专利名称：一种制备裂褶菌多糖的方法及专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备裂褶菌多糖的方法及专用培养基。
背景技术：
裂褶菌CSb/^op力^ 7咖co鹏"/2e Fr.)，又名白参菌、树花菌，是一种具有很 高食用和药用价值的白色腐生担子纲真菌。裂褶菌在自然界中分布相当广泛，它能 有效降解纤维基质中的木质素、半纤维素以及部分纤维素，可以在相对恶劣的条件 下良好生长，是一种易于培养的药用真菌。裂褶菌多糖是存在于裂褶菌子实体、菌 丝体或发酵液中的一种水溶性胞外多糖，具有药用真菌多糖典型的e -(1 ， 3)-D-葡 聚糖主链、0-(1， 6)-D-葡萄糖分支结构。有关裂褶菌多糖的抗肿瘤、抗菌消炎、 抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性已得到国内外研究者的证实。此外，裂褶 菌多糖的高粘度、高持水性也使得其可能作为增稠剂、稳定剂而广泛用于食品、日 用品及石油化工等领域，发展潜力巨大。
裂褶菌多糖的生产工艺目前以液体发酵法为主，通过分批或连续液体发酵生产 工艺，国内外已有个别公司实现了裂褶菌多糖的商业化生产，产品主要用于高附加 值的制药及化妆品行业。液体发酵技术是实现微生物及其产物工业化、规模化生产 的良好途径。但是，由于裂褶菌是一种大型丝状真菌，而该多糖又具有超高粘度特 性，液体发酵法生产过程中存在着传质难、能耗大等问题。这也是导致目前其工业 化生产规模不大、产品生产成本高的重要原因。固体(态)发酵技术是一项古老的 生物技术，过去主要应用于传统酿造业(酒、酱油、醋等)。固体发酵技术具有设 备简单、原材料成本与能耗低、污染少等优点，亦是现代生物发酵技术的发展方向 之一。国内已有个别研究者和生产厂家利用固体发酵来生产灵芝多糖、茶树菇多糖、 灰树花多糖等真菌多糖，但是目前未见以固体发酵制备裂褶菌多糖的报道，其中原 因可能与适宜菌种和培养条件的研究开发不足有关。
作为农业生产大国，我国有着丰富的农作物秸秆、玉米芯、麸皮、米糠、蔗渣 等农副产品资源。而目前这些资源并没有得到充分利用，资源浪费严重。如何对上 述农副产品资源开展深加工高附加值转化，是近年来农产品加工领域关注的重点。 发明内容本发明的一个目的是提供一种用于固体发酵制备裂褶菌多糖的培养基。
本发明所提供的培养基，其组成为每千克培养基中含有玉米芯、玉米秸秆和 /或玉米皮400-450g，小麦麸皮、米糠和/或蔗渣50-100g，促生长因子VB1 0. 05-0. lg， L-谷氨酸0. 05-0. lg，其余为水。
上述培养基中，每千克培养基中含有玉米芯、玉米秸秆和/或玉米皮450g，小 麦麸皮、米糠和/或蔗渣50g，促生长因子l 0. lg， L-谷氨酸O. lg，其余为水。
上述任一所述培养基中，所述玉米芯、玉米秸秆或玉米皮可以是被粉碎且过 20-40目筛后得到的。
本发明的另一个目的是提供一种固体发酵制备裂褶菌多糖的方法。
本发明所提供的制备裂褶菌多糖的方法，包括如下步骤用上述任一所述培养 基发酵裂褶菌(5b力izc^力/77咖co/ffizw/ e Fr.)，得到裂褶菌多糖。
其中，所述裂褶菌(5b力&o; A^7鹏co鹏me Fr.)具体可为如下保藏编号的裂 褶菌CFCC N0. 6812 、 CFCC N0. 83457或ACCC NO. 50875。
上述发酵过程中，温度可为26-30°C。
上述发酵过程中，时间可为7-10天。
上述发酵过程中，液体菌种接种量可为50m1-100ml液体菌种1000g培养基。
上述制备方法中，在所述发酵后，还可包括提取的步骤；所述提取的方法可包 括如下步骤将所述发酵得到的发酵物进行破碎，然后加入水，在60-8(TC的温度 下搅拌，离心，收集上清液。
上述提取过程中，所述破碎的方法可以是先将发酵物倒入搅拌机中，进行破碎， 再向其中加入水用打浆机进行破碎。
上述提取过程中，所述水与所述破碎后的发酵物的比例为(15-25) L水lkg 破碎后的发酵物。
上述提取过程中，所述搅拌的时间为40-60min。
上述提取过程中，所述离心的时间为15-25min，离心机转速为3000rpra。 上述制备方法中，在所述提取后，还可包括去蛋白的步骤；所述去蛋白的方法
可包括如下步骤调节所述提取得到的上清液pH值至4.5-5.0，静置0.5-1.5h，
离心、收集上清液。
上述制备方法中，在所述去蛋白后，还可包括脱色的步骤；所述脱色的方法可 包括如下步骤将所述去蛋白得到的上清液依次用活性炭和大孔树脂进行吸附，收集洗脱液；所述活性炭与上清液的比例可为lkg活性炭(80-120) L上清液；所 述D301大孔树脂柱与用活性炭吸附后获得的洗脱液的比例可为1 kg大孔树脂 (120-150) L洗脱液。
本发明的固体发酵制备裂褶菌多糖的方法，是以富含纤维基质的农副产品资源 (玉米秸秆、玉米芯、玉米皮、小麦麸皮、蔗渣等)作为原料进行发酵的，大大降 低了原料成本，又实现了农副产品资源的高效转化，既环保又具有较高经济价值； 该方法制备裂褶菌多糖的得率可达4.5-5.8% (质量百分含量)，得到的多糖除具备 典型药用真菌多糖的增强免疫、抗肿瘤活性外，还具有极高分子量(平均相对分子 质量达到20000KDa)、高粘度(表观特性粘度超过食用级黄原胶)等物化特性，可 开发为一种具有良好生理功能与应用功能的天然食用胶新产品，广泛应用于医药、 日化、食品等行业。
发明内容
图1为多糖浓度对溶液粘度的影响。
图2为体系pH值对溶液粘度的影响。
图3为温度对溶液粘度的影响。
图4为裂褶菌固体发酵及多糖提取工艺流程。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明裂褶菌固体发酵及多糖提取工艺流程如图4所示。
下述实施例中所使用的裂褶菌(5"c力hop力/77咖co鹏朋e Fr.)具体可为如下保 藏编号的裂褶菌:CFCC N0. 6812 、 CFCC N0, 83457或ACCC NO. 50875。裂褶菌 (5b^。/7力/W鹏co鹏〃72e Fr. )CFCC N0. 6812禾口裂褶菌(5b^。/ / /77柳co腳朋e Fr.) CFCC N0. 83457购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，裂褶菌(5b力kop力W7"/Hco卿w"e Fr. )ACCC NO. 50875购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。 实施例1、裂褶菌多糖及其制备方法 一、制备方法
(一) 菌种活化
将裂褶菌(5b力izo/ 力^^鹏co历M/"e Fr. )CFCC NO. 6812接种到PDA斜面培养基， 进行复壮活化培养。
PDA斜面培养基的组成为每升培养基中含有马铃薯20g、葡萄糖2g、酵母膏 0.5g、硫酸镁O. 15g、磷酸氢钾0. 3g和琼脂2g，其余为水。
(二) 菌种的扩大培养
取已培养好的斜面菌种，接种到液体PDA培养基中，在25-29"C、摇床转速 150-180转/分下培养48-52小时，得到菌丝球分布均匀、发酵液清澈透明的液体菌 种，此为一级液体菌种。
取一级液体菌种接种于液体PDA培养基中，在25-29°C、摇床转速150-180转/ 分下培养48-52小时，获得二级液体菌种。此过程中培养容器可采用液体发酵罐 (50-100L)或大三角瓶(5L)。
液体PDA培养基的组成为每升培养基中含有马铃薯20g、葡萄糖2g、酵母膏 0.5g、硫酸镁0. 15g和磷酸氢钾0. 3g，其余为水。
(三) 菌种的固体发酵
在无菌操作环境中，将前发酵好的二级液体菌种接种到发酵培养基中，接种比 例为二级液体菌种发酵培养基二70mL: 1000g;置于28X:下培养8天，待菌丝布满 菌袋(或菌瓶)时，固体发酵结束，此发酵后的混合物被称作发酵原料。
发酵培养基的组成为每千克培养基中含有玉米芯450g、小麦麸皮50g、促生 长因子IO. lg、 L-谷氨酸O. lg,其余为水。
发酵培养基的制备方法如下首先将干燥玉米芯粉碎，过20-40目筛，再与小 麦麸皮按比例混合均匀；促生长因子Vw称重后溶于水中；将促生长因子-Vb,溶液和 玉米芯、小麦麸皮混合，加水，再向其中加入L-谷氨酸，加水补足至l公斤，搅拌
均匀，得到固体发酵培养基。将发酵培养基分装入菌袋或菌瓶中，置于12rc下湿
热处理2.5-4.0小时，杀菌；取出，冷却至室温待用。
(四) 裂褶菌多糖的提取及纯化1、 粗提将发酵原料倒入搅拌机中，先破碎；再加少量水，加入的水占发酵 原料和水总体积的10-15%，过打浆机细磨、匀浆；然后向打浆后的原料中补加水至 打桨后的原料与水的比例达到lkg: 20L，在7(TC下搅拌提取50min;离心(3000rpm， 20min)，收集上清液，此上清液即为裂褶菌多糖粗提取液。
2、 去蛋白采用等电点沉淀法去除粗提取液中的杂蛋白，调节粗提取液pH值 至4.8，静置lh，离心、收集上清液。
3、 脱色将步骤2得到的上清液依次通过活性炭柱(活性炭与上清液的比例 为lkg: 90L) 、 D301大孔树脂柱(树脂与活性炭吸附后洗脱液的比例为lkg: 150 L)做脱色处理。综合脱色率达到93. 5%，多糖保留率84.2%。最后将溶液pH值调 至7.0，获得裂褶菌多糖精制液。
脱色率溶液脱色前后吸光度的差值除以脱色前吸光度再乘以100%即得(吸光 度在426nm波长下测定)。
多糖保留率脱色前后溶液中多糖总量之比(多糖含量测定采用苯酚-硫酸法)。
(五) 液体产品和固体产品的制备
1、 液体产品的制备
调整浓度将裂褶菌多糖精制液中的多糖调整至1.0%的浓度。 灭菌采用5-25kg塑料桶分装，然后进行60Co-Y射线辐照杀菌处理(辐照 剂量3-5kGy);产品置于阴凉、避光处保存，贮藏期1年。
本发明所得液体裂褶菌多糖产品为一种无色、透明至乳白色粘稠液体.
2、 固体产品制备
浓度调整将裂褶菌多糖精制液进行真空浓縮至固形物含量达到2. 5%;
采用醇析法获得沉淀多糖，向浓縮物中逐步添加95%的食用乙醇至溶液乙醇浓 度达到60-65%，得到多糖絮状沉淀；室温下静置8-12小时，压滤，收集多糖沉淀； 再用95%乙醇洗涤沉淀2-3次，脱除多余液体获得半干物料；将该半干物料置于真 空条件下低温烘干，粉碎、包装，密闭保存，贮藏期2年。此即裂褶菌多糖固体产 品，该产品为一种白色至灰白色粉末。
(六) 得率的计算
得率(％)=固体产品中葡聚糖的质量/发酵原料的质量乂100%
7上述发酵和固体产品制备的实验(即步骤(一)至(六))均重复3次，平均
得率为5. 8%。
二、裂褶菌多糖的鉴定 1、产物鉴定
1) 基本组成分析
将实验一得到的裂褶菌多糖固体产品进行组成分析。用苯酚-硫酸法测其中多 糖含量，用凯氏定氮法测其中蛋白质含量。
实验设3次重复。结果总糖含量86. 8%;蛋白质含量8. 0%;干燥失重10. 0%。 表明，本发明产品中的主成分为糖。
2) 单糖组成分析高效液相色谱(HPLC)法
取10rog本发明所得固体产品，在20ml、 1M貼04溶液中IO(TC水解3小时；冷 却，加入BaC03中和至pH7.0;过滤、收集滤液；微滤(4> 0. 45 u m)，滤液备用。
HPLC条件Sugar pakl、 6. 8X300mm色谱柱(Waters公司)；流动相为超纯 水；流速O. 5ml/min;柱温85'C;池温3(TC;进样量10nl;检测器为示差折光检 测器。
葡萄糖标准品购自Sigma公司，产品目录号为G5400;木糖标准品购Sigma公 司，产品目录号为95729;阿拉伯糖标准品购自Sigma公司，产品目录号为10860。
在如上色谱条件下，葡萄糖标准品的保留时间为13.023min;木糖标准品的保 留时间为15.008min;阿拉伯糖标准品的保留时间为16. 285min。
实验设3次重复。经测定本发明所得产品中总糖的水解产物为葡萄糖85. 92%、 木糖8.52%、阿拉伯糖5.56%。表明，本发明所得产品中的糖水解后主要为葡萄糖， 其中含有少量以木糖和阿拉伯糖构成的多糖物质，但不影响其实际应用。
3) 产物分子量分布测定高效凝胶过滤色谱法(HPSEC)法 将本发明所得产品配制成多糖浓度为5mg/ml的溶液，溶剂为0. 1M NaN03溶液；
微滤(4>0.45um)，滤液备用。
HPLC条件Ultrahydrogel LinearX2， 7. 8X300mm凝胶色谱柱(Waters公司， WAT011545);流动相为0. 1MNaN03溶液；流速0. 9ml/min;柱温45。C;池温37。C; 进样量20ul;检测器为示差折光检测器。该色谱柱经系列标准葡聚糖(Dextran， Fluka公司)标定，保留时间(T)与平均相对分子质量(MW)之间的关系为 LogMW二l. 37e-5. 33e—1 T。经测定本发明所得产品出现两个分子量相对较大的多糖峰，其中平均相对夯子
质量(Mw)为23，140，680Da的多糖组分占总多糖含量的92. 72%;另有一平均相对 分子质量为44，578Da的多糖组分占总多糖含量的7.28y。。表明，本发明产品中的葡 萄糖是以高分子形式存在的。
综上，鉴定结果表明本发明产品的主成分为葡聚糖(即裂褶菌多糖)。 2、产品粘度特性分析
由乌氏粘度计(4)0.57 mm)测定裂褶菌多糖溶液的相对粘度、比粘度及表观 特性粘度。在pH2. 0-10. 0的溶剂体系中，配制1. 5-3. 5mg/ml的多糖系列溶液，在 25-75'C下测定溶剂及溶液的流动时间(t。、 t)。溶剂为去离子水，用裂褶菌多糖 固体样品进行配制。
粘度计算公式
相对粘度(nrel) 二t。/t;
比粘度(nsp) = nrel —1;
表观特性粘度([n]app) =[2Usp — lnnrel)]°'5X1000/C，单位ml/g;其 中C为溶液浓度(mg/ml)。
实验设3次重复，结果如图l-3所示。结果表明，裂褶菌多糖粘度随浓度的增 加而呈指数上升趋势；多糖粘度随体系pH值的增加略有下降，整体变化趋势不明 显；随温度的上升粘度呈线性下降。
另研究了同一浓度条件下本发明所得多糖的表观特性粘度([n]app)与常用 食用胶-黄原胶的差别。结果显示，在2.5mg/ml浓度下，本发明产品与黄原胶的 [n]app值分别为1500±32 ml/g、 2250± 120ml/g，约是后者的1. 5倍，表明本产 品具有更好的增稠性。
三、裂褶菌多糖的生理功能实验
1、免疫调节功能实验
实验程序参照《保健食品检验与评价技术规范》(卫生部2003年)的方法对昆 明种小鼠进行免疫调节功能测定。检测指标包括①免疫器官脏/体重比值；②绵羊 红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH (足跖增厚法)迟发型变态反应(DTH);③血凝法测 定血清溶血素抗体积数(血凝法)；④小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体 内法)测定吞噬率及吞噬指数。具体方法和计算公式可见上述规范。
用裂褶菌多糖精制液进行实验。将裂褶菌多糖精制液加入基础日粮中，制备成不同剂量多糖的试验日粮50、 100、 150 mg裂褶菌多糖/kg试验日粮。
小鼠分为4组，每组10只，作为对照组、低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组 (100mg/kg)、高剂量组(150mg/kg)，分别饲喂基础日粮和不同多糖剂量的试 验日粮。实验设2次重复。
表l裂褶菌多糖对小鼠胸腺和脾脏/体重的影响
组别_剂量(mg/kg)_胸腺/体重_脾脏/体重
对照组 / 0.36 ±0.07 0.42 ±0.09
低剂量组 50 0.41±0.04 0.42±0.07
中剂量组 100 0.45±0.05* 0.49±0.04*
高剂量组 200 0.48 ±0.05* 0.52 ±0.05**
注与对照组相比的差异显著性，*p<0.05， **p<0.01。
表2裂褶菌多糖对小鼠迟发型变态反应(DTH)
组别剂量(mg/kg)DTH
对照组/0. 60±0. 10
低剂量组500. 76±0. 11
中剂量组1000. 94±0. 15*
高剂量组2000. 96±0.14*
注与对照组相比的差异显著性，*p<0.05， **p<0.01。 表3裂褶菌多糖对小鼠血清溶血素抗体;识数的影响
组别剂量Ug/kg)抗体积数
对照组/28. 89 ±4. 62
低剂量组5029. 88±4. 25
中剂量组10030. 33±3.27
高剂量组20032. 66±3. 33
各剂量组有增高趋势，但差异不显著。
表4裂褶菌多糖对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响_
组别_剂量(mg/kg)_吞噬率(％)_吞噬指数
对照组 / 45.73±7.39 0.61 ±0.17
低剂量组 50 49.26 ±6.38 0.76±0.29
中剂量组 100 64.60±8.51* 0.95±0.21*高剂量组__75. 89±6. 92**_1.13±0. 36**
注与对照组相比的差异显著性，*p<0.05， **p<0.01。
由上述结果显示，与对照组相比，裂褶菌多糖中、高剂量组可显著提高小鼠的
胸腺指数和脾脏指数、增强迟发型变态反应(DTH)与单核巨噬细胞吞噬功能(p< 0.05， p<0.01)，由此判断本发明所得裂褶菌多糖具有免疫调节功能。
2、体外抗肿瘤活性实验
考察了裂褶菌多糖溶液对人肺癌A549细胞、人慢性髓原白血病细胞K562及人 肝癌细胞H印G2的体外抑制率。上述三类人肺癌A549细胞、人慢性髓原白血病细 胞K562及人肝癌细胞H印G2均购自中国医学科学院肿瘤研究所。将裂褶菌多糖精 制液加入细胞培养基中，使其浓度控制在ltng/ml、 0.5 mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. 125mg/ml、 0. 0625mg/ml、 0. 03125mg/ml;然后向其中接种肿瘤细胞，培养一段 时间后，在570 nm测定吸光值，计算裂褶菌多糖的抑瘤率。
裂褶菌多糖的体外抑瘤率(％) =(1—药物组吸光度值/对照组吸光度值)X 100%。
实验设2次重复。结果显示当培养基中裂褶菌多糖的浓度达到lmg/ml时， 对A549细胞的抑制率为33. 5% (p<0.01)，对K562细胞的抑制率为73. 7% (p< 0.01)，对H印G2细胞的抑制率为59.4。/。 (p<0.01)，由此推断，裂褶菌多糖的体 外抑瘤率表现为极显著水平。
实施例2、裂褶菌多糖及其制备方法 一、制备方法
(一) 菌种活化
采用裂褶菌(5b/L^o/ 力777M2 co鹏w eFr.) CFCC NO. 83457菌株，方法同实施 例1中所述一致。
(二) 菌种的扩大培养 方法同实施例1中所述一致。
(三) 菌种的固体发酵
在无菌操作环境中，将前发酵好的二级液体菌种接种到发酵培养基中，接种比 例为二级液体菌种发酵培养基:50mL: 1000g;置于26'C下培养10天，待菌丝布 满菌袋(或菌瓶)时，固体发酵结束，此发酵后的混合物即作为发酵原料。
11发酵培养基的组成为每升培养基中含有玉米皮400g、米糠100g、促生长因 子-VB,0.08g、 L-谷氨酸0.05g，其余为水。
发酵培养基的制备方法同实施例1中所述一致。
(四) 裂褶菌多糖的提取及纯化
1、 粗提将发酵原料倒入搅拌机中，先破碎；再加少量水，加入的水占发酵 原料和水总体积的13%，过打浆机细磨、匀浆；然后向打浆后的原料中补加水至打 浆后的原料与水的比例达到lkg: 15L，在6(TC下搅拌提取40min;离心(3000rpm， 15min)，收集上清液，此上清液即为裂褶菌多糖粗提取液。
2、 去蛋白采用等电点沉淀法去除多糖粗提液中的杂蛋白，调节多糖粗提液 pH值至4.5，静置0.5h，离心、收集上清液。
3、 脱色将步骤2得到的上清液依次通过活性炭柱(活性炭与上清液的比例 为lkg: 80L) 、 D301大孔树脂柱(树脂与活性炭吸附后洗脱液的比例为lkg: 120 L)做脱色处理。综合脱色率达到92. 5%，多糖保留率85.4%。最后将溶液pH值调 至6.5，获得裂褶菌多糖精制液。
(五) 液体产品和固体产品的制备
1、 液体产品的制备
调整浓度将裂褶菌多糖精制液中的多糖调整至1. 0%的浓度。 灭菌采用5-25kg塑料桶分装，然后进行60Co-Y射线辐照杀菌处理(辐照 剂量3-5kGy);产品置于阴凉、避光处保存，贮藏期1年。
本发明所得液体裂褶菌多糖产品为一种无色、透明至乳白色粘稠液体。
2、 固体产品制备
浓度调整将裂褶菌多糖精制液进行真空浓縮至固形物含量达到2. 5%;
采用醇析法获得沉淀多糖，向浓缩物中逐步添加95%的食用乙醇至溶液乙醇浓 度达到60-65%，得到多糖絮状沉淀；室温下静置8-12小时，压滤，收集多糖沉淀； 再用95%乙醇洗涤沉淀2-3次，脱除多余液体获得半干物料，将该半干物料置于真 空条件下低温烘干，粉碎、包装，密闭保存，贮藏期2年。此即裂褶菌多糖固体产 品，该产品为一种白色至灰白色粉末。
(六) 得率的计算 方法同实施例1中所述一致。 实验设3次重复，平均得率为4.5%。二、 裂褶菌多糖的鉴定
1、 产物鉴定
方法同实施例l中所述一致。
结果表明，本发明得到的裂褶菌多糖固体产品中多糖含量86.5%，蛋白质含量 8. 3%，干燥失重8. 0%。裂褶菌多糖水解后单糖组成为葡萄糖84. 28%、木糖8. 40%、 阿拉伯糖4.96%。多糖的平均相对分子质量(Mw)分布为23， 240， 180Da的多糖组 分占总多糖含量的91. 23%，另有一平均相对分子质量为45， 508Da的多糖组分占总 多糖含量的8. 77%。鉴定结果表明本发明的裂褶菌多糖固体产品的主成分为葡聚糖 (即裂褶菌多糖)。
2、 粘度特性分析
方法同实施例1中所述一致。
实验设3次重复。结果表明，裂褶菌多糖粘度随浓度的增加而呈指数上升趋势; 多糖粘度随pH值的增加略有下降，整体变化趋势不明显；随温度的上升粘度呈线 性下降；同一浓度条件下本发明所得多糖的粘度值较黄原胶的大，为黄原胶的1. 8 倍；[il ]app平均达到2460ml/g。
三、 裂褶菌多糖的生理功能实验 1、体外抗肿瘤活性实验
方法同实施例l中所述一致。
实验设3次重复。结果显示当培养基中裂褶菌多糖的浓度为lmg/ml时，对 A549细胞的抑制率为35.4%"<0.01)，对1(562细胞的抑制率为72. l%(p<0.01)， 对H印G2细胞的抑制率为60. 5% (p<0. 01)，裂褶菌多糖的体外抑瘤率表现为极显 著水平。
实施例3、裂褶菌多糖的制备方法
一、 菌种活化
采用裂褶菌(^5bWzo/7力/77w/i7 co鹏rae Fr. )ACCC NO. 50875，方法同实施例1中 所述一致。
二、 菌种的扩大培养
13方法同实施例1中所述一致。
三、 菌种的固体发酵
在无菌操作环境中，将前发酵好的二级液体菌种接种到发酵培养基中，接种比
例为二级液体菌种发酵培养基400mL: 1000g;;置于29。C下培养7天，待菌丝
布满菌袋(或菌瓶)时，固体发酵结束，此发酵后的混合物被称作发酵原料。
发酵培养基的组成为每升培养基中含有玉米秸秆430g、蔗渣70g、促生长因 子-^0.05g、 L-谷氨酸0.07g，其余为水。
发酵培养基的制备方法如下同实施例1中所述一致。
四、 裂褶菌多糖的提取及纯化
1、 粗提将发酵原料倒入搅拌机中，先破碎；再加少量水，加入的水占发酵 原料和水总体积的15%，过打浆机细磨、匀浆；然后向打浆后的原料中补加水至打 浆后的原料与水的比例达到lkg: 25L，在80。C下搅拌提取60min;离心(3000rpm， 25min)，收集上清液，此上清液即为裂褶菌多糖粗提取液。
2、 去蛋白采用等电点沉淀法去除多糖粗提液中的杂蛋白，调节多糖粗提液 pH值至5.0，静置1.5h，离心、收集上清液。
3、 脱色将步骤2得到的上清液依次通过活性炭柱(活性炭与上清液的比例 为lkg: 120L) 、 D301大孔树脂柱(树脂与活性炭吸附后洗脱液的比例为lkg: 150 L)做脱色处理。综合脱色率达到95. 0%，多糖保留率81.5%。最后将溶液pH值调 至7.0，获得裂褶菌多糖精制液。
五、 液体产品和固体产品的制备
1、 液体产品的制备
调整浓度将裂褶菌多糖精制液中的多糖调整至1.0%的浓度。
灭菌采用5-25kg塑料桶分装，然后进行60Co-Y射线辐照杀菌处理(辐照
剂量3-5kGy);产品置于阴凉、避光处保存，贮藏期1年。本发明所得液体裂褶菌
多糖产品为一种无色、透明至乳白色粘稠液体。
2、 固体产品制备
浓度调整将裂褶菌多糖精制液进行真空浓縮至固形物含量达到3. 0%;
采用醇析法获得沉淀多糖，向浓縮物中逐步添加95%的食用乙醇至溶液乙醇浓 度达到60-65%，得到多糖絮状沉淀；室温下静置8-12小时，压滤，收集多糖沉淀； 再用95%乙醇洗涤沉淀2-3次，脱除多余液体获得半干物料；将该多糖半干物料置于真空条件下低温烘干，粉碎、包装，密闭保存，贮藏期2年。固体产品为一种灰 白色至浅灰色粉末。
(六)得率的计算
同实施例1中所述一致。
实验设3次重复，平均得率为5.5%。 其中多糖含量85.0%，蛋白质含量13.0%，干燥失重9.0%。
二、 裂褶菌多糖的鉴定
1、 产物鉴定
方法同实施例l中所述一致。
结果表明，本发明得到的裂褶菌多糖固体产品中多糖含量85.0%，蛋白质含量 13. 0%，干燥失重9. 0%。裂褶菌多糖水解后单糖组成为葡萄糖84. 08%、木糖8. 95%、 阿拉伯糖4.74%。多糖的平均相对分子质量(Mw)分布为23，256，100Da的多糖组 分占总多糖含量的90. 13%，另有一平均相对分子质量为45， 400Da的多糖组分占总 多糖含量的8.42%。鉴定结果表明本发明的裂褶菌多糖固体产品的主成分为葡聚糖 (即裂褶菌多糖)。
2、 粘度特性分析
方法同实施例l中所述一致。
实验设3次重复。结果表明，裂褶菌多糖粘度随浓度的增加而呈指数上升趋势; 多糖粘度随pH值的增加略有下降，整体变化趋势不明显；随温度的上升粘度呈线 性下降；同一浓度条件下本发明所得多糖的粘度值较黄原胶的大，为黄原胶的1.7 倍；[ri]app平均达到2415ml/g。
三、 裂褶菌多糖的生理功能实验 1、体外抗肿瘤活性实验
方法同实施例l中所述一致。
实验设3次重复。结果显示当培养基中裂褶菌多糖的浓度为lmg/ml时，对 A549细胞的抑制率为34. 3%(p<0. 01)，对K562细胞的抑制率为70. 9%(p<0. 01)， 对H印G2细胞的抑制率为60. 1% (p<0. 01)，裂褶菌多糖的体外抑瘤率表现为极显 著水平。
权利要求
1、一种培养基，其组成为每千克培养基中含有玉米芯、玉米秸秆和/或玉米皮400-450g，小麦麸皮、米糠和/或蔗渣50-100g，促生长因子VB1 0.05-0.1g，L-谷氨酸0.05-0.1g，其余为水。
2、 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于每千克培养基中含有玉米芯、 玉米秸秆和/或玉米皮450g，小麦麸皮、米糠和/或蔗渣50g，促生长因子VB1 0. lg， L-谷氨酸O. lg，其余为水。
3、 根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述玉米芯、玉米秸秆 或玉米皮是被粉碎且过20-40目筛后得到的。
4、 一种制备裂褶菌多糖的方法，包括如下步骤用权利要求1-3中任一所述 培养基发酵裂褶菌(5b力^o/ 力/77咖co鹏朋e Fr.)，得到裂褶菌多糖。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述裂褶菌(5b/L^邵力i^/w^ co顺朋e Fr.)为如下保藏编号的裂褶菌CFCC N0. 6812 、 CFCC N0. 83457或ACCC NO. 50875。
6、 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为26-30。C。
7、 根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的时间为7-10天。
8、 根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 发酵后，包括提取的步骤；所述提取的方法包括如下步骤将所述发酵得到的发酵 物进行破碎，然后加入水，在60-8(TC的温度下搅拌，离心，收集上清液。
9、 根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 提取后，包括去蛋白的步骤；所述去蛋白的方法包括如下步骤调节所述提取得到 的上清液的pH值至4.5-5.0，静置0.5-1.5h，离心、收集上清液。
10、 根据权利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 去蛋白后，包括脱色的步骤；所述脱色的方法包括如下步骤将所述去蛋白得到的 上清液依次用活性炭和大孔树脂进行吸附，收集洗脱液；所述活性炭与上清液的比 例为lkg活性炭(80-120) L上清液；所述D301大孔树脂柱与用活性炭吸附后获 得的洗脱液的比例为1 kgD301大孔树脂(120-150) L洗脱液。
全文摘要
本发明公开了一种制备裂褶菌多糖的方法及专用培养基。该培养基的组成为每公斤培养基中含有玉米芯、玉米秸秆或玉米皮400-450g、小麦麸皮、米糠或蔗渣50-100g、促生长因子V<sub>B1</sub> 0.05-0.1g、L-谷氨酸0.05-0.1g，其余为水。本发明的固体发酵制备裂褶菌多糖的方法，是以富含纤维基质的农副产品资源(玉米秸秆、玉米芯、玉米皮、小麦麸皮、蔗渣等)作为原料进行发酵的，大大降低了原料成本，又实现了农副产品资源的高效转化，既环保又取得了经济价值；该方法制备裂褶菌多糖的得率高，发酵原料中的多糖含量可达4.5-5.8％(质量百分含量)。
文档编号C12P19/00GK101643759SQ20091009040
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者刘红芝, 周素梅, 强 王, 昕 钟, 聪 陈, 高利忠 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所