[0034]本发明采用其它遗传背景的大豆材料验证了该标记与脂肪酸含量的关系，结果表 明，所述Indel标记引物能够较为准确地区分出低油酸、高亚油酸、高亚麻酸的材料组别与 高油酸、低亚油酸、低亚麻酸的材料组别，由此说明本发明所述的Indel标记可广泛应用于 各种大豆材料，用于筛选不饱和脂肪酸含量各异的目标材料。
[0035] 可见采用所述Indel标记，可以在大豆生长周期的任一阶段获知该大豆不饱和脂 肪酸相对含量特征，从而筛选出符合育种条件的具有不同不饱和脂肪酸含量的大豆育种材 料。采用本发明所述的Indel标记对不饱和脂肪酸相对含量高低的大豆种质资源进行筛选， 具有限制少、较准确、效率高等特点。
[0036]本发明还提供了一种包含所述Indel标记的引物的用于筛选不饱和脂肪酸相对含 量高低的大豆种质资源的试剂盒及其制备方法。任何规模的基于商业目的销售或生产所述 试剂盒的行为都属于本发明请求保护的范围，其中生产所述试剂盒的行为指组装试剂盒的 试剂中包括权利要求1所述的Indel标记的标记引物。
[0037]本发明还请求保护采用所述Indel标记或所述试剂盒进行不饱和脂肪酸相对含量 高低的大豆种质资源筛选的方法，即采用所述Indel标记的引物扩增待测大豆材料的基因 组DNA，通过常规的PCR反应和电泳检测确定出符合育种条件的具有不同不饱和脂肪酸含量 的大豆育种材料。采用本发明所述的Indel标记或所述试剂盒筛选大豆种质资源，可以在大 豆生长周期的任一阶段取样并检测，并准确预测出该大豆材料成熟后籽粒的3种不饱和脂 肪酸（油酸、亚油酸、亚麻酸）的相对含量特征，大大提高了育种效率，在实际育种和生产中 具有广阔的应用前景。
[0038] 说明书附图
[0039]图1为GmDofOS. 3基因在鲁黑豆2号和南汇早黑豆两个品种材料中的特征序列比对 图谱。
[0040]图2为本发明所述InDel标记在鲁黑豆2号和南汇早黑豆两个品种材料中的特征序 列电泳图谱。
【具体实施方式】
[0041]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范 围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获 得。
[0042]生物材料的来源和记载出处
[0043] 鲁黑豆2号和南汇早黑豆均为国内现有的公知品种，分别记载于《中国大豆品种资 源目录》，可商购获得。
[0044] 实施例1、本发明所述的Indel标记
[0045] 1.实验材料
[0046] 鲁黑豆2号主要在我国大豆黄淮海产区种植，籽粒为黑色种皮。南汇早黑豆主要在 我国南方大豆产区种植，也为黑色种皮。以两者作为杂交亲本进行杂交，从F2代植株开始自 交，获得包含200个个体的重组自交系(RIL)群体。
[0047] 2.两个大豆品种脂肪酸提取和脂肪酸相对含量的测定
[0048] 1)准确称取大豆粉30 ·Omg，放入2 ·OmL的离心管中，加入1 ·OmL正己烧浸提20min， 然后加入l.OmL0.5mol/L甲醇钠溶液进行甲酯化，充分摇匀lOmin，使其充分甲酯化，静置， 取上清液放置于色谱专用样品瓶中，4°C冰箱保存。
[0049] 2)脂肪酸组分的气相色谱检测条件
[0050] 大豆脂肪酸含量采用岛津GC-2010气相色谱仪进行定性定量检测。气相色谱仪分 析检测条件，色谱柱:RTX-Wax(30mX0 · 25mmX0 · 25μπι);自动进样，进样量：lyL;采用分流进 样，分流比：40:1;进样口温度:250°C;载气:氮气，54mL·min-1;氢气，40mL·min-1;空气， 400mL·min-1;采取程序升温的方式：180°C保持1.5min，以10°C·min-1升到210°C，保持 2min，然后以5°C·min-1升到220°C保持5min;检测器:火焰离子检测器(FID)，温度为300 °C;每个样品检测20min，样品检测之间间隔2min。
[0051]根据5种脂肪酸保留时间不同对其定性，并根据峰面积对5种脂肪酸的相对含量进 行定量。不同脂肪酸组份的相对含量用占总脂肪酸含量的百分比来表示。
[0052]结果表明，两亲本的不饱和脂肪酸相对含量中存在显著差异(P〈0.05)，油酸含量 鲁黑豆2号为25.4%，南汇早黑豆为30.8%;亚油酸含量鲁黑豆为52.8%，南汇早为47.4%; 亚麻酸含量鲁黑豆2号为8.4%，而南汇早黑豆为6.0%。
[0053] 3.两个大?品种基因组DNA提取
[0054] 采用CTAB提取方法提取基因组DNA。步骤为：
[0055] l)在65°C预热CTAB提取液（2%CTAB，2%PVP40，l·4MNaCl，20mMEDTApH8·0， lOOmMTrisHCl pH 8.0,2%2_巯基乙醇）。
[0056] 2)取幼嫩叶片约lg在液氮中用研钵和研杵研磨粉末，加入700yL预热的提取液于 65°C水浴孵育lh。
[0057] 3)加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1)，摇床上摇10 - 20min，12000rpm，离心lOmin。
[0058] 4)取上清至一新的1.5mL管中，加入0.7体积预冷的异丙醇，100yL醋酸钠(pH5.2)， 混匀，-20°C放置30min。
[0059] 5) 12000rpm离心1Omin。弃去上清，用70 %酒精清洗沉淀1次。
[0060] 6)弃去酒精，在空气中晾干沉淀，加入适量灭菌水溶解沉淀。
[0061 ] 4.两个品种Dof类转录因子基因GmDof08.3基因（GeneID:L0C102660774)的序列 差异分析。
[0062] 用序列如SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所示的上下游引物对两亲本的Dof类转录因 子基因GmDof08.3基因（GeneID:L0C102660774)进行扩增。对扩增结果用DNAMAN (versions)进行序列比对，发现在两个品种中，该基因表现出连续三个碱基的差异。具体为 南汇早黑豆中此基因起始密码子下游841-843位点的GGT缺失，造成翻译的蛋白质中缺失一 个甘氨酸(图1)。
[0063] 5.开发针对此差异位点的分子标记。
[0064] 在这个InDel位点两侧设计引物，上下游引物序列如SeqIDNo. 1和SeqIDNo.2 所示。这对引物在鲁黑豆中扩增出113bp的PCR产物，在南汇早黑豆中扩增出1lObp的PCR产 物。其中PCR反应体系（双蒸水13 · 5yL，10XPCR缓冲液2yL，2 · 5mMdNTPlyL，taq酶0 · 5yL， Indel标记引物对各0.5yL，基因组DNA2yL，总体系为SOyLhPCR扩增条件(95°C预变性2min， 之后以95°〇3〇8,52°〇2〇8,72°〇3〇8为1个循环，进行35循环的扩增，最后72°(3延伸1〇1^11)。利 用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，条件（电压200V，电流200mA，电泳lh。采用20%硝酸 银染色l〇min，蒸馏水冲洗2-3次，利用3 %的NaOH和0.67 %的甲醛显影10min，蒸馏水冲洗2-3次。
[0065] 显影后将胶放在观片灯下读取记录带型，如图2,鲁黑豆2号带型为长度113bp的条 带，南汇早带型记为长度1l〇bp的条带。这两组PCR产物经测序，其对应的核苷酸序列分别如SeqIDNo.5和SeqIDNo.6所示，即本发明所述的Indel标记。
[0066]实施例2、本发明所述Indel标记与不饱和脂肪酸含量相关性分析 [0067] 利用实施例1步骤3所示的DNA提取方法对由鲁黑豆2号和南汇早黑豆杂交所形成 的200个F5:8代重组自交系群体基因组DNA分别进行提取。利用序列表序列1所示的单链DNA 和序列表序列2所示的单链DNA作为引物，进行PCR扩增，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析记 录条带，鲁黑豆2号带型记为A，南汇早带型记为B，同时出现A和B两个带型为杂合带型，标记 为H。同时利用实施例1中所示的脂肪酸提取和定量方法分别测定此群体中各自交系从2009 ~2011年三年的不饱和脂肪酸相对含量。
[0068]以条带类型对重组自交系材料进行分组，可分为A、B和Η组，利用SPSS统计软件对A、B和Η组3种不饱和脂肪酸含量进行方差分析。