br>[0144] 感染要被治疗的受治者可以是人类或对人类有经济价值和/或社会价值的哺乳动 物，例如，除了人类之外的食肉动物（如猫和狗）、猪(猪、阉猪和野猪）、反刍动物（如牛、公 牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼）、马和鸟类(包括那些濒危的、养在动物园的鸟类）， 以及飞禽，以及更加特别的，驯养飞禽，例如，家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等），因为它们 同样对人类有经济价值。所述术语"受治者"不表示特定的年龄。因此，成年的和新生的受治 者均要覆盖在内。
[0145] 本发明还提供了 IAP拮抗剂在制造用于治疗受治者的细胞内感染的药物方面的用 途。
[0146] 所述药物可包含附加量的药学上可接受的和适合的载体、稀释剂或赋形剂。这些 载体、稀释剂或赋形剂包括所有已知的溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、铸件 (castings)、抗真菌和抗菌剂、表面活性剂、等渗和吸收剂等。应当理解的是，所述药物还可 包含如本文中所述一种或多种额外的治疗剂（即除了所述IAP拮抗剂之外的治疗剂）。例如， 在感染为HBV感染的情况下，所述药物可进一步包含选自拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦、替 比夫定和恩替卡韦的HBV抗病毒剂。在感染为HCV感染的情况下，所述药物可进一步包含聚 乙二醇化IFNa和利巴韦林，和/或米拉韦生（Janssen et al.N Engl J Med，2013，vol.368 (18):1685-94)〇
[0147] 本发明还设想了与其它药物活性剂的联合制剂和/或联合给药，所述其它药物活 性剂包括但不限于TNF-α激动剂（如TNF-α)，TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体），STRAIUta 剂，例如但不局限于TRAIL受体抗体。
[0148] 本领域的技术人员将会理解的是，本文中所描述的本发明容许除了这些具体描述 的之外的变体和修饰。会被理解的是，本发明包括所有落入其精神和范围之内的变体和修 饰。本发明还包括所有在本说明书中单独或共同提及或指出的步骤、特征、组合物和化合 物，以及两种以上的所述步骤或特征的任意或全部的组合。
[0149]除非另有定义，否则本文中所用的所有技术或科学术语具有与本发明所属领域的 普通技术人员的常规理解相同的含义。尽管任何与本文所述的这些相类似或等同的材料和 方法可被用于实践和检验本发明，但现在描述的是优选的材料和方法。
[0150] 实施例
[0151] 实施例1:小鼠的乙型肝炎感染
[0152] 本发明的发明人采用了可用于引起小鼠的HBV感染的技术7,8。将含有大于基因组 长度HBVl. 2(侧翼为腺伴随病毒的末端反向重复)的裸质粒DNA液压注射以产生大量的下腔 静脉压来迫使DNA进入肝脏，在此其被纳入肝细胞 7'8。重要的是，注入动物的DNA不包含任何 的腺伴随病毒的编码序列。所述质粒未被封装，故在注射制剂中不存在病毒结构或非结构 蛋白。
[0153] 对小鼠进行间歇放血并分离其血清。采用Qiagen病毒DNA提取试剂盒来纯化病毒 DNA。如前所述9，通过RT-PCR实现HBV基因组的绝对定量。
[0154] 采用这种技术，C57BL/6小鼠（任一性别为6-12周龄)被感染了HBV，它们表达表面 抗原、核心抗原和e-抗原，以及表现出高水平的血清HBV DNA(见图1)。还有，在受感染动物 的血清中识别出了病毒粒子，且肝脏的组织学检查显示出约20%的肝细胞被感染了 HBV(表 达HBcAg(乙肝核心抗原））。这个非常接近地模拟了人类感染。而且，非常类似于人类感染， 小鼠在感染后的8至12周开始控制病毒血症，但超过感染后的24周仍旧在小鼠的血清中发 现了HBV DNA(见图2)。这表明HBV的全复制生命周期在小鼠肝脏细胞中进行了重演，游离型 HBV转录模板可能持续存在于某些肝细胞中，导致在感染后的24周观察到病毒血症的复发。
[0155 ] 实施例2:用b i r i napan t对小鼠的治疗
[0156]用HBV来感染C57BL/6小鼠，并在感染后6天接受birinapant(30mg/kg腹膜内给药） 或载体对照(DMSO)每周一次给药总共3周(3次剂量)的治疗。
[0157] HBV感染后六天，小鼠接受birinapant或载体对照的治疗。相比于用载体对照治疗 的小鼠的病毒载量，在三次剂量的birinapant之后，HBV病毒载量减少了两个数量级。在首 次剂量的birinapant之后的39天，所有birinapant治疗的HBV感染小鼠在它们的血清中不 具有可察觉到的HBV DNA。平均来看，在此时间点用载体对照治疗的小鼠在它们的血清中仍 旧具有约IO6个拷贝的HBV DNA(见图3)。结果发现，3次剂量的birinapant在促进HBV清除方 面具有相当于6次剂量的birinapant的同等效力。birinapant治疗早在首次治疗剂量后的 10天就实现了 HBV的清除（见图4)。
[0158] 实施例3:cIAPl和cIAP2的基因靶向重演了用birinapant治疗所看到的HBV清除动 力学
[0159] 具有ClAPl缺陷(肝特异性缺陷)并且所有组织中CIAP2缺陷的基因靶向小鼠，能够 以与用birinapant治疗的小鼠相似的动力学来清除HBV感染(见图5)。
[0160] 实施例4:birinapant在人类外周血单核细胞(PBMC)中抗HIV-1JR-CSF的活性
[0161] 方法
[0162] 病毒分离
[0163] 从NIAID艾滋病研究和参考试剂计划（NIAID AIDS Research and Reference Reagent Program)处获得了HIV-I分离种群JR-CSF(M组，B亚型，嗜CCR-5的（CCR5-tropic)， 分离自过滤的AIDS痴呆患者的脑脊液）。利用新鲜的人PBMC制备病毒的近传代原种（low passage stocks)，并将其储存在液氮中。在临用之前，将病毒的预滴定小样(pre-titered aliquots)从冷藏库取出，在生物安全柜中快速解冻至室温。
[0164] 在新鲜的人PBMC中的抗HIV效力评价
[0165] 从筛选的捐赠者（Biological Specialty Corporation，Colmar，PA)中分离HIV和 HBV血清阴性的新鲜人PBMC。细胞通过低速离心和在I3BS中重新混悬来沉淀/洗涤2-3次，以 除去污染性的血小板。然后在50mL离心管内将白细胞化的血液用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)1:1 稀释，并通过 14mL的淋巴细胞分离介质（Lymphocyte Separation Medium，LSM; Mediatech，Inc ·的 Cellgro?;密度I · 078+/-0 · 002g/ml;Cat · #85-072-CL)来分层，然后在 600X g下离心30分钟。将带状的PBMC轻轻地从生成的界面吸出，随后通过低速离心用PBS洗 涤2次。最终的洗涤之后，细胞通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)来计数，并以1 XlO6细胞/mL在补充了 15%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)和2mM L-谷氨酰胺、4yg/ mL植物血球凝集素(Phytohemagglutinin，PHA; Sigma公司）的RPMI 1640中重新混悬。使所 述细胞在37°C下孵育48-72小时。孵育后，将PBMC离心并重新混悬在含15%FBS、2mM L-谷氨 酰胺、lOOU/mL青霉素、100yg/mL链霉素和20U/mL重组人IL-2(R&D Systems，Inc公司）的 RPMI 1640中。于培养基中包含IL-2以维持PHA促有丝分裂刺激(mitogenic stimulation) 引发的细胞分裂。将PBMC以1-2 X IO6细胞/mL的浓度保持于此培养基中，两周更换一次培养 基，直至用于测定。细胞在被认为用于测定太老并被舍弃之前，最多保持在培养液中两周。 单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)由于贴附于组织培养瓶上的结果而在培养中耗尽。
[0166] 对于标准PBMC测定，将来自至少两个正常捐赠者的PHA受激细胞合并（混合在一 起），在新鲜的培养基中稀释至I X IO6细胞/mL的最终浓度，以50μLν孔(5 X IO4细胞/孔)置入 96孔的圆底微培养板的内孔中。合并(混合)来自多于一个正常捐赠者的单核细胞是用于使 在个体捐赠者之间观察到的变化降至最低，所述变化源自在HIV感染及对原代淋巴细胞群 体的PHA和IL 2的全面反应方面的定量和定性差异。各个培养板均包含病毒/细胞对照孔 (细胞+病毒)和试验孔(药物+细胞+病毒）。在此体外测定中，在整个孵育期间保持高的PBMC 活力。因此，受感染的孔被用于评价抗病毒活性和细胞毒性。在微量滴定管中以2 X浓度制 备测试药物的稀释度，并采用标准形式将IOOyL的各个浓度(总共九个浓度)放入适当的孔 中。将50yL预定稀释度的病毒原种放入各个测试孔(最终MOI E 0.1)中。在感染后六天内将 PBMC培养物保持在37°C、5 % C02的条件下。此期间之后，收集无细胞的上清液样本以分析逆 转录酶的活性。取出上清液样本之后，通过向所述培养板添加 MTS来测定化合物的细胞毒 性，以确定细胞活力。还在显微镜下检查了各个孔，并记录下任何的异常情况。
[0167] 逆转录活性测定
[0168] 利用了基于微量滴定板的逆转录(RT)反应(Buckheit et al · ,AIDS Research and Human Retroviruses 7:295-302,1991)。将氣标记的胸苷三磷酸（3H_TTP，80Ci/mmol， NEN)以lmCi/ml溶于I: ldH2〇:乙醇中。通过混合150yPoly rA(20mg/ml)与0.5ml寡脱氧胸苷 酸（oligodT)(20 单位/ml)及5.35ml无菌dH2〇而制得了 Poly rA: 〇1 igodT模板：引物 (Pharmacia公司）作为原液，随后取样（1.0ml)并在-20°C下储存。每天新鲜制取RT反应缓冲 液，其由 125μ1 1.0M EGTA、125yl dH2〇、125yl 20%Triton Χ100、50μ1 1.0M Tris(pH 7·4)、50μ1 1.0M DTT和40μ1 1.0M MgCl2组成。通过混合1份3H-TTP、4份dH20、2.5份poly r A: ο I i godT原液和2.5份反应缓冲剂而制得了最终的反应混合物。将十微升的此反应混合 物放入圆底微量滴定板中，加入15μ1含病毒的上清液并混合。所述微量滴定板在37°C下孵 育60分钟。孵育之后，将反应体积点样到DE81过滤垫(Wal Iac公司）上，在5 %磷酸钠缓冲液 或2X SSC(Life Technologies公司）中清洗5次，每次5分钟，在蒸馏水中清洗2次，每次1分 钟，在70 %乙醇中清洗2次，每次1分钟，然后干燥。结合的放射性(每分钟计数，CPM)采用标 准液体闪烁技术来量化。
[0169] 针对PBMC活力的MTS染色来测量细胞毒性
[0170] 在测定结束时，用可溶性的基于四氮唑的染料MTS ( CelITiter? 96Reagen t， Promega公司）将测定板染色，以确定细胞活力和量化化合物毒性。MTS被代谢活性的细胞的 线粒体酶代谢而产生可溶性甲臜(formazan)产物，允许快速定量分析细胞活力和化合物毒 性。此试剂是稳定的单一溶液，不要求使用前制备。在所述测定结束时，每孔加入10_25yL的 MTS (基于体积的10 %的最终浓度），然后将微量滴定板在37°C、5 %⑶2下孵育4-6小时以评 价细胞活力。采用粘性板密封器来代替盖子，将密封的滴定板倒置几次以混合所述可溶性 甲職产物，并以Molecular Devices Vmax或SpectraMax Plus酶标仪在490/650nm处用分光 光度法读取所述板。
[0171]数据分析
[0172]运用自用计算机程序，PBMC数据分析包括了 I C5q (病毒复制的50 %抑制）、I C9q (病 毒复制的90%抑制）、IC95(病毒复制的95%抑制）、TC5Q(50%细胞毒性）、TC 9Q(90%细胞毒 性）、TC95 ( 95%细胞毒性)和治疗指数值(TI=TC/IC;也称为抗病毒指数或Al)的计算。以下 提供了抗病毒活性和毒性二者的原始数据和所述数据的图表形式。
[0173] 结果
[0174]评价了含有或不含固定浓度的TNF-α的birinapant抗HIV-I的抗病毒效力，其结果 总结于表1中。还有，图6和7分别显示了用单独的或与10ng/ml TNF-α结合的各种浓度的 birinapant在PBMC中对HIV JR_CSF复制的抑制。
[0175]表1:在PBMC中 Birinapant 土 TNF-α 抗 HIV-IJR-CSF 的活性
[0177] Birinapant在PBMC中展现抗HIV-I的抗病毒活性及某些细胞毒性。在固定浓度 (10ng/mL)的TNF-α的存在下，在抗病毒效力方面有了6倍的增长。在细胞毒性方面的1.6倍 的增长是在所述测定的预期生物差异的范围内。单独使用TNF-a在此测定中发挥了减少 35 %的HI V复制的效力，且利用MTS端点不会影响细胞活力。
[0178] 实施例5: birinapant抗HIV-I受感染细胞的活性
[0179] 方法
[0180] 分离和活化。来自健康捐赠者的PBMC通过Ficoll (GE)梯度离心来分离，并用磁珠 (Miltenyi公司）来去除CD8+细胞。余下的PBMC或者保持在幼稚态Cnaive state)，或者在 PHA(10yg/mL)中活化并在 RF10(RPMI，10%FCS，2%谷氨酰胺）（补充有 IL-2(10U/mL)和 IL-7 (25ng/mL))中培养3天。
[0181] HIV感染。在37°C下以0.1的MOI用HIV NL4.3(GFP+，nef缺陷）将活化的PBMC感染2 小时，或弃去未被感染的。孵育后，将细胞在PBS中洗涤3次，并在补充有IL-2和IL-7的RFlO 中混悬，并在I X IO6细胞/mL下进一步培养3天。
[0182] birinapant处理。向PBMC补充新鲜的培养基，然后用birinapant(0 · ΙμΜ、IyMSlOy Μ)或单独的DMS0(1 %最终浓度)处理6小时或12小时。处理之后，将细胞在最终浓度2% (w/ v)的多聚甲醛中固定。
[0183] FACS。固定的细胞用PermWash (BD公司）进行可渗透化处理，并在4°C下用针对⑶4 (APC-H7; 1:20)、CD3(PE-Cy7，1:40)和活性半胱天冬酶3(AF647，1:25)的抗体(所有的抗体 均购自BD公司）染色1小时。
[0184] 结果
[0185] 结果显示于图8中。单次剂量的ΙΟμΜ birinapant之后，55%的HIV受感染细胞在24 小时内死亡。Mrinapant对幼稚细胞的活力具有极小的影响，并对活化T细胞具有小的影 响。
[0186]实施例5:birinapant抗结核分支杆菌感染的活性
[0187] 用结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(H37Rv菌株)来感染总数32只小 鼠，休养4周后，17只小鼠用Birinipant处理(通过腹膜内注射，30yg/g )，15只小鼠用DMSO处 理，二者均以每周一次的剂量给药。三次剂量之后，安乐死小鼠并将肺取出、匀浆化并将匀 衆在Middlebrook 7H11琼脂板上连续稀释上样。培养3周后确定菌落形成单位(CFU)，结果 显示于图9中。
[0188] 解剖小鼠时，用显微镜注意到birinipant处理组的肺外观呈现粉色，一致且健康。 与DMSO组相比，脾也是增大了的。结果显示出birinipant组中载菌量(0.33Log 1QCFU/肺)在 统计学上显著降低(P = 〇.012)。
[0189] 实施例6:诘抗TNF-α细胞因子对birinapant活性的影响
[0190]用HBV来感染小鼠，然后在各种指示的时间点注射(腹膜内）TNF-α拮抗抗体。作为 对照组，给另一群HBV感染小鼠注射不相关的IgGl同型对照抗体。
[0191 ] 此实验的结果显示于图10中。如此图所示，对TNF-a活性的诘抗抵消了birinapant 的效力。因此，birinapant，至少部分地，提升了内源性产生的TNF-α杀死受感染肝细胞和/ 或降低HBV水平的能力。
[0192] birinapant显示出促进和提高内源性产生的TNF-a的能力，以及提升此细胞因子 消除感染的能力。已知IAP同样用于调节内源TRAIL信号（另一TNF超家族成员），因而 birinapant，通过其诘抗IAP的能力，也可提升TRAIL摧毁受感染细胞的能力。
[0193] 数据表明birinapant提升了内源TNF-α的活性，并促进了此细胞因子摧毁受感染 细胞的能力。与单独的birinapant相比，birinapant与同时给药的外源性TNF-α样分子的组 合，随后将很可能会显示出在摧毁HBV方面的显著提高的效力(这已在实施例4中用HIV予以 说明）。由于它的毒性，TNF-α难以被给药人体，但相关分子TRAIL已被用于人体试验且未发 现有毒。因此，本发明的IAP拮抗剂（特别是birinapant)与TRAIL的组合可被用于提高 b i r i napan t的效力并促进对感染细胞的清除。
[0194] 实施例7:其它IAP拮抗剂的活性
[0195] 用HBV来感染小鼠，并用birinapant或描述于Fan等2013(20)的称之为GT13072的 另一 IAP拮抗剂(SMAC模拟物)来处理。
[0196] 用HBV来感染C57BL/6小鼠，并在感染后6天将小鼠随机分为3群。一群用 birinapant来处理(如实施例2所述），另一群接受GT13072每周一