用于治疗病毒感染的dsRNA的制作方法

专利名称:用于治疗病毒感染的dsRNA的制作方法
用于治疗病毒感染的dsRNA[0001]本申请是中国专利申请200880023497.1的分案申请，原申请的申请日是2008年7月4日，发明名称是“用于治疗病毒感染的dsRNA”。发明领域[0002]本发明涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶的双链核糖核酸(dsRNA)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB ；ΝΜ_002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶α多肽(PIK4CA ;ΝΜ_002650)的双链核糖核酸，并涉及其在治疗由正链RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)感染介导的病理过程中的用途。发明背景[0003]RNA依赖的RNA聚合酶正链RNA病毒形成了由许多不同亚家族组成的大的病毒超家族。这些病毒涵盖植物界和动物界两界，引起的病理学范围从轻微的表型到严重的衰弱疾病。正链RNA病毒聚合酶超群的构成如下。1.小RNA病毒组(HAV、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒)、诺达病毒(nodaviruses)、紅豆花叶病毒属(comoviruses)、线虫传多面体病毒组(nepoviruses)、马铃薯Y病毒组(potyviruses)、大麦花叶病毒组(bymoviruses)、南方菜豆花叶病毒组(sobemoviruses)和黄症病毒组(Luteoviruses)(黄化病毒、黄矮病毒和卷叶病毒)。I1.香石竹斑驳病毒组(Carmoviruses)、番爺丛矮病毒组(tombusviruses)、香石竹环斑病毒组(dianthoviruses)、痕病毒属(pestiviruses)、披膜病毒(togaviruses)、伊科病毒(echoviruses)、登革病毒、丙型肝炎病毒、黄病毒属(flaviviruses)。II1.烟草花叶病毒组(Tobamoviruses)、烟草脆裂病毒组(tobraviruses)、大麦病毒组(hordeiviruses)、tricornaviruses> 甲病毒、风疫病毒属(rubiviruses)、真菌传杆状病毒组(furoviruses)、戍型肝炎病毒、马铃薯X病毒组(potexviruses)、香石竹潜病毒组(carlaviruses)、芜菁黄花叶病毒组(tymoviruses)和苹果褪绿叶斑病毒。正链RNA病毒的基因组编码RNA依赖的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶是唯一含有这类病毒中保守基序的病毒蛋白。由于这类病毒含有显著的系统发育变异性，所以该保守性是意义重大的，人们预计存在病毒感染细胞和维持稳定复制的多种方式。除许多不同之外，该类中的所有病毒都依赖RNA依赖的正链RNA转录这一单个基本步骤。由于该步骤对病毒生活周期是必需的，所以病毒使用许多宿主蛋白质来启动和维持RNA依赖的RNA聚合酶活性。不与宿主因子相互作用，则病毒不能存活。因此，可用于抑制病毒感染的治疗介入将是阻断病毒宿主的相互作用。如果宿主因子对病毒是必需的，但对宿主不是必需的，那么可操纵这些宿主因子，便可实现阻断病毒感染的能力。已经证实，靶向宿主蛋白质是干扰HIV、HCV、天花病毒等病毒感染和复制的有效方法。[0004]正链RNA病毒的重要性是对人类健康和生存力的影响。几种正链RNA病毒感染人类，并在许多情况下导致使人虚弱的疾病和/或病态。几种对人类健康造成特别的负担的病毒是登革病毒(出血热)、HCV (慢性肝病、肝功能衰竭、纤维样变性和癌)和HEV (暴发性肝功能衰竭)。由这 些病毒引起的肝脏和血液疾病导致全世界数以百万的死亡，并且花费医疗工业数十亿美元用于肝脏相关的疾病。找到控制病毒感染的治疗方法的意义重大，并且可改善全世界人类健康。[0005]因此，存在有效治疗由HCV和其它正链RNA病毒(以上所列)引起的感染这一未满足的需求。[0006]该说明书也涉及双链RNA分子(dsRNA)。已经表明，dsRNA以已知为RNA干扰(RNAi)的高度保守性调节机制来阻断基因的表达。W099/32619 (Fire等人)公开了至少长25个核苷酸的dsRNA在秀丽线虫(C.elegans)中抑制基因表达的用途。也已经表明，dsRNA在其它生物体包括植物(参见例如W099/53050, Waterhouse等人；和W099/61631, Heifetz等人)、果蝇(参见例如Yang, D等人，Curr.Biol.(2000) 10:1191-1200)和哺乳动物(参见W000/44895, Limmer ;和 DE10100586.5, Kreutzer 等人)中降解祀 RNA。现在，这种天然机制已经成为研发治疗由于基因异常或不想要的调节引起的病症的新型药剂的焦点。[0007]PCT 公开号 W02003016572、W02003070750 和 W02005028650 中公开了先前研发治疗由HCV感染引发的疾病的、基于核酸的RNAi药物的努力。PCT公开号W02006074346中公开了使用RNAi药物治疗RSV感染的先前的努力。[0008]尽管在RNAi领域有显著进步，并且在治疗由病毒感染介导的病理过程中有进展，但仍然需要能够抑制病毒感染进程、并且能够治疗与病毒感染相关的疾病的药剂。本发明公开了满足这种需要的化合物、组合物和方法，并提供了其它益处。[0009]发明概述[0010]本发明提供了用于治疗正链RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰质炎病毒)感染的组合物和方法，所述组合物和方法通过降低细胞中(其中这类病毒可复制，如肝脏)人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的活性的水平。[0011]本文公开了正链RNA病毒的增殖可通过使用双链核糖核酸(dsRNA)来抑制，从而沉默对病毒增殖必需的人宿主细胞基因PIK4CB和/或PIK4CA的表达。[0012]本发明提供了多种实施方案，尤其包括:[0013]用于抑制细胞中磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)水平表达或活性的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，且其中有义链包含第一序列和反义链包含第二序列，所述第二序 列包含基本互补于编码PI4K的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述互补区域长度低于30个核苷酸和其中所述dsRNA与表达所述PI4K基因的细胞接触后，抑制所述PI4K基因表达。这些dsRNA可具有化学修饰，且可与其它部分缀合。此夕卜，这些dsRNA可提供于药物组合物中。[0014]一个实施方案方法是用于抑制细胞中磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)基因或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)基因的方法，所述方法包括下列步骤:[0015](a)向细胞中引入双链核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少两个彼此互补的序列，且其中有义链包含第一序列和反义链包含第二序列，所述第二序列包含基本互补于编码PIK4CB或PIK4CA的至少部分mRNA的互补区域，并且其中所述互补区域长度低于30个核苷酸；和[0016](b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够时间以获得PIK4CB基因(或PIK4CA，根据选择)的mRNA转录物的降解，从而抑制PIK4CB基因(或PIK4CA，根据选择)在细胞中的表达或活性。[0017]备选地，本发明涉及治疗由正链RNA病毒感染介导的病理学过程的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用本发明的dsRNA。正链RNA病毒可选自丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)和登革病毒。[0018]备选的实施方案包括用于抑制PIK4CB或PIK4CA在细胞中表达的载体；和包含这类载体的细胞。[0019]一个备选的实施方案包括治疗HCV感染的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者施用治疗有效量的包含本发明dsRNA的药物组合物。[0020]附图简述[0021]
图1.HCV构建体的结构。A.完整的HCV基因组。B.亚基因组HCV复制子，用于克隆A (亚基因组复制子)细胞。将结构蛋白用5’UTR下游的新霉素抗性基因和萤火虫萤光素酶报告基因替代。C.移除了 HCV蛋白质的报告构建体用于克隆Ar细胞(缺少亚基因组复制子的细胞)。[0022]图2.命中目标的SiRNA的表型确认。重新分析来自大规模激酶组siRNA筛选的命中目标的siRNA。A.测试dsRNA为分别的双链体PIK4CA1-PIK4CA4 (柱1-4)、为PIK4CASmart Pool (柱 5)、为分别的双链体 PIK4CB1_PIK4CB4(柱 6-9)或为 PIK4CB Smart Pool(柱10)的结果。结果相对于GAPDH (对照；柱11)来测量。使用每孔25nM的dsRNA、用克隆A细胞进行测定；Bright-Glo活性在转染后72小时进行测量。靶向GAPDH的dsRNA (柱11)用作阴性对照，且靶向PGL2的dsRNA (柱12)是阳性对照。[0023]图3.PIK4CA和PIK4CB的RTPCR。使用siRNA转染Huh7复制子细胞72小时，分离mRNA并用Taqman进行RTPCR分析。结果归一化为GAPDH转染的细胞。A.PIK4CA siRNA的转染，使用 PIK4CA 引物的 Taqman RTPCR0 B.PIK4CA siRNA 的转染，使用 PIK4CB 引物的 TaqmanRTPCR0 C.PIK4CB siRNA 的转染，使用 PIK4CB 引物的 Taqman RTPCR0 D.PIK4CB siRNA 的转染，使用 PIK4CA 引物的 Taqman RTPCR0 GOI=目的基因。PIK4CAsp=PIK4CA Smart Pool ；PIK4CBsp=PIK4CB Smart Pool。[0024]图4.A)由所示的靶向PIK4CA siRNA (25nM)处理后的PIK4CA (浅条)或PIK4CB(黑条)的mRNA表达。B)通过所示的靶向PIK4CB siRNA (25nM)处理后的PIK4CA (浅条)或PIK4CB (黑条)的mRNA表 达。[0025]图5.蛋白质印迹结果显示PI4KA siRNA(行1-行3分别对应于表2中的PI4KA1 ；PIK4A2 和 PIK4A3)或 PI4KB siRNA (行 4-行 6 分别对应于表 I 中的 PI4KB1 ；PIK4B2 和PIK4B3)处理后PI4KB、NS3或肌动蛋白(如所标示)的蛋白质表达水平。GAPDH siRNA处理显示为对照。[0026]图6.靶向PIK4CA和PIK4CB的shRNA序列。A)使用所示的shRNA构建体处理克隆A细胞的结果。浅条表示萤光素酶活性；黑条表示细胞生存力。所有结果都与对照GAPDH处理的细胞比较；B)使用所示的shRNA处理对PI4KA表达的影响(GFP归一化的);C)使用所示的shRNA处理对PI4KB表达的影响(GFP归一化的);D)蛋白质印迹结果显示经靶向PI4KA的shRNA (行1-行5分别对应shAl-shA5)或靶向PI4KB的shRNA (行6-行10分别对应shBl-shB5)处理后PI4KB、NS3或肌动蛋白(如所标示)的蛋白质表达水平。GFP shRNA处理显示为对照，所有结果获取于经所示shRNA处理后96小时；E)蛋白质印迹测量shA2和shBl对蛋白质表达的影响，shRNA转导后3周(GFP对照)。[0027]图7.HCV复制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA处理时，HCV复制的剂量依赖。细胞在HCV感染前用针对PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA处理。A) 25nM (灰条；);1.5nM (白条);0.1nM (黑条)。结果归一化为GAPDH siRNA处理时的HCV复制。海肾(Renilla) siRNA是阳性对照。B)在感染细胞中靶mRNA的表达。[0028]图8.HCV复制的抑制(活病毒)。用所示的siRNA处理时，HCV复制的剂量依赖。细胞在HCV感染后用针对PIK4CA或PIK4CB的所示siRNA处理。A)用所示的siRNA (25nM)处理后24小时对病毒复制的影响。黑条一病毒萤光素酶(活性);浅条一细胞生存力。结果归一化为GAPDH siRNA处理时的HCV复制。海肾siRNA是阳性对照。B)用所示的siRNA处理后HCV复制的时间依赖。黑(第一)条一24小时；浅(第二)条一48小时；白(第二)条一72小时;灰(第四)条一96小时。[0029]发明详述[0030]本发明提供了治疗与受正链RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰质炎病毒)感染相关的疾病这一问题的解决方案，所述解决方案通过降低这类病毒可复制的细胞中人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的水平。本文公开了可通过使用双链核糖核酸(dsRNA)沉默人宿主细胞基因PIK4CB和/或PIK4CA的表达来抑制正链RNA病毒的增殖，其中所述人宿主细胞基因PIK4CB和/或PIK4CA对正链RNA病毒的增殖是必需的。[0031]此外，本文首次公开了对这些dsRNA的所选化学修饰是高度优选的实施方案，所述实施方案提供了惊人的降低的毒性、降低的免疫原性、改善的药学特性和其它益处。[0032]本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)、以及在细胞或哺乳动物中使用所述dsRNA抑制正链RNA病毒繁殖的组合物、药物组合物和方法。本发明也提供了用于在哺乳动物中使用dsRNA治疗由正链RNA病毒感染所引起的病理学病症和疾病的组合物和方法。[0033]本发明的 dsRNA包含具有这样的区域的RNA链(反义链)，所述区域长度低于30个核苷酸、通常长19-24个核苷酸、并且基本互补于人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β亚基多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的至少部分的基因产物(前mRNA或成熟mRNA)转录物。这些dsRNA的使用使得参与哺乳动物中正链RNA感染的复制和/或维持的基因的mRNA靶向降解或失活。使用基于细胞的测试法和动物测试法，本发明人证实，非常低剂量的这些dsRNA就可以特异并且有效地介导RNAi，导致复制和感染的显著抑制。因此，包含这些dsRNA的本发明方法和组合物能用于治疗由正链RNA病毒感染介导的病理过程。[0034]人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β亚基多肽(PIK4CB ；ΝΜ_002651 ;有时也称为ΡΙ4ΚΒ ；PIK4B ；pi4K92 ；ΡΙ4Κβ ；ΡΙ4Κ-β ；ΡΙ4ΚΙΙΙ β )，和人磷脂酰肌醇 4-激酶催化性 α 多肽(PIK4CA;NM_002650 ;有时也称为 PI4KA ；PIK4A ；pi4K230 ；FLJ16556 ;和 ΡΙ4Κ_α )是磷脂酰肌醇4-激酶。在文献中磷脂酰肌醇4-激酶备选地称为PI4K、PI4-激酶或PIK4。除非文中指出特定选择，本说明书可交换地使用这类术语。哺乳动物细胞中存在4种ΡΙ4Κ酶，所述ΡΙ4Κ酶分成两类。第一类是从酵母到人都保守的III型PI4Ks，包括PIK4CA和PIK4CB。酵母直向同源物Stt4p和Piklp分别都是具有无重叠功能的必需基因。II型PI4Ks(PI4K II α和ΡΙ4Κ II β )区别于III类酶，也具有作为非必需基因的酵母同源物LSB6。PIK4CB是已最佳表征的哺乳动物基因，所述PIK4CB定位于高尔基体、在与小GTP酶腺苷二磷酸-核糖基化因子(ARF)形成的复合体中发挥功能、并且认为能调节高尔基体到质膜的分泌。已经表明，II类α和β酶参与高尔基体/反面高尔基体运输。III类α同工型似乎在质膜和内质网而不是高尔基体中发挥作用。[0035]除了 PI4Ks的亚细胞定位之外，还有就是在各自区室中酶的独特功能。PIK4CB参与磷脂酰肌醇4磷酸(PtdIns4P)和磷脂酰肌醇4，5 二磷酸(Ptdlns4，5P2)库的产生，参与神经酰胺从内质网到高尔基体的调节性运输，所述调节性运输导致鞘磷脂的合成，并且通过维持允许AP-1结构体停靠的富含磷脂酰肌醇4磷酸(PI (4) P)结构域而参与高尔基体的结构完整性。PIK4CB的破坏造成高尔基复合体结构的改变，造成极化细胞的分泌缺陷，并抑制蛋白质转运到质膜。[0036]II类和III类ΡΙ4Κα和β酶产生憐脂酸肌醇4憐酸(PtdIns4_phosphate),所述磷脂酰肌醇4磷酸是几种调节性磷酸肌醇的前体。这些磷酸肌醇通过招募调节性蛋白质到有组织的信号复合体中来控制多种细胞信号和运输过程。磷脂酰肌醇4磷酸[PtdIns4P]产生自磷脂酰肌醇(Ptdlns)，第一步是磷脂酰肌醇4，5 二磷酸和磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸(PtdIns (3，4，5) P3)的形成。磷脂酰肌醇4，5 二磷酸是磷脂酶C (PLC)酶类主要的底物，所述磷脂酰肌醇4，5 二磷酸在磷脂酶C的作用下产生肌醇1，4，5-三磷酸[Ins(l，4，5)P3]和参与Ca2+信号传导的二酰甘油(DAG)。磷脂酰肌醇4，5 二磷酸也控制几种类型的离子通道和酶类如磷脂酶D (PLD)，并同连接膜至肌动蛋白细胞骨架蛋白3和5的蛋白质相互作用。通过I类磷脂酰肌醇3激酶的作用产生自磷脂酰肌醇4，5 二磷酸的磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸调节一系列的过程，例如调节细胞代谢和通过丝氨酸/苏氨酸激酶Akt调节抗凋亡途径，并且也调控酪氨酸激酶例如Btk和用于小GTP结合蛋白质的鸟嘌呤交换因子。这些传导信号的磷酸肌醇的产生依赖于其合成酶的活性和其前体供给这二者，因此，磷脂酰肌醇4激酶在细胞调节中发挥作用。[0037]认为依赖于人PIK4CB和PIK4CA来复制的正链RNA病毒包括:1.小RNA病毒组(HAV、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒)、诺达病毒、豇豆花叶病毒属、线虫传多面体病毒组、马铃薯Y病毒组、大麦花叶病毒组、南方菜豆花叶病毒组和黄症病毒组(黄化病毒、黄矮病毒和卷叶病毒)。I1.香石竹斑驳病毒组、番爺丛矮病毒组、香石竹环斑病毒组、痕病毒属、披膜病毒、伊科病毒、登 革病毒、丙型肝炎病毒、黄病毒属。II1.烟草花叶病毒组、烟草脆裂病毒组、大麦病毒组、tricornaviruses,甲病毒、风疹病毒属、真菌传杆状病毒组、戊型肝炎病毒、马铃薯X病毒组、香石竹潜病毒组、芜菁黄花叶病毒组和苹果褪绿叶斑病毒。[0038]下列详细描述公开了如何制备和使用dsRNA以及含有dsRNA的组合物来抑制正链RNA病毒的表达，以及治疗由正链RNA病毒感染引发的疾病和病症例如肝脏疾病、肝功能衰竭、纤维样变性、癌、肺疾病和它的并发症的组合物和方法(下文进一步描述)。本发明的药物组合物包含具有反义链的dsRNA和可药用载体，其中所述的反义链包含长度低于30个核苷酸、通常长19-24个核苷酸、并且基本互补于PIK4CB和/或PIK4CA的至少部分RNA转录物的互补区域。本发明的一个实施方案采用在药物制剂中组合的多于一种的任选地靶向PIK4CB RNA转录物和/或PIK4CA RNA转录物的不同区段的dsRNA。[0039]因此，本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA和可药用载体的药物组合物，提供了使用组合物来抑制PIK4CB和/或PIK4CA的表达的方法，和提供了使用药物组合物来治疗由正链RNA病毒感染引起的疾病的方法。[0040]定义[0041]为了方便，下文提供说明书、实施例和所附权利要求
中使用的一些术语和短语的含义。如果术语在本说明书其它部分的用法与其在本部分提供的定义之间存在明显差异，那么以本部分的定义为准。[0042]“ G ”、“ C ”、“ A ”和“ U ”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也指如下文进一步详述的经修饰的核苷酸、或者替代的置换部分。技术人员熟知，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以用其它部分进行置换而基本不会改变寡核苷酸的碱基配对特性，其中所述的寡核苷酸包含具有此种置换部分的核苷酸。例如，不作限制地，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成碱基对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在本发明的核苷酸序列中可以用含有例如肌苷的核苷酸替换。包含此类置换部分的序列为本发明的实施方案。[0043]如本文所用，“靶序列”指在PIK4CB的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。[0044]如本文所用，术语“包含序列的链”指的是包含一连串核苷酸的寡核苷酸，其中所述的一连串核苷酸通过使用标准核苷酸命名法指代的序列进行描述。[0045]如本文所用，并且除非另外说明，否则术语“互补的”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，其指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或者多核苷酸杂交、并形成双链体结构的能力，这一点为技术人员所理解。此类条件可以是例如严格条件，其中所述的严格条件可以包括:400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、lmM EDTA50°C或 70°C 12-16 小时，然后洗涤。也可以应用其它条件，例如在生物体内可能遇到的生理相关条件。技术人员能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定最适合两个序列互补性测试的条件设置。[0046]这包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在全长的第一和第二核苷酸序列上的碱基配对。在本文，此类序列可以称为彼此“完全互补的”。然而，在本文，当其中第一序列称为与第二序列“基本互补的”时，这两个序列可以完全互补，或者它们于与其最终应用最相关的条件下保留杂交能力的同时，可以在杂交后形成一个或 多个，但通常不多于4个、3个或2个错配碱基对。然而，在将两条寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链突出时，根据互补性的测定，此类突出并不视为错配。例如，包含一条长21个核苷酸的寡核苷酸和另一长23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，对于本发明的目的，仍可以称为“完全互补的”。[0047]如本文所用，“互补的”序列也可包括非Watson-Crick碱基对、和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或者完全由上述碱基对形成，只要所述序列实现其对杂交能力的上述需求。[0048]在本文，术语“互补的”、“完全互补的”和“基本互补的”可以用于dsRNA有义链和反义链之间、或者dsRNA反义链和靶序列之间的碱基配对，正如其在本文的用途所理解的。[0049]如本文所用，与信使RNA (mRNA)的“至少部分基本互补”的多核苷酸指的是与目的mRNA (例如PIK4CB的mRNA或PIK4CA的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果寡核苷酸序列与编码PIK4CB的mRNA的非间断部分基本互补，那么寡核苷酸至少与部分PIK4CB mRNA互补。同样地，如果寡核苷酸序列与编码PIK4CA的mRNA的非间断部分基本互补，那么寡核苷酸至少与部分PIK4CA mRNA互补。[0050]如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是具有包含两条反向平行、并且基本互补(如上文定义)的核酸链的双链体结构的核糖核酸分子复合体。形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者是分开的RNA分子。当为分开的RNA分子时，此类dsRNA在文献中通常称为siRNA( “短干扰RNA”)。当两条链是一个较大分子的部分、并因此通过形成双链体结构的一条链的3’末端和另一链的5’末端之间不间断的一连串核苷酸连接，连接的RNA链称为“发夹环”、“短发夹RNA”或“shRNA”。当两条链不是通过形成双链体结构的一条链的3’末端和另一链的5’末端之间不间断的一连串核苷酸而共价连接时，连接结构称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数目为减去了双链体结构中存在的任意突出的最短dsRNA链的核苷酸数目。除了双链体结构外，dsRNA可以包含一个或多个核苷酸突出。此外，如本说明书所用，“dsRNA”可以包括对核糖核苷酸、核苷间键合、末端基团、帽以及缀合部分的化学修饰，其中包括在多个核苷酸处的实质修饰、并且包括本文公开或本领域已知的所有类型的修饰。为了本说明书和权利要求
的目的，“dsRNA”包含任何在siRNA类型的分子中使用的此类修饰。[0051]如本文所用，“核苷酸突出”指的是当dsRNA —条链的3’末端延伸至超出另一条链的5’末端时从dsRNA的双 链体结构突出的未配对的核苷酸，或者反之亦然。“平的”或“平端”表示在dsRNA的所述末端没有不配对的核苷酸，即没有核苷酸突出。“平末端的”dsRNA为在其全长上均是双链的dsRNA，即在分子的两末端都没有核苷酸突出。应当清楚，在测定siRNA是否具有突出或者是否为平末端时，不考虑结合siRNA3’末端或5’末端连接的化学帽或者非核苷酸的化学部分。[0052]术语“反义链”指的是dsRNA的包括与靶序列基本互补的区域的链。该链也称为“指导”序列，并用于在功能RISC复合物中指导该复合物对正确的mRNA进行切割。如本文所用，术语“互补的区域”指的是反义链上与序列例如本文定义的靶序列基本互补的区域。当互补区域与靶序列不完全互补时，最耐受在末端区域的错配，并且如果存在的话，通常在末端区域或者例如在5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸内的区域中。由于“反义”的使用与RNA复合物有关，所以“反义”的使用不同于反义DNA化合物，其中所述的反义DNA化合物在核酸治疗的相关领域中是不同的。[0053]如本文所用，术语“有义链”指的是dsRNA的包括与反义链的区域基本互补的区域的链。该链也称为“反指导”序列，因为它含有与靶序列相同的核苷酸序列，且因此特异地与指导序列结合。[0054]如本领域技术人员理解地，当谈及dsRNA时,“向细胞中引入”表示促进细胞摄取或吸收。dsRNA的吸收或摄取可以通过自主扩散或主动的细胞过程、或者通过辅助性试剂或装置来进行。这个术语的含义不限于体外的细胞，当细胞为活的生物体的部分时，dsRNA也可以“引入细胞”。在该情况中，向细胞的引入包括向生物体的递送。例如，可以将dsRNA注射入组织部位或者全身施用来进行体内递送。在体外向细胞的引入包括本领域已知的方法例如电穿孔法和脂质转染法。[0055]在本文，只要术语“沉默”和“抑制表达”涉及PIK4CB或PIK4CA，那么其指的是在用靶向PIK4CB或PIK4CA的dsRNA处理的细胞中，至少部分抑制PIK4CB或PIK4CA的表达，这通过与正常(未处理)细胞比较，转录的或可得到的mRNA量的减少来显示。该测量法可通过比较处理细胞(其可从进行了处理使PIK4CB或PIK4CA的表达受到抑制的第一细胞或第一组细胞分离)中的mRNA水平来检测，并且其中所述的mRNA量减少为和与第一细胞或第一组细胞基本相同、但未进行如此治疗的第二细胞或第二组细胞(对照细胞)相比较的结果。抑制程度通常以下列方式表示:[0056]
权利要求
1.用于在细胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶表达的双链核糖核酸，所述双链核糖核酸的缩写是dsRNA，其中第一链和第二链的序列是PIK4CB1的第一链和第二链的序列，分别由SEQ ID NO: 210和314组成，并且其中所述dsRNA与表达所述磷脂酰肌醇4-激酶基因的细胞接触后，抑制所述磷脂酰肌醇4-激酶基因的表达。
2.权利要求
1所述的dsRNA，其中所述的接触至少40%降低磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽的表达水平。
3.权利要求
1或2所述的dsRNA，其中所述的接触在体外以30nM或更低进行。
4.包含权利要求
1至3任一项所述dsRNA的人肝癌细胞。
5.用于治疗由丙型肝炎病毒感染介导的病理过程的药物组合物，其包含权利要求
1至3任一项所述的dsRNA和可药用载体。
6.权利要求
5所述的药物组合物，其包含完全包封的脂质体、脂类复合体、和/或多聚体。
7.权利要求
1至3任一项所述的dsRNA的用途，用于制备在细胞中抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽基因的表达的药物组合物。
8.权利要求
7所述的用途，其中所述药物组合物用于治疗由正链RNA病毒感染介导的病理过程，所述正链RNA病毒是丙型肝炎病毒。
9.抑制磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽基因在细胞中表达的载体，所述载体包含有效连接至编码权利要求
1至3任一项所述的dsRNA的至少一条链的核苷酸序列的调节序列。
10.包含权利 要求9所述载体的人肝癌细胞。
专利摘要
本发明是用于治疗病毒感染的dsRNA。涉及靶向磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)的基因表达的双链核糖核酸(dsRNAs)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)的双链核糖核酸(dsRNAs)，并涉及它们用于治疗由正链RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)所致感染的用途。每一dsRNA包含具有这样的核苷酸序列的反义链，所述核苷酸序列长度短于30个核苷酸、通常长19-25个核苷酸，并且基本互补于PIK4CB靶mRNA或PIK4CA靶mRNA的至少一部分。许多这样的dsRNA可用于提供治疗益处。本发明也涉及包含dsRNA和可药用载体的药物组合物，并且包括递送形式如完全包封的脂质体或脂类复合体。
文档编号A61K48/00GKCN103215269SQ201310098336
公开日2013年7月24日 申请日期2008年7月4日
发明者M·A·拉博, L·A·该赛, J·博劳斯基 申请人:诺瓦提斯公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan