一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物。
【背景技术】
[0002]人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是一种广泛传播的机会性潜伏感染病原体，在发展中国家如中国，成人感染率在90%以上，潜伏感染的HCMV终身存在，人体内难以被清除，在免疫低下的状况下(如肿瘤、器官移植)容易再激活并引起严重的损伤。HCMV感染是新生儿致畸的首要病毒病因。目前对HCMV既无清空潜伏感染的措施，亦无有效的预防母婴垂直传播的手段。
[0003]完全人源化治疗性抗体避免了鼠源单抗可能导致的人抗鼠抗体反应(HAMA)，在临床治疗中可望发挥重要的作用。因为其具有高亲和力和特异性，能够在复杂的混合物中识别微量的抗原并中和抗原。恒定区Fe区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(⑶C)，有效地清除靶细胞。
[0004]治疗性抗体药物已经成为目前生物技术药物中品种最多、销售额最大的类型，在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤和哮喘、银肩病、类风湿性关节炎等自身免疫病的治疗中已经发挥了重要的作用，但用于病毒治疗的报道较少，主要有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗(Synagis)。发展完全人源化的、高效的、稳定性好的、特异性或广谱性的抗病毒治疗性抗体是控制新发和重大病毒性传染病、保障人类健康的迫切需求，也是历史交给我们的迫切任务。近年随着抗体工程技术的进步，完成这一任务正成为现实。
[0005]目前，国内外的单抗药物主要应用于治疗肿瘤、防治器官移植排斥等方面。美国Genentech公司研发的人源化单克隆抗体赫赛汀(herceptin)是第一个针对HER-2阳性乳腺癌的、以癌基因为靶的治疗药物，对转移性乳腺癌有明显疗效。中国第四军医大学细胞工程中心和华神集团共同研发的利卡汀(碘美妥昔单抗注射液)是全球第一个批准上市的用于治疗中晚期原发性肝细胞肝癌的单克隆抗体。中国疾病预防控制中心梁米芳等在利用scFv等抗体库筛选抗病毒抗体方面开展了卓有成效的工作。但总的来看，国内外关于抗病毒治疗性抗体，尤其是关键技术及应用方面的报道相对较少。发展抗病毒治疗性抗体研发的关键技术并对严重威胁国人健康的HCMV病毒开展人源抗体筛选、研制，契合国家战略规划，既是保障人民健康的迫切需求，也是发展生物高新技术的重大机遇。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，它通过对人源化抗体Fe区的定点突变和分子重构，增强其生物学功能，结合酵母表面展示技术，构建新型人源化抗体库;建立并改进EB病毒(EBV)感染IgG+记忆性B细胞使其永生化、从恢复期病人血细胞中筛选针对特定病毒的人源化单克隆抗体的技术平台；构建具有自主知识产权的针对HCMV的高效治疗性抗体，该抗体可以高效特异的在体外及细胞内针对HCMV的抗体进行筛选。
[0007]
本发明采用了以下技术方案:一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，其特征是它包括对Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增强ADCC、CDC;噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建；通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率，所述的对Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增强ADCC、CDC为恒定区Fe区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，有效地清除靶细胞，所述的噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建过程为能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白S0C(9 ku)和H0C(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失，T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制，所述的通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率为采用EBV中国株感染B细胞，提高EBV永生化B细胞的效率。
[0008]本发明具有以下有益效果:采用了以上技术方案后，本发明是通过对人源化抗体Fe区的定点突变和分子重构，增强其生物学功能，结合酵母表面展示技术，构建新型人源化抗体库;建立并改进EB病毒(EBV)感染IgG+记忆性B细胞使其永生化、从恢复期病人血细胞中筛选针对特定病毒的人源化单克隆抗体的技术平台；构建具有自主知识产权的针对HCMV的高效治疗性抗体，本发明采用优化程序，建立一套具有普适性的、适合国情并具有自主知识产权的从恢复期病人血细胞中筛选针对HCMV的人源化单克隆抗体的技术体系。
【附图说明】
[0009]图1为本发明抗体结构示意图。
[0010]图2为本发明抗巨细胞病毒人源化抗体药物实验流程图。
[0011 ]图3为本发明单克隆抗体的生产的流程图。
【附图说明】
[0012]在图1中，本发明提供了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，它包括对Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增强ADCC、CDC;噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建;通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率，所述的对Fe的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCCXDC为恒定区Fe区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，有效地清除靶细胞，所述的噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建过程为能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白S0C(9 ku)和H0CC40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失，T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制，所述的通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率为采用EBV中国株感染B细胞，提高EBV永生化B细胞的效率。
[0013]本发明提供了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，并且详细介绍了这种人源化抗体药物的涉及制备方法及优点。该抗体可以高效特异的在体外及细胞内针对HCMV的抗体进行筛选。
[0014](一)人源化抗体Fe区改造技术
通过对Fe晶体及其与受体的共结晶的三维结构分析，预测与其功能相关的重要氨基酸位点，采用定点突变的方法改变Fe的关键氨基酸，或者对整个Fe功能域进行分子重构，从而达到加强其生物学功能和增加其稳定性的目的。增加其体内半衰期，延长抗体寿命。在基于改造优化的Fe的基础上，构建噬菌体展示人源抗体库和酵母表面展示人源抗体库。
[0015]
1、单链丝状噬菌体展示系统 (I)Pin展示系统。
[0016]丝状噬菌体是单链DNA病毒，Pm是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个?5个拷贝Pm蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽Gl和G2连接。其中，NI和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个Pm蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。Pm有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于Pm蛋白的信号肽(Sgm)和Ni之间时，该系统保留了完整的Pm蛋白，噬菌体仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接与Pm蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整Pm蛋白来提供。Pm蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。
[0017](2)ΡΥΠΙ及其他展示系统。
[0018]PVI是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒颗粒有2 700个左右PVI拷贝。PVI的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PVI蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。此外，尚有丝状噬菌体PVI展示