治疗细胞内感染的方法
【专利说明】
[00011 本申请要求享有分别于2013年06月25日、2014年03月24日和2014年05月26日提交 的澳大利亚专利申请第2013902327、2014901029和2014901977号的优先权。各个申请的公 开内容以引用的方式包含于本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种治疗细胞内感染的方法。所述方法包括给药细胞凋亡抑制剂 (IAP)诘抗剂。
【背景技术】
[0003] 由病原体，如乙型肝炎病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头状瘤病毒 (Human papilloma virus，HPV)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、组织胞衆 菌属(Histoplasma spp.)和疱原虫属(Plasmodium spp.)造成的慢性暴发性感染与病原体 特异性免疫的缺乏和会导致相关宿主细胞损坏的有害的异常非特异性炎症反应有关。虽然 多年来已研发出各种治疗策略，却收效甚微。
[0004] 乙型肝炎是全世界分布的常见疾病，估计有280，000,000名HBV携带者。全球来看， 在东南亚、非洲和部分南美洲的发展中国家中，HBV感染是最为常见的，在那里，对低龄婴幼 儿的垂直传播导致很大比例的感染者转变为HBV慢性携带者。婴幼儿时获得HBV的男性死于 慢性HBV感染导致的肝硬化或原发性肝癌的几率大约为40%。相比之下，出生时感染的女性 死于慢性乙肝感染导致的类似疾病的几率大约为15%。
[0005] 尽管若干药物现已处于临床应用状态，包括干扰素 a2b(IFNa2b)、干扰素 a2a、拉米 夫定（Iamivudine)、阿德福韦(adefovir)和恩替卡韦（entecavir)，但慢性乙肝感染仍旧难 以治疗。治疗在最开始时不起作用或会在出现耐药病毒时变得不起作用。而且已知现有的 药物疗法面临疗程长、花销大以及与不需要的副作用相关。例如，尽管在治疗HBV感染方面 使用拉米夫定取得了某些成功，但其也与耐药性风险的增长有关，所述耐药性会在第二年 的治疗之后高达45-55 %。此外，凭借这些疗法不能将HBV从肝脏中完全清除，因此甚至在中 断治疗后，在许多病例中发生了HBV感染的复发。当慢性HBV感染的患者发生晚期肝衰竭时， 肝移植就成为唯一可选的治疗形式。然而，由于HBV感染持续存在，移植物可能会受到感染， 因而限制了患者和移植物的存活率。
[0006] 人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征(HIV/AIDS)也象征着全球性的健康危 机，特别是在发展中国家。抗逆转录病毒药物的使用显著改变了 HIV感染者的生命预期和质 量。然而，尽管介入了此抗逆转录病毒药物，持续激活免疫，也仅部分恢复了 CD4T细胞和B细 胞衰退和失去的免疫功能。患者还会处于非AIDS定义的疾病和死亡因素，例如，癌症、心血 管疾病、肝和肾衰竭、中枢神经系统紊乱(例如，弓形虫脑炎)和持续感染的风险下。
[0007] 本发明涉及治疗细胞内感染的新方法的开发。
【发明内容】
[0008] 因此，在第一方面，本发明提供了一种治疗受治者的细胞内感染的方法，所述方法 包括给药受治者IAP诘抗剂。
【附图说明】
[0009] 图1显示了8周时间内受感染小鼠的血清中血清HBV DNA水平的时间过程（上幅 图）。下幅图显示了血清中病毒粒子(左)和亚病毒颗粒(右）的EM显微照片。
[001 0]图2显示了40周时间内受感染小鼠的血清中的血清HBV DNA水平的时间过程。尽管 表面上控制住了病毒血症，但甚至在感染后24周，受感染小鼠在HBV病毒的复制上显示出了 复发，其在血清HBV DNA水平上具有短暂的尖峰。
[0011 ] 图3显示了用Birinapant或载体对照（DMSO)处理的小鼠的HBV DNA的血清水平。
[0012] 图4显示了比较Birinapant与载体对照处理的（C57BL/6)HBV受感染小鼠的时间- 事件（time to event)(HBV清除）图。
[0013] 图5显示了ClAPl缺乏(肝特异性缺乏)并且所有器官完全CIAP2缺乏的小鼠，可将 HBV感染清除至与用Birinapant治疗的野生型小鼠类似的程度。虚线、红色实线和蓝色实线 分别代表了随时间过去清除感染的野生型小鼠、肝脏特异性cIAPl缺乏加全身cIAP2缺乏的 小鼠和XIAP缺乏(全身）的小鼠的数目（％ )。
[0014] 图6用Birinapant抑制PBMC中HIV-I JR-CSF的复制。
[0015] 图7用Birinapant+10ng/ml TNF-α抑制PBMC中HIV-I JR-CSF的复制。
[0016]图8.使PHA活化的PBMC(分离自两位健康的捐赠者）未受到或受到HIV NL4.3(GFP + )感染，之后用指定浓度的Birinapant或载体对照（NT)处理6小时或24小时。另外，用 Birinapant或载体对照来处理未感染的原始PBMC。流式细胞仪(FACS)分析了相对于处理之 前存活的受感染细胞，24小时Birinapant处理之后存活的（活性半胱天冬酶3(Caspas e 3) 阴性)a)HIV感染的(GFP+)培养的CD4+淋巴细胞的比例；相对于未处理的细胞，6小时或24小 时Birinapant处理之后存活的b)原始培养的或c)PHA活化的、未感染的⑶4+淋巴细胞的比 例。
[0017] 图9相比于DMSO对照（η= 15)，用Birinapant处理的结核分支杆菌受感染小鼠 （η = 17，腹膜内注射给药，30yg/g每周一次X 3次）中，结核分支杆菌的载菌量(CFU/肺，Log1Q)，显 示出显著的降低，为0.331^1(^1]/肺(？ = 0.012)。
[0018]图10诘抗性的TNF-α细胞因子抵消了 birinipant的效力。
[0019] 图11用与birinipant不同的SMAC模拟物进行实验的结果。
[0020] 图12给药birinipant(正方形）或载体对照（圆形）的受感染小鼠的肺中的嗜肺军 团菌（Legionella pneumophila)的载菌量（CFU/ml)。每个点代表一个动物，误差棒代表 SEM〇*P〈0.05〇
[0021] 图13显示了用恩替卡韦、birinipant与恩替卡韦的结合处理HBV受感染小鼠的结 果。林*ρ〈0·001、林p〈0.01、ns =不显著。
[0022] 图14显示了利用具有TRAIL、birinipant和TRAIL与birinipant的结合的腺病毒传 输系统处理体外感染HBV的原代人肝细胞的结果。
【具体实施方式】
[0023] 在本说明书中，除非上下文有另外的规定，否则应当将词语"包括"或其形态变化 (如"包含"或"含有"）理解为包含确定的要素或整体或者要素或整体的组，但并不排除任何 另外的要素或整体或者要素或整体的组。
[0024] 本说明书中提及的任何在先专利公开(或从其中获得的资料)或任何已知的材料， 不被且不应当被看作是对在先专利公开(或从其中获得的资料)或已知的材料构成了涉及 本说明书尝试的领域的普遍公知的部分的承认或认可或任何形式的意见。
[0025] 本说明书中提及的所有专利公开均以引用的方式并入本文中。
[0026] 应当注意的是，如本说明书中所使用的，单数形式的"一(a)"、"一(an)"和"所述 (the)"包括复数方面，除非上下文明确地规定了例外的情况。因此，例如，提及的"试剂(an agent)"包括单一的试剂，也包括两种以上的试剂;提及的"分子(a molecular)"包括单一 的分子，也包括两种以上的分子;如此等等。
[0027] 根除病原体的机理是使受感染细胞激活程序性细胞死亡过程。这样杀死了病原体 和受感染细胞，并防止了微生物的蔓延。然而，许多病原体发展出了对策来防止它们的宿主 细胞自杀。宿主细胞中的一组分子，被称作细胞凋亡蛋白抑制剂（IAPs)，在调节细胞死亡程 序和在控制炎症方面具有若干作用。
[0028]在某种程度上，本发明基于以下发现:通过体内拮抗IAPs，增强了对持续感染的宿 主细胞的肃清和对病原体的消除，而不会导致对宿主的明显危害性的间接损害。这可通过 使用pan-I AP拮抗剂(其可以是pan-c IAP拮抗剂，例如，c IAP1和/或c IAP2拮抗剂)来实现。
[0029] 因此，第一方面，本发明提供了一种治疗受治者的细胞内感染的方法，所述方法包 括给药受治者IAP诘抗剂。
[0030] 这里所使用的术语"治疗"的意思是减小了受治疗的生物(例如，人类患者）的造成 细胞内感染的病原体的水平或数量。
[0031] IAP的蛋白质家族包括:XIAP(BIRC4)、cIAPl(BIRC2)、cIAP2
[0032] (81此3);嫩1卩（811?(：1)、存活素（51^￥1￥111)(811^5)、厶？〇11〇11(8^1。6 ;811^6)、]^-IAP(BIRC7;Livin，KIAP)和ILP2(BIRC8)。家族成员之间存在着一定程度的重复，但XIAP+ cIAPl+cIAP2的标靶化合物缺失导致了小鼠早期胚胎的致死性。这些分子加重了炎症并终 止细胞发出死亡信号1。本发明的发明人第一次证实了 IAPs在维持宿主的持续细胞内感染 方面起到重要作用。
[0033] 在一个实施方式中，所述IAP为cIAPl或cIAP2,或二者。
[0034] cIAPl由GenBank DQ068066.1所示的序列来编码。cIAPl的转录变体包括NCBI参考 序列 ΝΜ_001166·4、ΝΜ_001256163·1 和ΝΜ_001256166·1。
[0035] cIAP2由GenBank BC037420.1所示的序列来编码。cIAP2的转录变体包括NCBI参考 序列 ΝΜ_001165 · 4 和ΝΜ_182962 · 2。
[0036] ΧΙΑΡ(Χ连锁凋亡抑制剂）由GenBank NCBI参考序列NG_007264.1来编码。XIAP的转 录变体包括 NCBI参考序列 NM_001167.3、NM_001204401.1 和NR_037916.1。
[0037] 适宜的IAP拮抗剂应当是本领域的技术人员已知的。其实例包括单价的IAP拮抗剂 GDC-0145、⑶ C-0152 和⑶ C-0917(美国 Genentech 公司），AT-IAP(英国 Astex 公司）和 AT-406 (美国Ascenta公司），以及二价的IAP诘抗剂AEG40826(美国Aegera Therapeutics公司）、 SM-1200(密歇根大学）、HGS1029(美国人类基因组科学公司（Human Genome Sciences))、 BV6(美国Genentech公司）、AEG40730(Aegera Therapeutics公司）；SM_164(密歇根大学）； CS3(Genentech公司）；MLlO 1 (桑福德-伯纳姆（Sanford-Burnham)医学研究所）；AEG35156 (Aegera Therapeutics公司）和birinapant/TL32711 (美国TetraLogic公司）。这些IAP诘抗 剂中的几个在Fulda和Vucic(Nature Reviews Drug Discovery，2012，volll, 109-124)以 及Fulda(Leukemia, 2012, vol26,1155-1165)中进行了进一步讨论，这两篇文献的内容以引 用的方式并入本文中。尽管目前认为单价和二价IAP拮抗剂均能被用于本发明中，但现在优 选所述IAP拮抗剂是二价的。
[0038]在一个实施方式中，所述IAP拮抗剂为第二线粒体源半胱天冬酶活化因子(Smac) 的模拟物。Smac是为IAPs的内源抑制剂的促凋亡线粒体蛋白。Smac模拟物已被证实激发了 程序性细胞死亡，因而在开发新的癌症疗法中成为了焦点 2,3。
[0039] Smac通过与IAPs的直接相互作用而诘抗了IAP介导的半胱天冬酶抑制，和/或引发 了IAP家族(cIAPl和cIAP2)的某些成员的蛋白酶体降解。Smac同时促进半胱天冬酶-3酶原 (pro-caspase-3)的蛋白水解活化作用和成熟的半胱天冬酶-3的酶活性的能力依赖于其与 IAP特异性相互作用的能力。Smac结合至XIAP的BIR1/BIR2连接子区域和BIR3，干扰了半胱 天冬酶-3和-7以及半胱天冬酶-9的抑制，因而促进了细胞凋亡或程序性细胞死亡。Smac和 Smac模拟物还引发了 cIAPl和cIAP2的蛋白酶体降解，导致了经典NF-kB激活的抑制。许多病 毒调节NF-κΒ激活以促进疾病的发病(参考文献:Rahman and McFadden,Nat Rev Microbio 20119:291-306；Hiscott et al Oncogene 2006 30:6844-67；Shukla et al Carcinogenesis 201132:978-985)。不受限于对构成本发明基础的机理的具体理解，这些 活性暗示了 Smac模拟物可被用于治疗这些感染的机理。
[0040] 通过阐明Smac与IAPs之间的相互作用的晶体结构，使得Smac模拟物的发现成为可 能。Smac模拟物似乎通过多重机理促进了肿瘤细胞中的凋亡性细胞死亡，所述机理包括:直 接结合并诘抗IAPs、通过促进cIAPs的自动泛素化(autoubiquitylation)和蛋白酶体降解 而消除IAPs以及通过TNF激发而激活细胞外凋亡途径。TNF是控制许多感染所需的关键细胞 因子，并且当TNF被拮抗时，为了治疗自身免疫紊乱，许多潜在的感染被再次激活（参见 http://cmr.asm.Org/content/22/2/274.full#sec_49)。作为推论，在这些感染中提高TNF 的活性可促进它们的肃清。
[0041] Smac肽模拟物的实例，包括某些上文所指出的，被非限制性地公开在下列文献中： US 7,517,906、US 7,419,975、US 7,589，118、US 7,932,382、US 7,345,081、US 7,244， 851、US 7,674,787、US 7,772，177、US 7,989,441、US20100324083、US20100056467、 1^20090069294、1^20110065726、1]520110206690和102011098904，所有这些文献以引用的 方式并入本文中，如同做出了充分的阐述一样。在这些文献中公开的化合物，以及常规Smac 模拟物，具有如下结构：
[0042] [P1-P2-P3-P4](式I)
[0043] 或者
[0044] [P1-P2-P3-P4]-L-[P1，-P2，-P3，-P4，](式II)
[0045] 其中，P1-P2-P3-和ΡΓ-Ρ2'-Ρ3'_对应于成熟Smac的N端丙氨酸(Ala)-缬氨酸 (Val)-脯氨酸(Pro)-三肽的肽置换物（即肽模拟物），以及Ρ4和Ρ4'对应于第四N端氨基酸苯 丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、异亮氨酸（lie)或缬氨酸(Val)的氨基酸置换物，以及L为共价 连接[PI-P2-P3-P4 ]与[PΓ -P2 ' -P3 ' -P4 ' ]的连接基团或连接键。
[0046] 例如，非限制性的，Smac模拟物可存在于以下类型的式II的化合物中：
[0047] Pl 和PrSNHR1-CHR2-C(O)-;
[0048] P2 和 P2,为-NH-CHR3-C(O)-;
[0049] P3和P3'为四氢吡咯、稠合环烷基的四氢吡咯或稠合具有N杂原子的杂环烷基的四 氢吡咯，它们在各个情况下可任选被取代，并且其中P3/P3 '的四氢吡咯通过酰胺键与P2/ P2'相结合；
[0050] P4 和 P4,为-M-Qp-R7。
[0051] 可变的取代基可以是，例如，
[0052] 妒：-!1或-〇13;
[0053] R2:-CH3、-CH2CH3或-CH20H;
[0054] R3:C2-6烷基、C2-6烷氧基、C3-C6环烷基或杂环烷基、或C6-C8芳基或杂芳基，它们 在各个情况下可任选被取代；
[0055] M:共价键、C1-6亚烷基、取代的C1-C6亚烷基(例如但不限于-C(O)-);
[0056] Q:共价键、Cl -6亚烷基、取代的Cl -C6亚烷基、-0-或-NR8-;
[0057] 卩：〇或1;
[0058] R7:环烷基、环烷基芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、芳基或杂芳基，它们在各个情况 下可任选被取代；
[0059] r8:_hsc1_6 烷基。
[0060] L为共价连接[P1-P2-P3-P4]与[?1'-?2'-?3'-?4']的连接基团或连接键。
[0061] "烷基"（一价)和"亚烷基"（二价)在单独或作为另一术语(例如，烷氧基)的一部分 时，意思是指支链或非支链的饱和脂肪烃基，且除非另有说明，否则其含有至多12个碳原 子。具体的烷基的实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、 叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2_二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、2,2_二甲基丁基、正庚 基、3-庚基、2-甲基己基等。术语"低级的"，用于修饰烷基、烯基等时，意思是指1至4个碳原 子、支链或直链的，从而，例如，术语"低级烷基"、"C 1-C4烷基"和"1至4个碳原子的烷基"的意 思相同，且可互换使用以表示甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、仲丁基或叔丁基。亚烷基 的实例包括但不限于:亚甲基、亚乙基、正亚丙基、正亚丁基和2-甲基-亚丁基。
[0062] 术语取代烷基指的是具有取代了烃骨架的一个或多个(通常不超过四个)碳原子 上的一个或多个氢的取代基的烷基部分。这些取代基相互独立地选自：卤素(例如，I、