化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
[0043]有限稀释法克隆:克隆前I天制备饲养细胞层(同细胞融合)。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。调整细胞为3?10个细胞/ml。取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞ΙΟΟμΙ。孵育于37°C、5%C02孵箱中。在第7天换液，以后每2?3天换液I次。8?9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存。
[0044](5)杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存液:50%小牛血清;40%不完全培养液；10%DMS0(二甲基亚砜)。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0°C后放入_70°C超低温冰箱，次日转入液氮中。
[0045]细胞复苏方法:将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37°C水浴中，在Imin内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37°C、5%C02孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
[0046](6)单克隆抗体的大量生产
在图3中，体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
[0047]实体瘤法:对数生长期的杂交瘤细胞按I?3X 107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2?4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10?20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到I?10mg/ml。但采血量有限。
[0048]腹水的制备:常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，I?2周后腹腔注射I X 106个杂交瘤细胞，接种细胞7?10天后可产生腹水。
[0049]2、B淋巴细胞的永生化
(I)标本
肺癌患者阳性的肿瘤引流淋巴结(tumor draining lymph node，TDLN)，肺癌患者均未经过化疗和放疗，每次手术从肺癌患者体内切下一至数个新鲜、肿胀的TDLN，同时切下一至数块肿瘤组织，立即投入已消毒的离心管中，并迅速运至实验室处理。肿瘤组织经剪碎、研磨、消化等处理，再固定在96孔培养板上，肿瘤细胞表面相关抗原作为下一步筛选特异性人型单链抗体之用。
[0050](2)制成单核淋巴细胞悬液
将TDLN剪碎，去除结缔组织。在100目金属网上研磨，用Hank’s液洗涤I次(1000r/min，1min)，再用RPMI 1640(含10% FBS)稀释成1:1的细胞悬液。按I份该细胞悬液、I份淋巴细胞分离液(Ficoll)混匀，2000r/min离心20min，吸取中间白膜层，再将白膜层用RPMI 1640培养液洗涤3次，每次1000r/min离心20min，吸取中间白膜层，再将白膜层用RPMI 1640培液洗涤3次，每次1000r/min离心lOmin，沉淀后与RPMI 1640混匀后计数，使单核细胞终浓度为
2X 106/ml ο[0051 ] (3)制成B淋巴细胞悬液
取5ml绵羊红细胞(31^0，？83洗涤5次，每次180(^/1^11离心51^11，再加入4倍体积？!19.0的AET后，37 °C水浴15min，再洗涤5次，离心条件同上，配成10%AET_SRBC。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培液将10%AETSRBC稀释至1%AET-SRBC。将上述单核细胞悬液与等量的1%AET-SRBC 混合，37°(^水浴15111；[11(每5111；[11摇勾一次)后，10001'/111；[11离心5111；[11，4°(^放置45111；[11后，用RPMI 1640培液稀释至I: I悬液。再按I份悬液、I份Hank’s液、I份淋巴细胞分离液混合，2000r/min离心20min，吸取中间白色B淋巴细胞层。再用RPMI 1640洗涤I次，1000r/min离心lOmin。最后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培液重悬B淋巴细胞，使B淋巴细胞终浓度为I X 106/ml ο 37 0C C02培养箱中培养，每天观察细胞生长情况和细胞形态，并以COUNTER血细胞计数仪进行细胞计数。
[0052](4)饲养层细胞制备
转化试验前一天，用Ficoll淋巴细胞分离液分别分离人单核细胞、新生儿脐带血单核细胞及骨髓基质细胞(2000r/min离心20min)，经60Co γ射线照射30min，按I: I: I的比例混合后加入96孔板内(每孔浓度为I X 105)，37°C过夜备用。
[0053](5)EB病毒感染及B细胞永生化
取B95-8株EB病毒培养液上清液和上述B细胞悬液按1:100、1:10、1:1的比例混匀，再加入已铺有饲养层细胞的96孔培养板中，在37°C的C02培养箱中培养数天，显微镜下观察B细胞生长状况。筛选细胞生长状态良好者，进一步在C02培养箱中培养数天，显微镜下观察B细胞生长状况。筛选细胞生长状态良好者，进一步培养繁殖。
[0054](三)针对HCMV的治疗性抗体的筛选和细胞水平抗病毒效应评价
利用基于优化的Fe骨架的噬菌体表面展示和酵母表面展示抗体库，或者利用EBV转染B细胞永生化技术，针对HCMV糖蛋白gL和糖蛋白gH，筛选高效抗HCMV的人源化单克隆抗体。
[0055]人型抗体的检测:利用免疫比浊原理，按照免疫球蛋白测定试剂盒说明书操作。以O S K -1单克隆细胞上清液(含人型I g G)为阳性对照，以R P MI 16 4 O培液为阴性对照，用BECKMAN DU-7000紫外分光度度仪(λ=340ηπι)读取96孔上清液的吸光度(A值)，判断是否分泌人IgG。
【主权项】
1.一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，其特征是它包括对Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增强ADCC、CDC;噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建;通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率，所述的对Fe的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、⑶C为恒定区Fe区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，有效地清除靶细胞，所述的噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建过程为能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白S0C(9 ku)和H0C(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失，T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制，所述的通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率为采用EBV中国株感染B细胞，提高EBV永生化B细胞的效率。
【专利摘要】本发明公开了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，它包括对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC；噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建；通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率。本发明通过对人源化抗体Fc区的定点突变和分子重构，增强其生物学功能，结合酵母表面展示技术，构建新型人源化抗体库；建立并改进EB病毒（EBV）感染IgG+记忆性B细胞使其永生化、从恢复期病人血细胞中筛选针对特定病毒的人源化单克隆抗体的技术平台；构建具有自主知识产权的针对HCMV的高效治疗性抗体，该抗体可以高效特异的在体外及细胞内针对HCMV的抗体进行筛选。
【IPC分类】C07K16/08, A61P31/22, A61K39/42
【公开号】CN105664157
【申请号】CN201610135918
【发明人】刘奋勇, 王宇
【申请人】江苏亲合力病毒检测工程有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月11日