一种用于再生处理细胞和病毒培养用微载体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞及病毒培养用微载体的再生处理方法，其属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 上个世纪60年代W来，随着细胞生物学、培养系统W及培养方法等领域的不断丰 富和完善，动物细胞体外培养技术得到了突飞猛进地发展，现已成为生物医药和医学研究 中广泛采用的技术方法。目前，利用动物细胞培养技术生产出很多具有重要医用价值的疫 苗、单抗、细胞因子、蛋白类药物和酶类物质。
[0003] 毋庸置疑，动物细胞大规模培养技术已成为了生物技术制药中非常重要的环节。 而微载体作为细胞领域绝大多数的贴壁动物细胞贴壁介质，其质量的优劣会直接影响细胞 的生长，甚至可W影响W细胞为宿主的病毒的增殖。因此，大规模动物细胞培养技术中，经 常把生物反应器和微载体一起称为生物反应器微载体培养系统，可见二者在规模化培养过 程中的密切关系和重要性。
[0004] 作为细胞培养介质，早在1967年，Van Wezel为贴壁依赖性细胞的高产培养就已 提出"微载体"培养系统的概念。经过W后几十年，尤其是生物反应器在细菌发酵罐控制模 式基础上的升级换代，微载体培养技术现已广泛地应用于动物细胞的大规模体外培养。但 是，由于我国在微载体制造技术上还不成熟，微载体来源还只能依赖于国外进口。进口的微 载体由于技术的垄断，其价格昂贵，致使大规模的细胞或病毒培养工艺中，微载体的成本占 据了大部分研发和生产成本，无形中给国内生物制药技术的发展造成了很大影响。
[0005] 为了降低该部分成本，W及避免在大规模细胞或病毒培养过程中意外原因造成培 养终止而使微载体没有充分利用而废弃。许多利用微载体大规模培养细胞或病毒来开发 和生产生物医药的企业，对使用过的微载体进行了重复处理方法的摸索与建立(如申请号 201210075589. 2专利，W及文献《微载体再生的研究》（作者；李志强、王妍、官桂范、李云富 等，发表于《中国生物制品学杂志》1994年第7第3期)），但对于采用该些方法处理再生的 微载体，尚未在细胞培养效果或病毒培养效果方面进行评估。其中，对于微载体处理效果的 好坏，不仅要评估处理后的微载体表面是否干净，不贴附异物，更重要的是评估该微载体再 生处理后在培养细胞或病毒过程中的培养效果好坏。
[0006] 因此，本领域还需要提供新的微载体再生处理方法，并且提供评估该方法再生处 理得到的微载体是否能够保证细胞和病毒正常、良好的培养应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服上述的技术的不足，而提供一种细胞及病毒培养用微载体 再生处理方法，该方法使处理后的微载体培养效果可达到新使用的微载体细胞及病毒培养 效果的95%-100%。并且采用该种再生处理方法，最少可W使微载体反复使用4-5次，第5次 使用时，细胞或病毒培养效果仍为第1次使用的新微载体培养效果的90%-95%。
[000引本发明的目的通过w下技术方案得W实现：
[0009] 本发明提供的一种用于再生处理微载体的方法包括W下步骤：
[0010] 1)微载体收集；用娃化好的玻璃瓶收集含细胞和/或培养过的微载体的培养液， 自然沉降15-30分钟，弃掉上清液，保留微载体在玻璃瓶中；
[0011] 2)微载体碱处理：向经沉降得到的微载体中加入氨氧化轴溶液，所述氨氧化轴溶 液的浓度为0. 1-1. Omol/L，微载体与加入的氨氧化轴溶液的体积比为1:1-1:2,摇动3-5分 钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液；
[0012] 3)微载体的第一次洗涂：向经沉降得到的微载体中加入洗涂液I，所述洗涂液I 为含有0. 01%-0. 05%聚山梨醋80的10-30mmol/L、抑值7. 4-7. 8磯酸盐缓冲液，微载体与 加入的洗涂液I的体积比为1:2-1:3,摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液， 并重复此项操作2次；
[0013] 4)微载体消化液处理；向经沉降得到的微载体中加入消化液，所述消化液W 质量百分比含量计包含0. 2%-0. 4%膜蛋白酶、0. 02%二己胺四己酸二轴、0. 85%氯化轴、 0. 01%-0. 05%聚山梨醋80,微载体与加入的消化液的体积比为1:1-1:2,摇动3-5分钟后，自 然沉降20-40分钟，弃掉上清液；
[0014] 5)微载体酸处理；向经沉降得到的微载体中加入巧樣酸溶液，所述巧樣酸溶液的 浓度为0. 05-0.1mol/L，微载体与巧樣酸溶液的体积比为1:1，摇动3-5分钟后，自然沉降 15-30分钟，弃掉上清液；
[0015] 6)微载体第二次洗涂；向经沉降得到的微载体中加入洗涂液II，所述洗涂液II为 10-30mmol/L、抑值7. 4-7. 8磯酸盐缓冲液，微载体与洗涂液II的体积比为1:2-1:3,摇动 3-5分钟后，自然沉降20-40分钟，弃掉上清液，重复此项操作2-3次。
[0016] 并且，根据实际应用，所述方法还包括：
[0017] 7)取处理好的微载体样品在显微镜下观察及抑值测定；和/或
[0018] 8)处理好的微载体灭菌处理；将微载体进行12rc高压灭菌15-45分钟，室温自然 冷却后，置于2-8C的情况下保存备用。
[0019] 在本发明的优选技术方案中，上述步骤中用到的氨氧化轴溶液浓度为0. 5mol/L。
[0020] 优选地，所述洗涂液I为含有0. 05%聚山梨醋80的lOmmol/L、抑值7. 6磯酸盐缓 冲液。
[0021] 优选地，所述消化液中各成分的质量百分比为膜蛋白酶0. 2%、己二胺四己酸二轴 0. 02%、氯化轴 0. 85%、聚山梨醋 800. 05〇/〇。
[0022] 优选地，所述巧樣酸溶液的浓度为0. 08mol/L。
[002引优选地，所述洗涂液II为20mmol/L，抑值7. 5磯酸盐缓冲液。
[0024] 优选地，所述步骤7)包括；在显微镜下观察5-10个视野，所看到的微载体表面均 无细胞残骸。
[002引最终得到的微载体息液抑值为7. 0-7. 8。
[0026] W下是本发明的详细描述。
[0027] 本发明所述的一种微载体再生处理方法，包括W下步骤：
[0028] 1.微载体收集；使用娃化好的玻璃瓶收集用于细胞和/或病毒培养过的微载体和 培养液，自然沉降15-30分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液；
[0029] 2.微载体的碱处理：按照上述沉淀与氨氧化轴溶液体积比加入 0. 1-1. Omol/L氨氧化轴溶液，摇动3-5分种，使微载体在溶液中呈均匀息浊液，然后，微载 体息浊液自然沉降15-30分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液；
[0030] 3.微载体的第一次洗涂；按照微载体和洗涂液I (10-30mmol/L，抑值7. 4-7. 8磯 酸盐缓冲液，含有0. 01%-0. 05%聚山梨醋80)体积比1:2-1:3加入洗涂液I，摇动3-5分种， 使微载体在溶液中呈均匀息浊液，然后，微载体息浊液自然沉降15-30分种，使微载体沉淀 下来，弃掉上清液，重复操作此步骤2次；
[0031] 4.微载体的消化液处理：按照微载体与消化液体积比为加入质量百分 比含量为0. 2%-0. 4%膜蛋白酶、0. 02%二己胺四己酸二轴（简称邸TA二轴)、0. 85%氯化轴（简 称化C1 )、0. 01%-0. 05%聚山梨醋80的消化液。摇动3-5分种，使微载体与消化液混合成均 匀的息浊液，然后，室温下静止，自然沉降20-40分种，弃掉上清液；
[0032] 5.微载体的酸处理；按照微载体与巧樣酸溶液体积比1:1，加入0. 05-0.1mol/L巧 樣酸溶液，摇动3-5分种，使微载体