专利名称：：辅助鉴定大豆籽粒含油量位点的一对专用引物及其方法
技术领域：
：本发明涉及用于辅助鉴定大豆籽粒含油量位点的一对专用引物及其方法。
背景技术：
：基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段，辅之于高效率地基因型定向选择，才能快速高效地培育出优异大豆新品种。随着分子生物学和基因组学的迅速发展，分子标记技术的应用更加广泛。基于PCR的分子标记如SSR等具有多态率高、相对稳定、检测方法简便快速及易于操作等特点而深受育种家的青睐。由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰等，可以从分子水平定向选择目标性状基因(或称胶上选择)，同时还有可能打破不利基因之间的连锁而高效率地聚合多个优良基因于一体。通常所说的分子标记既包括目标基因的连锁标记也包括目标基因自身功能标记。分子标记辅助多基因聚合育种技术已经成为大豆等作物育种研究的一种发展趋势，运用该技术能否有效地将优质、多抗和高产等基因聚合到少数骨干品种中，关键在于能否获得足够多的与目标性状基因或主效QTL紧密连锁的实用分子标记。近年来，基于基因组中表达序列标签(expressedsequencetagging,EST)的SSR标记EST-SSR已经发展为新一代的分子标记，得到了广泛的研究和应用，因它是新型的功能标记而且能更有效地用于农作物重要性状基因的辅助选择育种而倍受重视。大豆种子油脂含量属于数量遗传性状，受不等效的多基因控制，存在主效位点，其中有些位点受加性效应控制，并存在一定的显性效应和上位效应。该性状的遗传力中等偏上，高于单株籽粒产量而低于开花期和成熟期等性状，可从Fs、R代开始进行选择。国内外许多研究者对大豆种子油脂含量和脂肪酸含量的QTL进行了分子标记和定位研究，取得了不少进展。Mansur等发现l个与大豆种子油脂含量有关的标记T153-1位于A2连锁群；Brummer等研究发现位于Bl连锁群的l个油脂含量主效位点(可解释31%变异)及其1个相关标记A109、位于A1连锁群的1个油脂位点及其相关标记A104以及位于G连锁群的1个油脂位点(可解释18%以上的变异)及其相关标记A584。南京农业大学与中科院遗传发育所合作研究发现了4个QTL位点与油脂含量紧密相关，解释的表型效应最高达到13.9%，并把这些位点定位于N4-B2和N20-M连锁群。何冉等利用科新3号为父本、中黄20为母本建立重组自交系群体(含有192个株系)，在0连锁群的Sattl53-Satt243区间定位了l个脂肪含量QTL，加性效应为-0.39，表明其减效效应来自于中黄20。
发明内容本发明的目的是提供用于辅助鉴定大豆籽粒含油量位点的一对专用引物及其方法。本发明提供了一种辅助筛选具有高籽粒含油量性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE165引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个275-285bp之间的DNA片段的待测大豆为候选的具有高籽粒含油量性状的大豆；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量》21.5%(质量百分含量)的性状。本发明还提供了一种辅助鉴定大豆高籽粒含油量性状的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE165引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个275-285bp之间的DNA片段的待测大豆具有高籽粒含油量性状；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量>21.5%(质量百分含量)的性状。本发明还保护一对辅助鉴定大豆籽粒含油量性状的专用引物，是GNE165引物对；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成。从实际应用角度出发，上述专用引物主要用于辅助鉴定大豆高籽粒含油量性状；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量》21.5%(质量百分含量)的性状。所述专用引物在制备辅助鉴定大豆籽粒含油量性状的试剂盒中应用也属于本发明的保护范围。从实际应用角度出发，上述专用引物主要用于制备辅助鉴定大豆高籽粒含油量性状的试剂盒；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量》21.5%(质量百分含量)的性状。本发明还保护一种辅助鉴定大豆的籽粒含油量性状的试剂盒，包括所述专用引物。从实际应用角度出发，上述试剂盒主要用于辅助鉴定大豆高籽粒含油量性状；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量》21.5%(质量百分含量)的性状。所述专用引物和所述试剂盒均可应用于筛选具有不同籽粒含油量性状的大豆，特别是筛选具有高籽粒含油量性状的大豆。所述方法、所述专用引物和所述试剂盒均可应用于大豆品质育种，特别是培育高油大豆(即具有高籽粒含油量性状的大豆)。本发明同时保护一个控制大豆籽粒含油量性状的相关位点，定位于大豆分子遗传图谱的Dlb连锁群，与EST-SSR标记GNE165之间的遗传距离为2.lcM。本发明发现，所述GNE165引物对可用于选择大豆的籽粒含油量相关位点，并且得到了一个籽粒含油量相关位点(高籽粒含油量相关位点)，通过该位点可以辅助筛选大豆的籽粒含油量性状(特别是高籽粒含油量性状)和不同籽粒含油量性状(特别是高籽粒含油量性状)的大豆。从而，应用所述GNE165引物，可以辅助筛选大豆的籽粒含油量性状(特别是高籽粒含油量性状)和不同籽粒含油量性状(特别是高籽粒含油量性状)的大豆。因此，本发明的位点和引物对，可以应用于培育具有高油性状的大豆。本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用GNE165标记的专用引物对大豆籽粒高含油量相关位点进行早期世代选择而縮短育种周期，从而快速筛选出籽粒含油量较高的大豆材料。本发明可应用于大豆高油育种，以提高育种效率和大豆籽粒含油量。图1为大豆籽粒含油量相关位点力s必的定位情况图2为GNE165的专用引物对扩增高油组和低油组大豆材料基因组DNA的电泳分离结果；M:DNA分子量Marker(100bpDNALadder)。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例l大豆籽粒含油量相关位点(高含油量相关位点)oZ/6的获得一、引物合成GNE165引物对序列获自S0YBASE数据库(从大豆EST序列中选取的上游与下游引物序列之间包含一段由2-3个碱基串联重复构成的SSR特征序列)；上游引物为5，-CCCACTGTCTCACTCACACT-3，；下游引物为5，-TGCACAACTTCACATTGTCT-3，；上下游引物之间包含SSR的特征序列。引物合成委托北京奥科生物公司完成。二、双亲基因组扩增检测用于创建大豆重组自交系(recombinantinbredline,RIL)群体的双亲分别是中黄4(国家大豆种质资源库)和中品661(国家大豆种质资源库)。中黄4为母本，其籽粒油脂含量较低(18.7%-20.5%);中品661为父本，其籽粒油脂含量较高(21.5%-22.3%)。采用CTAB法提取双亲植株叶片的基因组DNA，以GNE165引物对进行扩增实验。PCR反应体系为10XBuffer2ul(含Mg20，dNTP0.4ul(10mM)，上游引物和下游引物各2u1(5uM)，基因组DNAluK40ng/u1)，Taq酶O.5u1(5U/u1)，反应体积为20wl，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为94。C5min;94°C60s、53.5。C60s、72°C60s，35个循环;72°C10min。PCR扩增产物用9%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并在紫外灯下观察拍照。结果显示，GNE165引物对的扩增产物在双亲基因组之间可以检测到多态性。三、群体扩增检测及连锁分析定位用以上两个亲本进行杂交，得到杂种F,，通过"单粒传"法构建遗传群体，获得475个F^代重组自交系。"单粒传"法步骤如下在父母本杂交当代从母本植株上收获的一粒种子种植后长成一个R代单株，其自交(即自花授粉)结实收获1株F2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的F2代株行，它的每一单株自交结实收获F3代种子，将分离的同类性状植株单收并脱粒装袋，每株种子次年单独种植一个F3株行，自交结实收获F4代种子，……，直至各家系内不同植株之间的性状完全稳定一致。像这样最初由单粒种子经过连续多代自交、分离、纯化、种植、选育及鉴定等程序，最终发展成一个由数百个甚至数千个重组自交系构成的大群体，即为"单粒传"法构建群体。其特征是各家系内不同植株之间的性状稳定一致，而家系间的性状差异较大。用GNE165引物对逐一扩增群体中所有株系的基因组DNA，结合使用计算机作图软件(MAPMAKER/EXPVER3.0和WINQTLCARTVERSION2.5)分析，确定了一个籽粒含油量性状相关位点，将其命名为0276。w76定位于大豆分子遗传图谱的Dlb连锁群，与其连锁标记GNE165之间的遗传距离为2.lcM(见图1)。实施例2GNE165引物对的扩增产物与大豆籽粒含油量性状的相关性验证从我国不同大豆生态区征集到48份大豆资源材料(纯合品种或品系)。采用CTAB法分别提取每份大豆植株叶片的基因组DNA，以GNE165引物对进行扩增实验。PCR反应体系为10XBuffer2ul(含Mg20，dNTP0.4ul(10mM)，上游引物和下游引物各2ul(5uM)，基因组DNAlu1(40ng/u1)，Taq酶0.5U1(5U/w1)，反应体积为20u1，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为94°C5min;94°C60s、53.5°C60s、72°C60s,35个循环；72°C10min。PCR扩增产物用9%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并在紫外灯卞观察拍照。结果见图2。也可以采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，观察相应的特异片段。取48份植株所结的籽实，采用近红外谷物品质分析仪(INFRATEC1255FOOD&FEEDANALYZER)对其含油量进行分析测定(设置三次重复试验，结果取平均值)。该48份大豆根据籽实的含油量可以划分为两组37份为高油组(含油量》21.5%)，ll份为低油组(含油量《18.5%)，详见表l。表1高油组和低油组大豆材料的籽粒含油量高油组》21.5%低油组《18.5%材料编号材料名称油分%材料编号材料名称油分%124P-4a21.824PEKING*17.3224P-12a21.833汾豆62'17.832635a21.934汾豆65'18.514Hobbit*23.054灰布支'17.822KS00-9a21.760晋豆21*16.726北豆5号'21.475科丰1号'17.62721.9133滑20*18.237汾豆83*21.6156京黄3号*18.439高丰l号'22.017795c-13*18.541哈96-3'21,9191阜8233-3-4*18.342邯豆5号'22.4192豫豆2号'17.944合丰42号*21.5共计ll个样本48黑农41号*22.050黑农44号'22.751黑农45号421.652黑农46号*22.156吉林35号'21.458冀豆17*22.359晋豆19号*22,664晋遗39号*21.567抗线3号*22.293石大豆1号*21.8106早熟18*23.0112中黄38号'21.9<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>共计37个样本来自同家人豆种质资源库；3购自北京科遗农业科技有限公司。结合PCR扩增实验的结果(图2)和籽粒含油量的测定结果(表l)，分析如下由图可见，上述供试大豆样本中大多数都存在一个275-285bp之间的DNA片段的等位变异，该DNA片段所代表的平均含油量(是将所有具有该片段的样本的含油量取平均数得到的)为22.0%。在全部37份高油材料中有28份均能检测到该等位变异的特异带型(图2中箭头所示)，符合率为75.68%;在所有ll份低油材料中均未检测到该特异带型。因此，EST-SSR标记GNE165可用于分子标记辅助选择，在高油大豆育种计划中发挥重要作用。序列表〈110〉中国科学院遗传与发育生物学研究所<120〉辅助鉴定大豆籽粒含油量位点的一对专用引物及其方法<130〉CGGNARY92462<160〉2<210>1<211〉20<212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223〉〈400〉1cccactgtctcactcacact20〈210〉2<211>20<212〉腿〈213〉人工序列<220><223〉〈400〉2tgcacaacttcacattgtct20权利要求1、一种辅助筛选具有高籽粒含油量性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE165引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个275-285bp之间的DNA片段的待测大豆为候选的具有高籽粒含油量性状的大豆；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量≥21.5％(质量百分含量)的性状。2、一种辅助鉴定大豆高籽粒含油量性状的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE165引物对进行PCR扩增，检测扩增产物；扩增产物中含有一个275-285bp之间的DNA片段的待测大豆具有高籽粒含油量性状；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量>21.5%(质量百分含量)的性状。3、辅助鉴定大豆籽粒含油量性状的专用引物，是GNE165引物对；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成。4、权利要求3所述专用引物在制备辅助鉴定大豆籽粒含油量性状的试剂盒中的应用。5、一种用于辅助鉴定大豆籽粒含油量性状的试剂盒，包括权利要求3所述专用引物。6、权利要求3所述专用引物或权利要求5所述试剂盒在辅助筛选具有不同籽粒含油量性状的大豆中的应用。7、权利要求1或2所述方法、权利要求3所述专用引物或权利要求5所述试剂盒在大豆育种中的应用。8、控制大豆籽粒含油量性状的相关位点，定位于大豆分子遗传图谱的Dlb连锁群，与EST-SSR标记GNE165之间的遗传距离为2.lcM。全文摘要本发明公开了辅助鉴定大豆籽粒含油量位点的一对专用引物及其方法。本发明提供的辅助筛选具有高籽粒含油量性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE165引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个275-285bp之间的DNA片段的待测大豆为候选的具有高籽粒含油量性状的大豆；所述GNE165引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高籽粒含油量性状为籽粒的含油量≥21.5％(质量百分含量)的性状。本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用GNE165标记的专用引物对大豆籽粒高含油量性状相关位点进行早期世代选择而缩短育种周期，从而快速筛选出籽粒含油量较高的大豆材料。本发明可应用于大豆高油育种，以提高育种效率和大豆籽粒含油量。文档编号C12Q1/68GK101613754SQ200910090319公开日2009年12月30日申请日期2009年8月7日优先权日2009年8月7日发明者任海红,张利明,徐民新,朱保葛,田苗苗,丽赵,陈修文申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所