一种快速积累微藻胞内油脂的方法

专利名称：一种快速积累微藻胞内油脂的方法
一种快速积累微藻胞内油脂的方法技术领域
本发明属于生物能源领域和/或微藻生物技术领域，涉及一种快速积累微藻胞 内油脂的方法。
背景技术：
微藻能源发展前景广阔、优势独特已获国内外公认。迄今，世界各国在该领域 的研发工作还停留在实验研究和中试论证的起步阶段(李元广、谭天伟、黄英明，微藻 生物柴油产业化技术中的若干科学问题及其分析，中国基础科学，2009，5，64 70)， 但均遇到技术不成熟而导致成本高这一瓶颈，因而微藻能源在全球尚未实现规模化制备。
掌握能源微藻的高效培养模式是实现微藻能源规模化制备的基础。现有生长 快的藻种一般油脂含量较低，而含油量高的藻种生长大多比较缓慢。这一矛盾是能源 微藻高效培养模式开发的现实障碍。微藻培养包括自养、异养和混合营养三种模式 (Yanna Liang, Nicolas Sarkany, Yi Cui.Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions.Biotechnology Letters, 2009，31 : 1043 1049)。异养培养模式(Han Xu，Xiaoling Miao，Qingyu Wu.High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of Biotechnology, 2006，126 499 507)存在“不能直接利用太 阳能、不能固定C02、能耗大”等问题，因而难以用于能源微藻的大规模培养。美国 1998年的ASP计划工作总结报告指出相对低成本的开放式光自养培养是最有前景的 培养模式(Sheehan J, Dunahay T, Benemann J, et al.A Look Back at the U.S.Departmentof Energy' s Aquatic Species Program---Biodieselfrom Algae.National Renewable EnergyLaboratory, 1998)。但是，开放式光自养存在的“培养密度低、易被污染、水分蒸发、 受环境因素影响大”等问题，也使其难以满足能源生产的规模需求。
针对开放式光自养培养存在的问题，人们试图采用封闭式光生物反应器进行微 藻的光自养培养。封闭式光生物反应器包括管道式、平板式、柱式等(Ogbonna J C， Tanaka H.Industrial-size photobioreactors.Chemical technology, 1997, 27(7) 43 49), 虽然具有细胞密度高、生长快等优点，但由于成本高、放大技术不成熟等原因，目前尚 未应用于微藻的大规模培养。
此外，近年来人们试图采用封闭式光生物反应器和开放池组合进行微藻的光自 养培养即先利用密闭式光生物反应器实现微藻的高密度培养，再利用开放池降低生产 成本。该模式基本具备“可利用太阳能、高密度、固定co2、低成本、高效”的特征， 但如何实现全过程的有效控制和系统工程优化，还有待深入研究。
学者公认能源微藻培养模式应具备“可利用太阳能、高密度、固定C02、低成 本、高效”的特征，为实现这一目标，研究者先后又探索推出了 “混合营养”、“先自 养，后异养”等培养模式
(1)混合营养模式是指藻细胞利用光和有机物作为能源、再利用有机物和 无机物作为碳源的培养方式(Lee YK，Ding SY, Hoe CH，Low CS.Mixotrophic growth of Chlorella sorokiniana in outdoor enclosed photobioreactor. Journal of applied phycology, 1996，8 163 169)。在微藻的混合营养培养过程中，微藻的光合自养和化能异养可以 同时进行。该模式可以通过与富含碳、氮等有机物废水处理结合而降低生产成本，但其 最大问题是大规模培养过程中容易滋生大量杂菌，难以实现微藻的高密度培养。
(2) “先自养，后异养”模式是先利用密闭式光生物反应器自养以固 定 CO2,后进行异养培养(Xiong W, Gao C, Yan D，et al.Double CO2 fixation in photosynthesis-fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production. Bioresource Technology, 2010，101 2287 2293)。该模式存在的最大问题是光诱导培 养过程放大后无法做到无菌培养(Scott SA, Davey MP, Dennis JS, et al.Biodiesel from algae challenges and prospects.Current Opinion inBiotechnology, 2010, 21: 1-10),由于 微藻的异养培养要求藻种必须不带任何杂菌，因此该模式无法放大，不具有规模化应用 价值。
综合上述几种微藻培养模式的优缺点，本发明设计了一种“异养-稀释-光诱导 串联培养”模式，该模式满足了 “可利用太阳能、高密度、固定co2、低成本、高效” 的要求。以小球藻为例，其流程如下首先利用生物反应器异养培养小球藻以获得高 密度细胞，待培养液中有机碳源消耗完毕后，用不含有机碳源的培养基稀释藻液，经短 时间内(8 Mh)的光照诱导，使藻细胞内的油脂快速大量积累。该模式中的异养阶段 是在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行，目的是为 了在短时间内获得较高密度的细胞；光诱导阶段可在任何可用于微藻光自养培养的系统 中进行，目的是通过光诱导作用提高胞内油脂的含量；异养阶段与光诱导阶段分开独立 进行，异养阶段放出的藻液先用光诱导培养基进行稀释后再转入光诱导培养阶段。过程 中需确保进入光诱导阶段的藻液中不含有机碳源，这样可避免光诱导阶段滋生过多的杂 菌；而通过稀释作用可以确保光诱导阶段的藻细胞能获得充足的光照，实现胞内油脂含 量的快速提高。该模式和上述其他模式相比，具有生产效率高、不存在因不同系统的组 合而造成的异养培养过程染菌问题(光自养培养过程有杂菌并不影响生长)、所用培养系 统的组合方式灵活和生产成本低等优点，可充分发挥小球藻在光诱导阶段油脂快速积累 的优势，为解决生物柴油规模化制备过程中由于原料不足而导致的成本过高问题提供重 要的技术手段。发明内容
本发明提供了一种快速积累微藻胞内油脂的方法，该方法包括微藻异养培养的 步骤，将异养培养所获得的微藻培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及任选的藻细 胞采收、油脂分离提取的步骤。
本发明提供一种微藻油脂的生产方法，该方法包括微藻异养的步骤，将微藻的 异养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。该 方法能够实现胞内油脂的快速积累，具有占地面积少、面积产率高、相对微藻光自养而 言因细胞密度高而带来的采收成本低(光诱导时的细胞密度较高，一般为2 @/L)，因5而大大提高了生产效率，降低了生产成本。
在一个具体实施方式
中，所述的微藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小 球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorellaemersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis， 以 及绿藻门中的 Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris, Scenedesmus obliquus， Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele， Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；
娃藻门的 Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis, Nitzschia alba, Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa ；
蓝藻门的 Anabaena variabilis ；
金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ；
甲藻门的 Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii ；
裸藻门的Euglena gricilis ；
红藻门的 Galdieria sulphuraria。
在一个具体实施方式
中，所述微藻选自绿藻门小球藻属的藻类。尤其是， 所述微藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，普通小球藻 (Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana, Chlorella saccharophila, Chlorella regularis, Chlorella minutissima, Chlorella protothecoides 禾口 Chlorella zofingiensis。
在一个具体实施方式
中，所述微藻选自蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)， 普通小球藻(Chlorella vulgaris)和椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)。
在一个具体实施方式
中，所述微藻异养的步骤包括在生物反应器中加入pH为 4.0 10.0的培养基，按工作体积的0.1 30%接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培 养、连续培养或半连续培养，培养温度为10 50°C，控制pH小于10.0，控制溶氧在 以上。
在一个具体实施方式
中，所述藻液稀释包括用培养基将异养获得的藻液稀释至 细胞密度为0.1 50克/升，所述培养基不含有机碳源，其pH为4.0 10.0。
在一个具体实施方式
中，所述光诱导培养包括将稀释后的藻液转入光诱导装置 中进行光诱导，连续光照或间歇光照，培养温度为5 50°C，光照强度为0.1 150klx， 光诱导培养周期为1 150小时。
在一个具体实施方式
中，异养培养基由氮源、有机碳源以及少量无机盐、微量 元素和水组成；光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成。
在一个具体实施方式
中，所述异养步骤在摇瓶、机械搅拌式、气升式或鼓泡式 可异养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养步骤在摇瓶或选自敞开式的跑道池或 圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器或薄膜 立袋与吊袋光生物反应器等任何可用于微藻光自养培养的装置中进行，光照条件为自然 光或人工光照射。
在一个具体实施方式
中，当小球藻为普通小球藻时，异养所使用的培养基基本 上由以下成分组成KN035 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4 0.3 0.9克/ 升、N^HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升、MgSO4 · 7H20 0.2 1.0 克 / 升、CaCl20.05 0.3克/升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.05克/升；微量元素0.5 4ml，其中微量元素的 组成为 H3BO3 5 15 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 5.0 10.0 克 / 升，MnCl2 · H2O 1.0 2.0 克 / 升，(NH4)6Mo7Om · 4H20 0.5 1.5 克 / 升，CuSO4 · 5H20 1.0 2.0 克 / 升， Co(NO3)2 · BH2O 0.1 0.9克/升；水。在一个具体实施方式
中，当小球藻为蛋白核小 球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成葡萄糖10 60克/升，尿素2 8 克 / 升，KH2PO4 1 2 克 / 升，N^HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升，MgSO4 · 7H20 1 2克/升，CaCl2 0.05 0.1克/升，梓檬酸三钠0.1 2.0克/升，Fe—EDTA溶液 0.5 lmL，A5溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 20 30克/升 和EDTA 20 40克/升；A5溶液配方为H3BO3 2.5 4.0克/升，MnCl2 · 4H20 1.0 2.0 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 0.1 0.6 克 / 升，CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升，N^MoO4 0.01 0.05 克 / 升；7jC。
在一个具体的实施方式中，所述油脂分离提取方法采用有机溶剂提取法。
在另一具体实施例中，所述微藻培养方法还包括提取微藻油脂的步骤。
本申请还提供一种油脂生产方法，该方法包括异养培养微藻的步骤，将异养培 养的微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。
本申请的油脂生产方法中使用到的微藻、培养基以及培养条件等如本文上文以 及下文具体实施方式
部分所详述。
用本发明公开的异养-稀释-光诱导串联技术培养小球藻，首先在密闭式生物反 应器中高密度异养培养小球藻，待培养液中有机碳源消耗完毕后，用不含有机碳源的培 养基稀释藻液，经短时间内(8 Mh)的光照诱导，可使藻细胞内的油脂含量快速大量积 累，油脂含量在短时间内(例如8 M小时)比异养阶段的藻细胞提高约一倍(异养阶 段胞内油脂含量一般不超过10%，经光诱导后可达20 30% )。
附图简述


图1显示在50L生物反应器/3L平板式光生物反应器串联系统中采用异养-稀 释-光诱导串联培养蛋白核小球藻快速积累油脂的结果(同时测定了细胞内其他主要生化 成分)。
图2显示5T发酵罐串联至户外30L平板和60L大盆连续培养普通小球藻光诱导 阶段户外自然光强和自然温度的变化曲线。
图3显示5T发酵罐串联至户外30L平板培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲 线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图4显示5T发酵罐串联至户外60L大盆培养普通小球藻快速积累油脂的过程曲 线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图5显示5T发酵罐串联至户外20m2跑道池和3.14m2圆池连续培养普通小球藻 光诱导阶段户外自然光强和自然温度的变化曲线。
图6显示5T发酵罐串联至户外20m2跑道池培养普通小球藻快速积累油脂的过程 曲线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图7显示5T发酵罐串联至户外3.14m2圆池培养普通小球藻快速积累油脂的过程 曲线(同时测定了细胞内其他主要生化成分)。
图8显示500mL摇瓶/3L圆柱式光反应器串联培养椭圆小球藻胞内主要生化成 分的变化曲线。具体实施方案
适用于本申请的微藻包括但不限于绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)， Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila, Chlorella regularis， Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis，以及绿藻门中 的 Brachiomonas submarina，Chlamydobonas reinhardtii，Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris，Scenedesmus obliquus，Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica， Tetraselmis chuii， Tetraselmis tetrathele, Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；
娃藻门的 Cylindrotheca fusiformis，Nitzschia laevis，Nitzschia alba, Nitzschia fonticola，Navicula incerta, Navicula pelliculosa ；
蓝藻门的 Anabaena variabilis ；
金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ；
甲藻门的 Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii ；
裸藻门的Euglena gricilis ；
红藻门的 Galdieria sulphuraria。
在优选的实施方式中，本发明采用绿藻门小球藻属的藻类来生产油脂。在更优 选的实施方式中，本发明采用蛋白核小球藻、普通小球藻或椭圆小球藻来生产油脂。
1.微藻在生物反应器中的高密度异养培养
此步骤的目的是为了快速获得大量藻细胞，以供光诱导阶段快速合成积累各种 活性成分，尤其包括油脂、色素、蛋白质、多糖等。
可采用本领域熟知的各种培养基来进行微藻异养培养。通常，异养培养基含有 氮源、有机碳源、少量无机盐、微量元素和水。适用于微藻培养的氮源、有机碳源、无 机盐、微量元素等是本领域周知的。例如，作为氮源，可使用的有尿素或各种硝酸盐， 如KNO3等；作为有机碳源，可使用的有例如葡萄糖等。
这类培养基包括HA-SK培养基(中国专利ZL 200610024004.9)、Endo培养基 (Ogbonna J.C., Masui.H., Tanaka.H.Sequential heterotrophic autotrophic cultivation—an efficient method of producing Chlorella biomass for health foodand animal feed. J. Appl. Phycol.1997, 9，359 366)等。
本发明所用的HA-SK培养基是基本上由KN03、葡萄糖以及少量无机盐、微 量元素和水组成。在所述技术方案中，所述微量元素宜选自H3BO3, ZnSO4 · 7H20， MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20, CuSO4 · 5H20, Co(NO3)2 · 6H20 中的一种或多种或全部。
本文所用的术语“基本上由……组成”表示本发明的组合物中除了含有主要组分ΚΝ03、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特 性或新的特性(即可维持微藻在较短的培养周期内细胞密度达到较高的水平，同时活性 物质含量与常规异养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。本文所用的术 语“由……组成”表示本发明的组合物由所指出的具体组分组成，没有其他组分，但是 可以带有含量在通常范围内的杂质。
在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对微藻细胞密度和 品质有很大的实质影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技 术人员所熟知的，培养基中还可加入少量无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和磷 酸盐等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。
在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自H3BO3, ZnSO4 · 7H20， MnCl2 · H2O, (NH4)6Mo7O24 · 4H20, CuSO4 · 5H20, Co(NO3)2 · 6H20 中的一种或 多种。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。
本发明所采用的HA-SK培养基基本上由以下成分组成KN03 5 15克/升、 葡萄糖 10 60 克 / 升、KH2PO4 0.3 0.9 克 / 升、Ν%ΗΡ04 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升、 MgSO4 · 7H20 0.2 1.0 克 / 升、CaCl2 0.05 0.3 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.05 克 /升；微量元素0.5 4ml，其中微量元素的组成*H3B035 15克/升，ZnSO4 · 7H20 5.0 10.0 克 / 升，MnCl2 · H2O 1.0 2.0 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H200.5 1.5 克 / 升，CuSO4 · 5H20 1.0 2.0 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H20 0.1 0.9 克 / 升;水。
在一个较佳的实施方案中，本发明的HA-SK培养基组合物宜由以下成分组成 KN03 7 克/ 升、葡萄糖 40 克 / 升、KH2PO4 0.6 克 / 升、Ν ΗΡ04 · 12H20 2.0 克 / 升、 MgSO4 · 7H20 0.8 克 / 升、CaCl2 0.2 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.03 克 / 升；微量元素 1.5mL,其中微量元素的组成为H3BO3 11 12克/升，ZnSO4 · 7H20 8.5 9.5克/升， MnCl2 · H2O 1.4 1.5 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.8 0.9 克 / 升，CuSO4 · 5H20 1.5 1.6 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H20 0.45 0.55 克 / 升；水 lOOOmL。
本发明所用的Endo培养基基本上由以下成分组成葡萄糖10 60克/升， 尿素2 8 克/升，KH2PO4 1 2 克 / 升，NiHPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升， MgSO4 · 7H201 2克/升，CaCl2 0.05 0.1克/升，柠檬酸三钠0.1 2.0克/升， Fe-EDTA溶液0.5 lmL，A5溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA 20 40克/升；A5溶液配方为H3BO3 2.5 4.0克/升， MnCl2 · 4H20 1.0 2.0 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 0.1 0.6 克 / 升，CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升，N^MoO4 0.01 0.05 克 / 升；水。
在一个较佳的实施方案中，所述Endo培养基由以下成分组成葡萄糖40克/ 升，尿素 6.0 克 /升，KH2PO4 1.5 克/ 升，Na2HPO4 · 12H20 5.0 克 / 升，MgSO4 · 7H201.8 克/升，CaCl2 0.05克/升，柠檬酸三钠0.4克/升，Fe-EDTA溶液0.8mL，A5溶液 2.0mL,其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 25克/升和EDTA 33.5克/升，A5溶 液配方为 H3BO3 2.86 克 / 升，MnCl2 · 4H20 1.81 克 / 升，ZnSO4 · 7H200.222 克 / 升， CuSO4 · 5H20 0.07 克 / 升，N^MoO4 0.021 克 / 升;水。
在根据上述配方配制培养基后，可用常规手段如酸或碱将所述培养基的pH调为 4.0 9.0，并在115 120°C下高压灭菌15 20分钟。可采用分批培养、补料分批培9养、半连续培养(带放)或连续培养等四种方式实施异养培养。
当进行异养培养时，将相应配制好的培养基加入到生物反应器中，补加水至工 作体积，通常装料系数为0.6 0.8，然后蒸汽灭菌(121°C，维持约20分钟)，当温度降 至30 35°C时，按工作体积的1 15%接入微藻开始异养培养。
无论采用何种培养方式，在培养过程中，须控制适合的培养条件使微藻正常生 长。通常，控制温度为20 35°C，例如^ 30°C，溶氧不低于5%的空气饱和浓度， pH不高于9.0。在优选的实施例中，溶氧不低于10%的空气饱和浓度，pH不高于8.5。 在其它优选的实施例中，溶氧不低于15%的空气饱和浓度，pH不高于8。
在培养过程中，pH不宜过高或过低，一般随着培养的进行，pH会慢慢上升(对 于普通小球藻此现象特别明显)，pH过高会对藻细胞生长产生不利影响，所以应用酸(例 如10%的硫酸)进行调节，使pH不高于9.0，较佳的pH应为6.5 7.5。
无论采用何种异养培养方式，转入光诱导的藻液，在更佳的方案中应使藻液中 有机碳源例如葡萄糖含量为零或接近于零。
异养可以在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中 进行。
2.高浓度藻液的稀释
此步骤的目的是为了使转入光诱导培养的小球藻高效地吸收光能，提高光能利 用效率，同时降低藻细胞的死亡率。因为光强在藻液中呈“时、空、非线性”衰减，所 以在高细胞密度下，反应器中藻细胞大部分处于暗区，几乎接受不到光照，这样藻细胞 很容易死亡而且会影响光诱导的效率。
异养培养获得的高密度藻液应进行稀释操作，用水和不含有机碳源的培养基对 高密度的藻液进行稀释，使细胞密度维持在0.1 10克/升，调节pH至5.0 8.0。在 其它实施例中，稀释藻液，使细胞密度维持在1 8克/升。在优选的实施例中，使细 胞密度维持在1.0 5.0克/升。在其它实施例中，使细胞密度维持在2 5克/升或者 2 4克/升。稀释的藻液的pH可以调节为5.5 7.5，例如6.0 7.5等。
可采用各种已知的稀释培养基来稀释藻液。通常，可使用光诱导培养基进行稀 释。光诱导培养基通常含有氮源、无机盐和水，相对于异养培养基不含有有机碳源。在 优选的实施方案中，所述培养基的氮源浓度为0.1 10克/升，较佳为0.3 6克/升， 更佳为0.5 5克/升。所述氮源可以与异养培养步骤中所用的氮源相同或不同。
在一个优选的具体方案中，异养培养获得的高密度藻细胞宜用氮源浓度为0.1 10克/升而不含有机碳源的初始培养基(例如，培养普通小球藻时采用不含葡萄糖的 HA-SK培养基，培养蛋白核小球藻时采用不含葡萄糖的Endo培养基)进行适当稀释。
稀释采用的培养基无需高压灭菌，配制好后调节pH至5.0 8.0即可使用。
在具体实施方式
中，对普通小球藻，稀释培养基(光诱导培养基)由以下成分组 成KNO3 0.1 5 克 / 升、MgSO4 · 7H20、0.5 5.0 克 / 升、CaCl2 0.01 0.06 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.06 克 / 升、EDTA0.020 0.052 克 / 升。
对蛋白核小球藻，稀释培养基(光诱导培养基)由以下成分组成尿素 0.1 5.0 克 / 升、MgSO4 · 7H20、0.5 5.0 克 / 升、CaCl2 0.01 0.06 克 / 升、 FeSO4 · 7H200.01 0.06、EDTA0.020 0.052 克 / 升、柠檬酸钠 0.02 0.5 克 / 升。
3.光诱导培养
该步骤的目的是让微藻接受光照，通过光诱导使藻细胞快速大量合成积累各种 活性成分。
如上所述高密度微藻培养液经稀释后，将所得稀释液转入光诱导装置中进行 光诱导培养。添加的光诱导培养基如上文所述，温度控制在5 50°C，光照强度为 0.11 150klx，连续光照或间歇光照，光诱导培养周期为1 150小时，通气量为0.1 2.0VVm。其中所述的光生物反应器包括所有的封闭式光生物反应器(摇瓶、管道式、平 板式、柱式、薄膜立袋与吊袋等)和所有的开放式光生物反应器(跑道池、圆池和鼓泡式 大盆等)。
通常，培养温度可控制在15 ;35°C的范围内，例如18 ;35°C、20 !35°C、 20 30°C等。通常，光照强度为1 70klx，例如，1 60、1 50、1 40、1 30、 1 20、1 IOklx等，可视具体生产情况而定。通常，通气量可控制为0.15 2.0vvm， 例如，0.2 1.8、0.5 1.5、0.8 1.5、1.0 1.5vvm等。在其它实施方式中，培养温 度控制在10 50°C，光照强度为1 lOklx，通气量为0.05 2.0vvm。
在其它实施例中，光诱导培养周期为8 100小时，例如，根据实际的天气情 况，光诱导培养周期可以为8 90小时、8 80小时、8 60小时、8 48小时、8 M小时不等；或者，光诱导培养周期可以为12 72小时、12 60小时、12 48小 时、12 36小时、12 M小时不等或M 60小时、M 48小时不等。
在本申请中，“光诱导培养周期”包括了整个光诱导培养过程，例如，户外培 养时光诱导培养周期包括夜晚没有光照的时间。
在本申请中，“光照时间”指使用本申请所述光照强度对微藻实施光诱导培养 的时间，即该时间不包括夜晚没有光照的时间。在一些实施例中，光诱导培养步骤的光 照时间为8 48小时，例如8 36小时、8 M小时、8 18小时、8 12小时、 12 36小时、12 M小时不等，以及上述范围内的任意时长。
因此，本申请的光诱导培养步骤也包括光照时间为8 48小时范围内的光诱导 培养步骤。可采用人工光照的方式进行光诱导培养，也可在户外利用自然光照的方式进 行光诱导培养。
在光诱导过程中，当油脂含量达到最高值(不同微藻油脂含量达到的最大值不 一样，可通过测定光诱导过程中胞内油脂含量曲线判断，小球藻一般为20 30%左右) 时可结束光诱导培养，收获藻细胞进行后续的油脂的分离提取。
4.藻细胞采收、油脂的提取及藻体综合利用
光诱导培养结束后，对小球藻进行离心采收，获得湿藻体。藻细胞的采收方法 包括但不限于高速离心、絮凝，气浮或过滤等技术；藻细胞破壁方法包括但不限于藻体 自溶、高压勻浆、酶水解、水相热解等湿法破壁方法。
胞内油脂的提取测定方法包括但不限于有机溶剂萃取法，即将藻体于80 105°C下干燥至恒重，研磨藻粉后采用氯仿甲醇标准萃取溶剂从干藻粉中提取油脂，萃取 溶剂反复提取直至藻粉颜色变为白色，旋转蒸发去除溶剂。
上清液中的其他成分可逐步分离提取获得脂肪酸、叶绿素等，或直接将上清液 中的所有成分与藻体沉淀混合喷雾干燥获得小球藻粉。
本发明中，可对培养所得的微藻进行综合利用，提取其中的色素、蛋白质、多 糖等各种活性成分。活性成分的提取顺序并无特殊限制，但通常要满足先提取的步骤不 能导致后提取的成分损失这一前提。
本文中涉及到藻细胞干重、油脂含量及胞内生化成分的测定方法如下
藻细胞干重测定在微藻(如小球藻)培养过程中取培养液V毫升，SOOOrpm离 心10分钟，将离心后的藻体用去离子水洗涤3次，转移至称量瓶(W1 (克))中，在105°C 烘箱中烘干至恒重W2 (克)。藻体干重Cx可根据下式计算Cx (克/升)=(W2-W1) / V/1000。
油脂测定取一定量各培养阶段烘干至恒重的藻细胞，在研钵中研磨至粉末 状，称取适量藻粉(0.2 0.5g)小心转移至离心管中，加入适量萃取溶剂(氯仿甲醇= 2 1)于超声振荡器中超声振荡30min，8000rpm离心lOmin，将上清转移至已知重量的 干燥旋转蒸发瓶中，重复上述步骤直至上清无色。合并上清后旋转蒸干，称重并计算油 脂含量。
油脂含量(％ )按下式计算
油脂(％) = (W2-W0) /W1XlOO
式中Wi——为藻粉重量，——为烘干至恒重的旋转蒸发瓶重量，g; W2—为油脂萃取液蒸干后蒸发瓶的重量，g。
碳水化合物的测定参照药典2005版，选择蒽酮-硫酸显色反应，采用无水葡 萄糖作为对照品，用比色法在625nm处测定。
蛋白质含量测定微藻(如小球藻)细胞中总蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法 (宁正祥.食品成分分析手册.北京中国轻工业出版社，1998，76-78)。
叶绿体色素含量测定微藻(如小球藻)叶绿体色素含量测定采用Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行 了 修正后的方法(Lichtenthaler HK，Wellburn AR.Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts indifferent sovents.Biochemical Society Transactions, 1983，11 : 591 592)。
灰分测定微藻(如小球藻)灰分采用550 °C灼烧至恒重测量，即国标 GB6438-86 法。
与现有的能源微藻培养积累油脂的方法相比，本发明的方法具有以下优点可 在短时间内获得高密度的微藻细胞，同时可在短时间内使微藻细胞内的油脂含量快速提 高。本发明将微藻培养合成油脂分成藻细胞生长和油脂合成积累两个阶段，即异养培养 和光诱导培养阶段。异养培养微藻的目的是为了快速获得大量的藻细胞，而光诱导培养 的目的是为了诱导微藻细胞快速合成积累大量的油脂，采用异养-稀释-光诱导串联培养 方式培养微藻提高了油脂的产率，一定程度上解决了能源微藻细胞生长和油脂合成不同 时进行的矛盾，大大降低了成本，为解决生物燃料规模化制备过程中由于原料不足而导 致的成本过高问题提供新的技术手段。
此外，本申请之前，本领域的普遍认识是只有通过光自养的模式才能够利用微 藻来大规模生产油脂。然而，光自养培养与本发明的光诱导培养完全不同。光自养培养 中，培养基不含有有机碳源，微藻利用大气中的co2、水、光、和少量无机营养盐进行 光合自养，维持自身的生长，一般接种密度较低(0.1g/L左右)，生长慢(有时候为了促进生长，还需要在培养过程中人工通入CO2),培养周期长(一般要一周以上，户外光自 养培养细胞密度难以达到较高水平)，尤其在大规模培养的时候，为了提供大规模培养所 需的接种藻液，种子扩培需要的时间很长(一般需要1-2个月)，生产效率很低。而本申 请的光诱导所用的培养基和光自养的培养基不一样，由于异养阶段藻液中含有丰富的无 机盐和微量元素等营养成分，所以经过稀释后，所需的光诱导培养基比光自养培养基要 简单很多，例如和文献上常见的微藻光自养培养基BG-Il相比，稀释用的光诱导培养基 中不需要添加磷酸盐、碳酸钠、柠檬酸铁铵以及微量元素，同时添加的硝酸盐用量也比 光自养培养基用量要少很多。通过异养阶段的培养，可以在短时间内积累大量藻细胞， 规模化培养时，通过稀释后，进入光诱导的藻细胞密度(以小球藻为例，密度范围在2 相/L左右)比光自养培养方式的接种密度要高20倍以上，很好的解决了光自养培养方 式接种密度低，种子扩培周期长等缺点，同时在较短时间的光照诱导周期内(一般8 M小时)，藻细胞密度几乎维持不变(即它已经不再生长)，胞内油脂含量却能够快速积 累，含量成倍增长(由10%增加到20 30%左右)，这样相对光自养而言，占地面积大 大缩小，面积产率大幅提高，整个培养周期明显缩短，采收成本降低，生产效率大大提 尚ο
以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。除非另有所述，本发 明采用的培养基中各组分含量均用克/升^/L)表示。应理解，本申请中“含有”、“包 含”也包括“由……组成”、“由……构成”的含义。
实施例1
在50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水至25L后灭菌，当温度降至 30°C时按工作体积的12%接入蛋白核小球藻，开始异养培养。
异养培养条件温度为30°C，初始转速为150r/min，空气流量为lvvm，pH小于8.0，培养过程中通过调节转速控制溶氧15%以上。
将异养培养过程中葡萄糖耗完的高密度藻液稀释到2.70g/L左右，并加入下述光 诱导培养基，转入3L平板式光反应器中进行光诱导培养，温度30°C，光强80001x，空气 流量为lvvm。光诱导培养12h，细胞密度从2.70g/L降低到2.65g/L，油脂含量从9.70% 上升至19.70% (见图1)。
异养培养基
葡萄糖60.0 克 尿素 8.0 克MgSO4 · 7H20 2.0 克
KH2PO4 1.1 克 N^HPO4 · 12H20 9.0 克 CaCl2 0.02 克
柠檬酸三钠1.8克
Fe-EDTA 溶液 1.0ml 微量元素溶液 4.5ml 水 1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 15克/升和EDTA1.4克/升，微量元 素溶液配方为 H3BO3 2.11 克 / 升，MnCl2 · 4H20 0.81 克 / 升，ZnSO4 · 7H20 0.11 克 / 升，CuSO4 · 5H20 10.0 克 / 升，NaMoO4 0.05 克 / 升。
光诱导培养基
尿素0.5克 MgSO4 · 7H20 1.0克 柠檬酸三钠0.05克
CaCl2 0.01 克 Fe-EDTA 溶液 0.4ml 水 IOOOml
其中Fe-EDTA溶液配方为15克/升和EDTA1.4克/升。13
实施例2
在5T发酵罐中加入异养培养基和自来水至2.5T后灭菌，当温度降至30°C时， 以500L发酵罐作为种子罐培养的普通小球藻，培养过程中根据细胞生长情况、发酵液中 溶氧水平来调节罐压、通气量和搅拌转速，维持培养液中充足的氧含量，确保藻细胞的 快速生长。
将前期补料分批异养培养过程中葡萄糖耗完的高密度藻液经光诱导培养基稀释 后，转至30L平板式光反应器及60L鼓泡式大盆中在户外进行光诱导培养。光诱导培养 条件自然温度，温度在13 30°C，自然光照，光强在0 36klx(见图2)，空气流量 为lvvm。光诱导培养《ι后，30L平板式反应器中藻细胞密度从1.60g/L降低到1.46g/ L,油脂含量从7.87%上升至13.27%，后进入夜晚，整个晚上藻细胞密度从1.46g/L降低 至1.16g/L，降幅较白天明显，油脂含量也有小幅下降，从13.27%下降至12.93%，第二 天白天经过4h的短暂光诱导后，藻细胞密度略有上升，从1.16g/L上升至1.18g/L，同时 油脂含量迅速上升，从12.93%升高至18.58% (见图幻，图4为60L鼓泡式大盆中光诱 导情况，数据显示变化规律与30L平板式光反应器的规律相类似。
将半连续异养培养结束后的高密度普通小球藻藻液，经光诱导培养基稀释后， 转入3T跑道池及3.14m2斜叶搅拌式圆池在户外进行光诱导培养。光诱导培养条件 较低自然温度，温度在5 18°C，自然光照，光强在0 34klx(见图5)，空气流量为 lvvm。因该批次5T发酵罐半连续培养结束时间在傍晚，所以藻细胞转入光诱导后即进 入夜晚，光诱导阶段共进行了 90h，前2天天气晴好，但是气温较低，放入藻液的当晚， 最低气温只有5°C，后面两天最高气温为14°C，第三天开始天气转阴有小雨，气温开始 小幅回升，第三天傍晚开始闷热潮湿，整个晚上伴有雷阵雨，第四天上午阴有小雨，午 后雨停，结束培养并采收藻细胞。
由图6、7可以看出，一方面由于气温较低，不利于藻细胞的生长代谢；另一方 面由于第三天开始陆续下雨，雨水稀释了藻液，造成了大池内细胞内浓度下降，所以整 个光诱导过程藻细胞密度下降明显。
由于接种后的前12小时，正好是晚上，光合作用不能进行，所以色素和碳水化 合物均大幅下降，油脂含量却显著升高，从12%升至18%左右，当晚户外温度较低， 低温胁迫可能诱导藻细胞内油脂的合成积累，这也是藻细胞油脂代谢对外界环境变化的 一种响应机制。后面两天温度都较低，最高气温不超过14°C，藻细胞胞内成分没有明 显变化，第三天开始，虽然有雨水，但是气温显著回升，并且闷热潮湿，从实验数据来 看，这种户外实际气候情况反而有利于光诱导过程藻体品质的提升，但是上升速度比较 缓慢。在整个90h的户外光诱导过程中，尽管出现低温、阴雨及雷雨天气，但通过延长 光诱导时间，藻体的品质也能得到大幅提升，最终油脂含量均大幅提升至20%左右。
异养培养基
葡萄糖60.0克 硝酸钾10.0克 MgSO4 · 7H20 0.2克
KH2PO4 0.3 克 Na2HPO4 · 12H20 8.8 克 CaC12 0.02 克
Fe-EDTA 溶液 1.0ml 微量元素溶液 3.5ml 水 1000ml
其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 15克/升和EDTA 1.4克/升，微量元 素溶液配方为 H3BO3 2.86 克 / 升，MnCl2 · 4H20 0.11 克 / 升，ZnSO4 · 7H209.22 克 /升，CuSO4 · 5H20 1.00 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.1 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H200.9克/升。
光诱导培养基
硝酸钾0.5 克 MgSO4 · 7H20 0.6 克
CaCl2 0.03 克 Fe-EDTA 溶液 1.5ml 水 IOOOml
其中Fe-EDTA溶液配方为8克/升和EDTA10.4克/升。
实施例3 异养-稀释-光诱导串联培养过程中椭圆小球藻主要生化成分变化规 律的研究
本实施例在500mL摇瓶/3L圆柱式光生物反应器水平测定椭圆小球藻异养_稀 释-光诱导串联培养过程中主要生化成分的变化。
采用与实施例1和2类似的方式以异养-稀释-光诱导串联培养技术培养椭圆 小球藻，500mL摇瓶，装液量200mL，28°C, 150rpm,待藻细胞密度达到10g/L以上且 葡萄糖耗尽时，转入3L圆柱式光生物反应器进行光诱导培养，藻细胞密度约2g/L，温度 30°C,光强lOl^lx。异养和光诱导所采用的培养基和蛋白核小球藻的相应培养基一致。 异养结束时藻细胞内油脂含量为13.94%，转入光诱导后12h，藻细胞油脂含量快速增加 到 23.91% (见图 8)。
尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说 是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因 此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种快速积累微藻胞内油脂的方法，其特征在于，该方法包括微藻的异养培养步 骤，将异养培养的微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及任选的藻细胞采收、油 脂分离提取的步骤。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的微藻选自绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，普通小球藻(Chlorella vulgaris), 椭 圆 小 球 藻(Chlorella ellipsoidea)，Chlorellaemersonii, Chlorella sorokiniana，Chlorella saccharophila, Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorella protothecoides, Chlorella zofingiensis, 以及绿藻门中的 Brachiomonas submarina， Chlamydobonas reinhardtii， Chlamydomonas acidophila, Haematococcus pluvialis, Haematococcus lacustris， Scenedesmus obliquus， Spongiococcum exetriccium, Tetraselmis suecica， Tetraselmis chuii， Tetraselmis tetrathele， Tetraselmis verrucosa, Micractinium pusillum ；娃藻 门 的 Cylindrotheca fusiformis, Nitzschia laevis，Nitzschia alba, Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Navicula pelliculosa ；蓝藻门的 Anabaena variabilis ；金藻门的 Poterioochromonas malhamensis ；甲藻门的 Amphidinium carterae, Crypthecodinium cohnii ；裸藻门的 Euglenagricilis;和红藻门的 Galdieria sulphuraria。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述异养微藻的步骤包括在生 物反应器中进行异养培养在生物反应器中加入pH为4.0 10.0的培养基，按工作体积 的0.1 30%接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养、半连续培养或连续培养，培养 温度为10 50°C，控制pH小于10.0，控制溶氧在以上。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述藻液稀释包括用培养基将 异养培养获得的藻液稀释至细胞密度为0.1 50克/升，所述培养基不含有机碳源，其 pH 为 4.0 10.0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述光诱导培养包括将稀释后 的藻液转入光诱导装置中进行光诱导，培养温度为5 50°C，连续光照或间歇光照，光 照强度为0.1 150klx，光诱导培养周期为1 150小时。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，异养培养基由氮源、有机碳源 以及少量无机盐、微量元素和水组成；光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述异养步骤在摇瓶、机械搅 拌式、气升式或鼓泡式可异养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养步骤在摇瓶或 选自敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱 式光生物反应器或薄膜立袋与吊袋用于微藻光自养培养的装置中进行，光源为自然光或 各种人工光。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当小球藻为普通小球藻时，异养所使用的 培养基基本上由以下成分组成KNO3 5 15克/升、葡萄糖10 60克/升、KH2PO4 0.3 0.9 克 / 升、Na2HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升、MgSO4 · 7H200.2 1.0 克 / 升、CaCl2 0.05 0.3克/升、FeSO4 · 7H20 0.01 0.05克/升；微量元素0.5 4ml，其中微 量元素的组成为H3BO3 5 15克/升，ZnSO4 · 7H20 5.0 10.0克/升，MnCl2 · H2O 1.0 2.0 克 / 升，(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.5 1.5 克 / 升，CuSO4 · 5H201.0 2.0 克 / 升，Co(NO3)2 · 6H20 0.1 0.9 克 /升；/K。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当小球藻为蛋白核小球藻时，异养所使用 的培养基基本上由以下成分组成葡萄糖10 60克/升，尿素2 8克/升，KH2PO4 1 2 克 / 升，Na2HPO4 · 12H20 1.0 10.0 克 / 升，MgSO4 · 7H20 1 2 克 / 升， CaCl2 0.05 0.1克/升，柠檬酸三钠0.1 2.0克/升，Fe-EDTA溶液0.5 lmL，A5 溶液1 5mL ；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO4 · 7H20 20 30克/升和EDTA20 40克/升；A5溶液配方为H3BO3 2.5 4.0克/升，MnCl2 · 4H20 1.0 2.0克/升， ZnSO4 · 7H20 0.1 0.6 克 / 升，CuSO4 · 5H20 5 10 克 / 升，Na2MoO4 0.01 0.05 克/升；水。
10.—种油脂生产方法，其特征在于，所述方法包括异养培养微藻的步骤，将异养培 养的微藻藻液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、油脂分离提取的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种快速积累微藻胞内油脂的方法，该方法包括异养培养、稀释、光诱导培养、微藻采收以及油脂提取等步骤。采用本发明方法可充分发挥微藻在光诱导阶段油脂快速积累的优势，为解决生物燃料(如柴油、航空煤油等)规模化制备过程中由于原料不足而导致的成本过高问题提供重要的技术手段。
文档编号C12R1/89GK102021208SQ20101054587
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者李元广, 李淑兰, 李际军, 沈国敏, 王伟良, 范建华, 魏鸿刚, 黄建科 申请人:上海泽元海洋生物技术有限公司, 华东理工大学