与大豆不饱和脂肪酸相对含量性状连锁的Indel标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学辅助育种领域，具体涉及一个与大豆籽粒不饱和脂肪酸相 对含量性状紧密连锁的Indel标记及应用。
【背景技术】
[0002] 大豆是植物油的主要来源之一。脂肪酸是大豆油脂的主要成分，其含量约占脂肪 总量的90%。脂肪酸按性质可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中饱和脂肪酸包括棕榈 酸和硬脂酸，不饱和脂肪酸包括油酸、亚油酸和亚麻酸。大豆油脂中的不饱和脂肪酸可降低 人体中的胆固醇含量，从而降低患心血管疾病的风险。此外，不饱和脂肪酸中的亚麻酸因人 类自身不能合成、代谢、转化，需从食物中摄取，缺乏亚麻酸即会引导起机体脂质代谢紊乱， 导致免疫力降低、健忘、疲劳、视力减退、动脉粥样硬化等症状的发生。
[0003] 脂肪酸合成主要在质体中发生，随后运输到内质网等细胞器，最终加工成三酰甘 油。蔗糖为脂肪酸合成的主要碳源，其经糖酵解途径依次生成磷酸己糖、丙糖和烯醇丙酮 酸。丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下合成乙酰辅酶A，随后在乙酰辅酶A羧化酶催化下，形成 丙二酰单酰辅酶A。丙二酰单酰辅酶A在脂肪酸合酶催化下，进行连续的聚合反应，其中丙二 酰基与酰基载体蛋白（ACP)结合，并作为脂肪酸合成的碳供体，每次循环增加两个碳原子合 成酰基碳链，最终合成含有酰基蛋白的饱和脂肪酸棕榈酸16:0-ACP和硬脂酸18:0-ACP。硬 脂酸18:0-ACP在硬脂酸-ACP去饱和酶的催化下形成油酸18:1-ACP。在酰基-ACP硫脂酶催化 下，将脂肪酸从ACP上释放出来，分别形成棕榈酸（16:0)、硬脂酸（18:0)、油酸（18:1)。油酸 在脂肪酸脱氢酶催化下去饱和形成亚油酸，亚油酸进一步去饱和形成亚麻酸。大豆脂肪酸 合成途径中的关键酶(主要是乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸脱氢酶)对脂肪酸的最终含量和不 同组份的比例起重要作用。除此之外，Dof类转录因子GmDof4和GmDof11可能通过对合成关 键酶的调控来影响脂肪酸含量。
[0004]Dof(DNA_bindingwith-onefinger)蛋白是植物转录因子主要家族成员之一，也 是植物特有的一类转录因子，在其他真核生物如酵母、线虫、果蝇和人类中都没有发现。Dof 蛋白有一个特点，N末端有一个由50 - 52个氨基酸残基构成的C2/C2锌指蛋白DOF结构域，它 能够特异性的识别植物启动子序列中的AAAG/CTTT作用元件，从而激活或抑制植物基因的 表达。大豆中Dof基因家族成员共有83个，通过生物信息学分析可将其分为九组，各组Dof转 录因子基因在外显子和内含子区以及它们的功能区均比较保守。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一个与大豆不饱和脂肪酸相对含量性状紧密连锁的分子标记及应 用，并提供了该标记在筛选不饱和脂肪酸相对含量高低的大豆种质资源上的应用。
[0006]本发明的技术方案如下：
[0007] 一种与大豆不饱和脂肪酸相对含量性状紧密连锁的Indel标记，其特征在于:所述Inde1标记的引物的核苷酸序列如下：
[0008] InDelF/InDelR:
[0009] AGCGTTACGCCACAATGA/GAACCTATTAGCCGTTTGAGAA
[0010] 所述引物扩增的与大豆低油酸、高亚油酸、高亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条 带为1136?，其核苷酸序列如369 10如.5所示；
[0011] 所述引物扩增的与大豆高油酸、低亚油酸、低亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条 带为11(^?，其核苷酸序列如369 10如.6所示。
[0012] 用于筛选不饱和脂肪酸相对含量高低的大豆种质资源的试剂盒，其特征在于，包 括所述Indel标记的引物；
[0013]所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：
[0014] InDelF/InDelR:
[0015] AGCGTTACGCCACAATGA/GAACCTATTAGCCGTTTGAGAA
[0016] 所述引物扩增的与大豆低油酸、高亚油酸、高亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条 带为1136?，其核苷酸序列如369 10如.5所示；
[0017]所述引物扩增的与控制大豆高油酸、低亚油酸、低亚麻酸性状连锁的Indel标记特 征条带为11(^?，其核苷酸序列如369 10如.6所示。
[0018]所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
[0019]用于筛选不饱和脂肪酸相对含量高低的大豆种质资源的方法，其特征在于，采用 权利要求1所述的Indel标记或权利要求2-3任一所述的试剂盒进行如下步骤：
[0020] (1)采用所述Indel标记的引物对待选大豆材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述 Inde1标记的引物的核苷酸序列如下：
[0021] InDelF/InDelR:
[0022] AGCGTTACGCCACAATGA/GAACCTATTAGCCGTTTGAGAA
[0023] (2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
[0024] (3)从电泳检测结果中筛选出现与大豆低油酸、高亚油酸、高亚麻酸性状连锁的 Indel标记特征条带和/或与大豆高油酸、低亚油酸、低亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条 带一致的材料；
[0025]所述引物扩增的与大豆低油酸、高亚油酸、高亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条 带为1136?，其核苷酸序列如369 10如.5所示；
[0026]所述引物扩增的与大豆高油酸、低亚油酸、低亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条 带为11(^?，其核苷酸序列如369 10如.6所示。
[0027]所述PCR扩增的反应体系为：双蒸水13.5yL，10 X PCR缓冲液2yL，2.5mMdNTPlyL，taq酶0.5yL，Indel标记引物对各0.5yL，基因组DNA2yL，总体系为20yL。
[0028] 所述PCR扩增的反应程序为:95°C预变性2min;以95°C30s、52°C20s、72°C30s为1个 循环，共35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0029] 所述凝胶电泳检测指，采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于200V恒功率电泳分 离，最后银染显色。
[0030]-种用于筛选不饱和脂肪酸相对含量高低的大豆种质资源的试剂盒的制备方法， 其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括所述的Indel标记的标记引物。
[0031]组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。
[0032]本发明发现在大豆8号染色体上的一个GmDof08.3基因（L0C102660774,位于大豆 参考基因组8号染色体的36252707至36253918bp)在两个不饱和脂肪酸含量差异显著的大 豆品种中存在一个InDel差异，对此位点开发了一对检测标记。根据此标记在这两个品种衍 生的重组自交系的分布，以及重组自交系群体不饱和脂肪酸含量分布进行相关和连锁分 析，同时根据此标记在275份大豆种质资源的分布与不饱和脂肪酸含量的相关分析，表明这 个标记与不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸、亚麻酸)相对含量显著相关，可用于分子育种中不饱 和脂肪酸含量的分子标记辅助选择。
[0033]本发明提供了一种与大豆不饱和脂肪酸相对含量性状紧密连锁的Indel标记，其 特征在于:所述Indel标记的引物的上下游核苷酸序列分别如Seq ID No.l和Seq ID No.2 所示;所述引物扩增的与大豆低油酸、高亚油酸、高亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条带 为113bp，其核苷酸序列如Seq ID No.5所示;所述引物扩增的与大豆高油酸、低亚油酸、低 亚麻酸性状连锁的Indel标记特征条带为llObp，其核苷酸序列如Seq ID No.6所示。采用所 述Indel标记的引物扩增大豆基因组DNA，可能出现三种电泳结果：仅出现113bp的条带，说 明相应的大豆为具有低油酸、高亚油酸、高亚麻酸性状的纯合材料，且该大豆不饱和脂肪酸 相对含量特征是低油酸、高亚油酸、高亚麻酸；仅出现ll〇bp，说明相应的大豆为具有高油 酸、低亚油酸、低亚麻酸性状的纯合材料，且该大豆不饱和脂肪酸相对含量特征是高油酸、 低亚油酸、低亚麻酸；同时出现113bp和110bp两种条带的为显性杂合材料，不属于目标选择 材料。