一种大规模培养nkt细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体设及一种大规模培养NKT细胞的方法。
【背景技术】
[0002]NKT细胞（自然杀伤T细胞）是继自然杀伤细胞（NK细胞）、T淋己细胞、B淋己细 胞之后又一类新型的T淋己细胞，属于第4类免疫细胞。NKT细胞主要分布在骨髓、肝和胸 腺，在脾、淋己结和外周血中也有少量存在。NKT细胞绝大多数为CD4-CD8-双阴性T细胞， 少数为CD4+单阳性T细胞。NKT细胞表面TCR可识别不同祀细胞表面CDl分子提呈的共有 楠脂类和糖脂类抗原，且不受血IC限制。NKT细胞最佳刺激效应物是a-半乳糖神经酷胺 (a-Galcer)，是一类来源于海绵体或共生微生物的提取物。
[0003] NKT细胞的主要生物学功能是细胞毒和免疫调节作用。NKT细胞的细胞毒作用表 现在NKT细胞可组成性表达IL-12IL-2和IFN-丫等细胞因子的受体。在相应抗原或细胞因 子作用下，NKT细胞活化，并通过分泌穿孔素使某些病毒感染、胞内寄生菌感染的祀细胞和 肿瘤祀细胞发生溶解破坏；也可通过表达经化s/化SL途径使上述祀细胞发生调亡。 而NKT细胞的免疫调节作用表现在活化NKT细胞可分泌比-4和IFN- 丫等细胞因子。比-4 可诱导CD4+ThO细胞向CD4+Th2细胞分化，参与体液免疫应答或诱导B细胞发生I姐类别 转换，参与速发型超敏反应；IFN-丫与比-12协同作用，可使CD4+ThO细胞向CD4+Thl细胞 分化，增强细胞免疫应答。此外NKT细胞还可分泌多种趋化性细胞因子如MCP-Ia、MIP-e1 等参与炎症反应。
[0004] 近几年在其表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗和自身免 疫性疾病治疗等方面的研究有了很大的发展。现有研究表明，NKT细胞在肝炎、脂肪肝等肝 病的发病过程中发挥重要作用，总之，NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞，在癌症抗肿 瘤、抗感染、自身免疫性疾病等治疗中具有远大的应用前景。 阳〇化]目前NKT细胞的培养主要是直接添加细胞因子诱导纯化刺激细胞增殖或通过筛 选特定细胞株共同培养刺激细胞的增殖，使分离外周血得到的PBMC中NKT细胞纯化增殖。 但上述培养方法培养的细胞数量少，操作繁琐、效率低。而效应细胞数量的多少，直接影响 了杀伤率，也就影响到各种疾病的治疗效果。此外还可通过筛选癌症细胞株福照后诱导培 养NKT细胞。但此法有具有一定的安全隐患，如福照不完全，可能给患者引入新的癌细胞。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种大规模培养NKT 细胞的方法。采用本发明所述大规模培养NKT细胞的方法能刺激NKT细胞的大量增殖，高 效简单，安全无害。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种大规模培养NKT细胞的方法，包括如下步骤：
[0009] A、用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基重悬PBMC，加入铁皮石解素和自体血 清；
[0010]B、将重悬后的PBMC接种到含有成熟DC细胞的诱导MT细胞的培养板中，37°C、 5%C〇2培养箱中解育；
[0011] C、解育5天后，将培养板中诱导的NKT细胞转入细胞培养瓶扩增培养，培养到第14 天收集细胞。
[0012] 本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A在培养基中添加铁皮石解素和自 体血清。自体血清可W为细胞提供生长所需的细胞因子和营养物质，且安全性高。而铁皮 石解素的添加不仅能促进NKT细胞的增殖和生长，同时具有辅助治疗作用，且安全无毒副 作用。
[001引其中，在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A中所述 加入铁皮石解素的终浓度为2mg/mL~12mg/血。
[0014] 在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A中所述自体 血清的加入量为含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基的lOv/v%。
[0015] 在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养MT细胞的方法步骤A重悬后的 PBMC的细胞密度为0. 5X1〇6个/血~1X10 6个/mL。
[0016] 在一些实施方案中，本发明大规模培养MT细胞的方法步骤A中所述RPMI1640培 养基中比-2的浓度为lOOU/mL~lOOOU/mL，比-15的浓度为50ng/mL~200ng/mL。
[0017] 本发明所述的大规模培养MT细胞的方法步骤B采用成熟DC细胞固定在培养板 上与PBMC共同培养诱导NKT细胞，提供了相对稳定的培养环境，同时提高了安全性。
[0018] 在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法中步骤B所述含有 成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备方法为用含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培 养基重悬PBMC于37°C、5%C〇2培养箱中培养，每隔3天换一次液，第5天加入肿瘤抗原，第 6天加入TNF-a，第7天收集成熟的DC细胞，在37°C、5%C〇2培养箱中铺板培养。
[0019] 其中，在一些实施方案中，所述含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备 方法中所述含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基中GM-CSF和IL-4的浓度均为200U/ 血~800U/mL。
[0020] 在一些实施方案中，所述含有成熟DC细胞的诱导MT细胞的培养板的制备方法中 所述肿瘤抗原的工作浓度为20Jig/mL~80Jig/mL。
[0021] 在一些实施方案中，所述含有成熟DC细胞的诱导MT细胞的培养板的制备方法中 所述TNF-a的工作浓度为200U/mL~800U/mL。
[0022] 在一些具体实施方案中，所述铺板培养的时间为化。
[0023] 本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法中步骤C将培养板中诱导的NKT细胞转 入细胞培养瓶扩增培养。
[0024] 在一些实施方案中，所述扩增培养具体为每隔2天进行补液，补液前保证细胞的 密度不大于3XIO6个/mU补液后保证细胞密度为0. 5X10 6个/mL~1X10 6个/mL。
[00巧]其中，所述补液成分与步骤A完全相同。即含有IL-2、比-15、铁皮石解素和自体血 清的RPMI1640培养基，所述RPMI1640培养基中IL-2的浓度为lOOU/mL~lOOOU/mL，比-15 的浓度为50ng/mL~200ng/mU所述铁皮石解素的终浓度为2mg/mL~12111旨/111以所述自体 血清的加入量为含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基的lOv/v%。
[0026] 本发明所述的大规模培养MT细胞的方法还包括PBMC分离的步骤。
[0027] 在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法采用淋己细胞分离 管分离PBMC，分离得到的PBMC更多，且红细胞少，减少后期红细胞对NKT细胞生长的影响。
[0028] 在一些实施方案中，所述PBMC分离的步骤具体为抽取外周血，用生理盐水按1:1 的比例稀释，缓慢的加到Ficoll淋己细胞分离液上，SOOg离屯、20min;离屯、结束后，抽取单 核球（PBMC)条带层于离屯、管中，用生理盐水定容后400g离屯、IOmin;将上述离屯、的PBMC再 次 400g离屯、lOmin。
[0029] 本发明所述大规模培养MT细胞的方法用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基 重悬PBMC，加入铁皮石解素和自体血清；将重悬后的PBMC接种到含有成熟DC细胞的诱导 NKT细胞的培养板中，37°C、5%C〇2培养箱中解育；解育5天后，将培养板中诱导的NKT细胞 转入细胞培养瓶扩增培养，培养到第14天收集细胞。本发明所述方法操作简单，安全无害。 实验表明，采用本发明所述大规模培养NKT细胞的方法能刺激NKT细胞的大量增殖，并且培 养的NKT细胞细胞活率高，对K562细胞的杀伤能力明显增强。
【附图说明】
[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0031] 图1示实施例3中A组培养方法培养的P2代NKT细胞的细胞表面标志物的表达 结果图，其中图a为FSC及SSC表达情况图，图b为CD56及CD3表达情况图；
[0032] 图2示实施例3中B组培养方法