物质识别至少一个三物质组合子集。
19.权利要求16所述的提供优化策略的自动方法，还包括在至少一种物质的浓度水平在多个物质浓度水平之间变化的情况下进行所述的从所述二物质组合子集和所述三物质组合子集识别至少一个最优物质浓度。
20.权利要求16所述的提供优化策略的自动方法，还包括根据指示当把感兴趣的细胞置成和所述二物质组合子集和所述三物理组合子集相接触时产生的所述感兴趣的细胞的表现型改变的数据，进行所述的从所述二物质组合子集和所述二物质组合子集识别至少一个最优物质浓度。
全文摘要
一种用于识别能引发细胞类型中的表现型改变的试剂的自动系统和方法。该方法包括步骤提供包含类因子名、因子水平和试验运行的统计设计，以及利用软件程序通过自动地把各试剂的身份变换成类因子名、把各试剂的浓度或量变换成因子水平、以及把各受器的位置变换成试验运行，生成该统计设计的计算机表达。该方法还包括根据该统计设计的计算机表达，把诸如蛋白胨的单试剂的不同混合物设置到阵列里的各受器中，使被置入的混合物与细胞接触，从相接触的细胞获取试验数据，以及利用包含算法的处理器比较获取的数据和统计设计，以便识别优化细胞培养条件的蛋白胨组合和浓度。
文档编号G01N35/10GK1930472SQ200580007362
公开日2007年3月14日 申请日期2005年1月6日 优先权日2004年1月13日
发明者佩里·D·哈兰, 布赖斯·N·钱尼, 斯泰西·D·霍尔雷德 申请人:贝克顿·迪金森公司