专利名称：转染颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及将核酸传送至高级真核生物细胞内的领域，特别用于基因疗法。本发明提供新的转染颗粒，用于在体外和在体内转染高级真核细胞。
背景技术：
现代核酸重组技术的关键步骤是使用外来的基因物质在体外和在体内有效地转染细胞。
通常，使用重组体病毒，以在体外和在体内将外来的基因物质有效地输入细胞中(Mulligan，1993)。重组体病毒经常是有优点或缺点的特殊细胞，这取决于个体实验。除了外来物质，它们也携带其自身的基因物质，并且在复制的过程中非常容易突变。在有免疫系统的生物体中，体内病毒的另一个缺点是病毒颗粒例如衣壳抗原可能会引起不希望的免疫反应。最后但并不是最不重要的是，即使是现在，制备用于基因转移的重组体病毒仍然是一项昂贵而艰巨的工作。
也可以得到用于转染细胞的无病毒核苷酸颗粒。出于这个目的，使用阳离子聚合物(Tang and Szoka，1997)或阳离子脂质(Labatmoleur et al_1996)的反离子凝聚的核酸分子的复合物进行基因转移。这些聚合物和脂质所凝聚的核酸分子对于在培养物中转染细胞是有效的。由于这些反离子凝聚的核苷酸一般会导致多分子和多分散聚集体，因此它们很难在组织中分散或逃出血管。
阳离子去污剂也能使DNA凝聚成为分散的颗粒(Behr，1986)，有趣的是，该颗粒可能只由一个核酸分子组成(Melnikov et al_1995)。但是，去污剂在水中的溶解度远大于脂质的溶解度，并且它们很快地释放到环境中，导致DNA解凝聚和与去污剂相关的细胞毒性。结果，这种两亲物本身不能转染细胞(Behr，1993)。
由于基因传送在现代生物学和医学研究和治疗例如基因疗法中的重要性，对于能够有效用于体外和体内的稳定、廉价和方便的转染系统的需求正在增长。
发明概述本发明的一个目的是提供一种新的转染系统，用于将核酸传送至高级真核生物细胞中，该系统避免了现有技术中阳离子转染系统的缺点。
本发明提供利用核酸分子在体外和体内转染高级真核生物细胞的颗粒，该颗粒包括一个或多个被有机阳离子分子凝聚的核酸分子，所述颗粒是通过用相同或不同的有机阳离子前体分子复合该核酸分子，但不交联核酸分子，并在核酸模板上使前体分子相互以共价键合而得到的。
由于使用阳离子前体小分子代替了阳离子大分子，本发明的颗粒基本上不含核酸聚集体。另外，通过由前体分子共价键合形成的二聚或低聚阳离子分子使得该颗粒稳定。
以下，为了简便起见，除非另有说明，术语DNA用来表示DNA和RNA。
为了使DNA能够在细胞中获得到其所希望的的生物效应，该颗粒的稳定性应当是可逆的。出于这个目的，在本发明的优选实施方案中，在该颗粒进入细胞后所面临的情况下，阳离子分子间的键合是可逆的。该键合的断裂可以由弱酸性环境和／或还原条件和／或细胞区室例如核内体的酶催化机理所引发。
凝聚DNA的阳离子分子由阳离子前体分子的共价键合而得到。
本发明所定义的阳离子前体分子是用于制备能保持DNA凝聚的阳离子分子的构件。
本发明一般需要一个或多个至少具有双官能团的前体分子，一方面该分子是阳离子，以便基本上使核酸分子复合而不使其聚集或交联，另一方面该分子能够与该颗粒结构中的相同的或不同的阳离子前体分子以共价键连接，使得该颗粒稳定。
为了使新的转染颗粒稳定而与相同或不同的阳离子前体分子以共价键连接的官能团其特征在于它可以是不同的互补官能团或相同的官能团。一种相同的官能团的例子是硫醇，它能在相同或不同的前体阳离子分子之间提供二硫键。根据键合在单个阳离子前体分子上的官能团的数目，该阳离子分子可以是不同或相同前体分子的二聚体或低聚体。因此，本发明也涉及转染颗粒，其特征在于阳离子分子由二聚或低聚的相同和／或不同的阳离子前体分子制备。
凝聚核酸分子的阳离子官能团一般是碱性官能团，在生理条件下获得一个额外的氢，并因此带正电。这种阳离子官能团的一个例子是氨基官能团或其衍生物。或者，该阳离子官能团是不需要质子的季铵。
在本发明的优选实施方案中，该前体分子是能够满足上述要求的阳离子去污剂分子。
在这个优选实施方案中，本发明以超分子化学基础为根据，并利用了过去病毒形成稳定转染颗粒的两种类型DNA传送剂(一方面是阳离子表面活性剂，另一方面是阳离子脂质)基本特征的优点。举例说明该优选实施方案，
图1示意性的表示了本发明的原理用适当设计的阳离子去污剂将阴离子DNA分子分别凝聚，通过化学方法，经过空气诱导的二聚反应，把模板DNA上的去污剂(所述阳离子前体分子)转化成为脂质，从而使凝聚所得到的中性颗粒被“冷冻”。
本发明的去污剂分子包括一个阳离子极性部分，一个非极性部分和一个用于与其它去污剂分子键合的反应性官能团。当两个或多个去污剂分子相互键合时，初始前体分子的去污剂特征减少了，它们因此被定义为脂质，因为它们的亲油性特征和结构都和脂质相似。此时应当提醒读者，向核酸分子中加入普通的脂质而制成的转染颗粒会形成大的多分子和多分散聚集体(Labatmoleur et al_1996)，这不是本发明要求保护的部分。
另一方面，本发明涉及转染颗粒，其中阳离子分子是在核酸分子存在的情况下，由与一个或多个相同或不同的去污剂分子键合的去污剂分子制成的脂质分子。
在优选实施方案中，本发明涉及转染颗粒，其中阳离子分子是由去污剂分子二聚或低聚制成的。显然，该去污剂的结构可以相同或不同。
一般地，作为阳离子前体分子使用的阳离子去污剂分子，其特征在于它们具有不同的官能团特征。
另一方面，本发明的转染颗粒的特征在于，该阳离子去污剂分子包括a)至少一个用于与一个或多个其它去污剂分子键合的官能团，b)至少一个亲油性基团，c)一个无毒的受体主链d)用于与DNA键合的阳离子基团用于与前体分子键合的官能团是例如但不限于，能够反应以提供二硫键(-S-S-)的硫醇基，提供腙基(-C=N-N-)的酰肼和醛，提供席夫碱(亚胺，-C=N-)的胺和醛，和与被适当取代的乙烯基(例如氯化物)反应以提供烯胺(-C=C-N-)的胺。
在这方面，优选转染颗粒的特征为，用于与其它去污剂分子键合的阳离子去污剂分子的官能团选自可二聚或可聚合的官能团，例如硫醇，酰肼，醛，胺和被适当取代以提供烯胺的乙烯基。
优选地，转染颗粒的特征在于，去污剂分子的亲油性基团选自亲油性酰胺，酯或醚。当使用去污剂作为前体分子时，阳离子分子的亲油性官能团很关键，因为该亲油性基团决定适于以所希望的浓度提供分散颗粒的该去污剂前体的临界胶束浓度。所希望的DNA浓度越高，去污剂的c．m．c必须越高。
用于与核酸分子键合的阳离子分子特别是去污剂分子的优选官能团是胺或其它碱及其阳离子衍生物。以下将进一步讨论合适的胺和衍生物。
优选的本发明的转染颗粒的特征在于，用于与核酸分子键合的官能团选自胺或其衍生物。
适用于本发明的氨基官能团取决于它们提供正电荷以通过与电荷有关的离子间力与核酸分子可逆键合的能力。胺和衍生物在生理条件下被充正电的能力取决于胺结构的接近程度。具有近距离的和强的吸电子取代基的一些结构可能会因此在生理条件下不具有足够的碱性。优选的本发明的阳离子分子的氨基官能团是强碱性的。一种强碱性并在生理上可接受的氨基官能团是胍，它对于本发明的阳离子分子尤其有用。另一个合适的氨基官能团的例子是脒。这两个官能团与磷酸二酯基团具有强烈的相互作用。
优选的本发明的转染颗粒的特征在于，与核酸分子键合的官能团是胍。
对于本发明的去污剂分子受体主链的要求是便于制备并且对细胞无毒。
在优选实施方案中，本发明涉及转染颗粒，其中阳离子前体分子对应于通式Ⅰ
其中，R1表示(C1-C10-亚烷基)-SH，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基；R2表示-NR4R5，-NHR4R5+，-N(R4)2R5+，-C(=NR4)NR5R6，-C(=X)-C1-C10-亚烷基，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基，并可被至多4个二烷基氨基或一个硫代单糖所取代；R3表示直链或支链的并可任选被最好是一个或多个卤原子或二烷基氨基所取代的C5-C30-烷基，或者表示直链或支链的至多有10个C=C双键，并可任选被最好是一个或多个卤原子或二烷基氨基所取代的C5-C30-烯基，或者表示直链或支链的至多有10个C≡C双键，并可任选被最好是一个或多个卤原子或二烷基氨基所取代的C5-C30-炔基，或者表示可任选被取代的C6-C10-芳基，或者表示C7-C16-芳烷基，可任选被取代，或者表示C5-C30-烷基链，该烷基链被至多10个氨基-NR4-所间断，并可任选含有一个任选被氨基酸所取代的氨基；R4，R5和R6分别独立地表示氢或C1-C4-烷基；X表示O或S；Y表示C=O或C=S和Z表示O，S或-NR4-。
在一个更优选的实施例中，本发明涉及一种转染颗粒，其特征在于所述阳离子前体分子对应于通式Ⅰ，其中R1表示(C1-C6-亚烷基)-SH，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基；R2表示-NR4R5，-NHR4R5+，-N(R4)2R5+，-C(=NR4)NR5R6，-C(=X)-C1-C4-亚烷基，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基，并被至多4个氨基-NR4R5或一个单糖所取代；R3表示直链或支链的并可任选被最好是F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C5-C20-烷基，或者表示直链或支链的至多含有5个C=C双键，并可任选被最好是F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C5-C20-烯基，或者表示直链或支链的至多含有5个C≡C双键，并可任选被最好是F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C5-C20-炔基，或者表示可任选被最好是C1-C4-烷基，F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C6-C10-芳基，或者表示可任选被最好是C1-C4-烷基，F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C7-C14-芳烷基，或者表示C5-C20-烷基链，该烷基链被至多10个氨基-NR4-所间断，并任选含有一个可任选被氨基酸所取代的氨基；R4，R5和R6分别独立地表示氢或C1-C4-烷基；X表示O或S；Y表示C=O或C=S，和Z表示O，S或-NR4-。
在一个更加优选的实施方案中，本发明涉及一种转染颗粒，其中根据上述通式结构的阳离子前体分子被取代如下R1表示(C1-C3-亚烷基)-SH，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基；R2表示-NR4R5，-NHR4R5+，-N(R4)2R5+，-C(=NR4)NR5R6，-C(=X)-C1-C4-烷基，其中烷基可以是直链或支链的烃基，并可被至多4个氨基-NR4R5或一个C6-单糖所取代；R3表示直链或支链的并任选被最好是F，Cl，Br或-NH2所取代的C5-C12-烷基，或者表示C5-C15-烷基链，该烷基链被至多7个氨基-NR4-所间断，并任选含有一个任选被氨基酸半胱氨酸所取代的氨基；R4，R5和R6分别独立的表示氢或甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基或叔丁基；X表示O或S；Y表示C=O或C=S和Z表示O，S或-NR4-。
在一个最优选的实施方案中，本发明涉及转染颗粒，其中根据上述通式的阳离子前体分子被取代如下R1表示-CH2-SH；R2表示-NH2，-NH3+，-C(=NH+2)NH2，直链或支链，并可任选被F，Cl，Br或-NH2所取代的-C(=O)-C1-C4-烷基，或是一个鸟氨酸基或一个S-半乳糖基；
R3表示直链或支链的并可任选被最好是F，Cl，Br或-NH2所取代的C6-C15-烷基；Y表示C=O；Z表示O或-NH-。
优选的转染颗粒中R1是C1-C4-亚烷基-SH。更优选的转染颗粒中R1是亚甲基硫醇。
优选的转染颗粒中R2是胺。更优选的转染颗粒中R2是胍。还更优选的转染颗粒中R2是鸟氨酸。
优选的转染颗粒中R3是癸基。
优选的转染颗粒中Y是羰基。
还更优选的转染颗粒中Z是胺。
最优选的是其中R1是亚甲基硫醇，R2是胍，R3是癸烷，Y是羰基，Z是胺的转染颗粒及其可药用的盐。
特别优选的是其中所述阳离子分子是N-癸基-2-胍盐-半胱氨酸的转染颗粒。
还最优选其R1是亚甲基硫醇，R2是鸟氨酸，R3是直链癸基，Y是羰基，Z是胺的转染颗粒及其可药用的盐。
也特别优选其中所述阳离子分子是N-癸基-2-鸟氨酸基-半胱氨酸的转染颗粒。
C1-C6-烷基一般代表直链或支链的有1-6个碳原子的烃基，该烃基可任选地被一个或几个彼此相同或不相同的卤素原子-优选是氟所取代。以下的基团可以作为例子记述甲基，乙基，丙基，1-甲基乙基(异丙基)，丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，正戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基。
相同的限定也适用于烷二基。
C5-C30-烷基具体代表有5-30个碳原子的直链或支链烃基，例如戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，二十二烷基(dodecadecyl)，十九烷基，二十烷基，二十一烷基，二十二烷基和三十烷基。
除非另有说明，优选含有1-5个碳原子的低级烷基，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，正戊基或异戊基。相同的限定也适用于烷二基基。
烯基一般代表直链或支链的含有3-20个碳原子和一个或多个双键，优选有一个双键的烃基，该烃基可任选被一个或几个彼此相同或不相同的卤素原子-优选氟所取代。例子包括2-丙烯基(烯丙基)，2-丁烯基，3-丁烯基，1-甲基-2-丙烯基，2-甲基-2-丙烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-2-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-甲基-3-丁烯基，2-甲基-3-丁烯基，3-甲基-3-丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，2-乙基-2-丁烯基，2-乙基-3-丁烯基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基。
炔基一般代表直链或支链的含有3-20个碳原子并有一个或多个三键，或者有一个或多个三键及双键的烃基。
2-丙炔基(炔丙基)，2-丁炔基，3-丁炔基，1-甲基-2-丙炔基，2-戊炔基，3-戊炔基，4-戊炔基，1-甲基-2-丁炔基，1-甲基-3-丁炔基，2-甲基-3-丁炔基，1，1-二甲基-2-丙炔基，1-乙基-2-丙炔基，2-己炔基，3-己炔基，4-己炔基，5-己炔基，1-甲基-2-戊炔基，4-甲基-2-戊炔基，1-甲基-3-戊炔基，2-甲基-3-戊炔基，1-甲基-4-戊炔基，3-甲基-4-戊炔基，1，1-二甲基-2-丁炔基，1，1-二甲基-3-丁炔基，1，2-二甲基-3-丁炔基，1，3-二甲基-2-丁炔基，1，3-二甲基-3-丁炔基，2，2-二甲基-3-丁炔基，2，3-二甲基-2-丁炔基，2，3-二甲基-3-丁炔基，1-乙基-2-丁炔基，1-乙基-3-丁炔基，2-乙基-3-丁炔基和1-乙基-1-甲基-2-丙炔基。
在本发明中单糖代表C5-和并优选是C6-的单糖，可选自例如以下基团半乳糖，乳糖，葡萄糖，阿拉伯糖，果糖，山梨糖，木糖，核糖，甘露糖，每一种可以是其D-或L-形式。
芳基一般代表含有6-10个碳原子的芳香基团——也可以是组合形式，其芳环可以被一个或多个可以相同或不同的低级烷基，烷氧基，硝基，氨基和／或一个或多个可以相同或不相同的卤素所取代。除非另有说明，优选的芳基是苯基。
芳烷基一般代表与亚烷基相连的含有7-14个碳原子的芳基，其芳环可以被一个或多个可以相同或不相同的低级烷基，烷氧基，硝基，氨基和／或一个或多个可以相同或不同的卤素所取代。优选芳烷基的脂肪族部分含有1-6个碳原子而芳香族部分含有6-10个碳原子。除非另有说明，优选的芳烷基是苯甲基，苯乙基和苯丙基。
烷氧基一般代表O-烷基，其中烷基定义如上。优选的烷氧基含有如上定义的低级烷基。
烷基或二烷基氨基代表被一个或者两个相同或不同的烷基取代的氨基。优选的烷基或二烷基氨基取代基是含有一个或多个低级烷基的氨基。
在本发明的另一个实施方案中，有机阳离子前体分子没有亲油基。这种类型的合适的分子可以与DNA分子键联而不交联或聚集。为了满足这个要求，它们必须足够小，以仅附着在单个DNA分子上，而不是与一个或多个其它DNA分子键联。另外，该阳离子分子含有使它们与相同或不同的阳离子前体分子以共价键相连的功能团。对于该功能团的要求和对去污剂前体分子的描述相同。可以通过如下方法测试阳离子分子对于本发明的适合性使阳离子分子与DNA相接触，在共价键键联之前和之后对所得到的复合物的颗粒尺寸进行物理检测，例如使用电子显微镜，激光散射或原子力显微镜(atomic force microscopy)。合适的阳离子分子在键联之前和之后不形成聚集体；在另一方面，它们必须在键联之后形成颗粒，也任选在键联之前也形成颗粒。
阳离子非亲油前体分子可选自其骨架上含有带正电基团的分子。该骨架不是关键，它可以是任何在主链或在侧链带正电的有机分子。举例来讲，该骨架是肽，正电荷由正电的氨基酸，例如赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸提供。合适的带正电荷基团可以和上述对于去污剂分子的定义相同。如果能够满足上述要求，该有机阳离子前体分子可以是在WO93／07283中所披露的用于复合DNA的分子。
用于共价键连接的官能团可以由该骨架本身提供，例如，如果该分子是肽并有半胱氨酸基，或者可以通过将它们键联在骨架上而获得。
烷基或二烷基氨基代表被一个或者两个彼此相同或不同的烷基取代的氨基。优选的烷基或二烷基氨基取代基是含有一个或多个低级烷基的氨基。
在一个优选实施方案中，转染颗粒的特征在于该阳离子前体分子是胺或多胺。
在一个特别优选的实施方案中，转染颗粒的特征在于该阳离子前体分子是精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺(SC2)。
上述精胺衍生物满足了实施本发明的所有必要的要求。伯胺和仲胺在生理条件下提供阳离子官能团，并且两个硫醇基团可以使DNA发生二聚或齐聚而不会使它交联或聚集。
该阳离子前体分子精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺(SC2)可以由市场上可购买的试剂制备。在本发明的实验中，测定了用SC2制备的转染颗粒的生物物理参数，与用精胺制备的转染颗粒相反，这些颗粒是稳定的。
该SC2分子由一个精胺分子通过酰胺键与具有两个游离的硫醇官能团的两个半胱氨酸分子相键联而形成。这两个分子的选择是相当关键的。精胺和其它多胺，例如腐胺，亚精胺，与以凝聚形式保持病毒DNA相关联。各种体外研究表明，多胺紧密结合DNA，并且在最佳条件下，精胺能够把DNA凝聚成为直径0．1μm的螺旋结构。尽管这些螺旋结构长时间相对稳定，仍然对介质的盐水浓度敏感。实际上，在150mM的NaCl浓度(细胞培养基的离子强度)下，精胺从DNA中解复合，这导致了螺旋结构的损失。因此，与精胺复合的DNA颗粒不能用作转染。为了稳定该DNA复合物的的结构，在精胺的两端分别接枝两个有游离硫醇官能团的基团。在一定的优化条件下，处于作为模版的DNA小沟中的SC2分子将会通过二硫键彼此相连，由此提供了一个能稳定螺旋结构的DNA骨架。
本发明决不会限制在一种类型的转染颗粒中的阳离子前体分子。该转染颗粒可以由两个或多个不同的阳离子前体分子共价键合而制备。很明显，对于欲和不同的阳离子前体分子键合的阳离子前体分子来讲，它们必须是互补的，并因此其官能团与其它的反应组分不相同。本发明的阳离子前体分子除了键合其它阳离子前体分子的官能团多样性以外也可以具有结构多样性。对于具体应用，本领域的专家可以发现，通过结合结构上不同的阳离子前体分子设计转染颗粒以满足具体的需求。
转染颗粒必须在到达其目标，例如靶细胞或组织所需的时间内是稳定的。在目标位置，例如在靶细胞内，当然必需使得该转染颗粒的核酸能够到达该细胞。
细胞的外来物质一般通过细胞吞噬作用而被吸取，并通过一系列的隔室，特别是核内体。在核内体中，外来物质面临例如pH为6的更酸性的环境和大量的酶，特别是水解酶。本发明的转染颗粒能够被细胞吸取，并因此被转移至核内体的隔室中。在细胞内隔室中，本发明的转染颗粒面临着能导致它们解聚的条件，特别是被二聚或低聚的阳离子分子裂解的条件，由此释放出用于解聚的核酸。典型的的阳离子分子的断裂是由二硫键的还原而导致的；酸不稳定键合的例子是腙，席夫碱(亚胺)，烯胺，缩醛或缩酮官能团。应当指出的是本发明决不限于以上对于核内体裂解所提到的键，本领域的专家知晓满足对于阳离子分子的要求并在核内体内或其它细胞内隔室内是可裂解的其它键。
因此，在本发明的优选实施方案中，所述转染颗粒的特征在于阳离子分子之间键在细胞内隔室的条件下是可以降解的。
该新型转染颗粒对于使用核酸分子在体内和体外转染细胞是有用的。该新型转染颗粒对于在体内和体外转染高级真核生物细胞尤其有用。
为了有效地传送核酸分子，希望提供特定的在细胞内定向的官能团。这对于在体内使用把基因导入特定的细胞、组织或器官内是十分重要的。一旦转染颗粒与目标细胞相结合后，由于细胞内吞摄取颗粒进入细胞的作用增强了，转染效率可以进一步提高。
因此，本发明的另一方面涉及转染颗粒，其特征在于它们还携带一个或多个用于特定细胞定向和／或便于细胞内吞作用的官能团。
通过在细胞表面上与细胞结构键联的配位体和／或键联结构的引发内化作用，可以实现对转染颗粒的有效细胞摄取。
细胞定向官能团例如是蛋白质配位体或糖基。配位体的例子是免疫球蛋白及其片断或其衍生物，凝集素，粘着分子，细胞因子或趋化因子(chemokines)，和能辨认特定分子表面结构并能精确定向和／或内化的小的有机结构，例如糖基。公认的定向官能团的例子是铁传递蛋白，叶酸，RGD肽，以及大量的单克隆或多克隆抗体。任何能够与靶细胞相结合并内化所述颗粒进入细胞的配位体都可以使用，可用于本发明的适合配位体的例子已在WO93／07283中给出。
因此，在优选实施方案中，本发明涉及的转染颗粒的特征在于定向和／或内吞官能团是细胞的蛋白质配位体。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及转染颗粒，其中定向和／或内吞官能团是糖基。
除了定向配位体外，本发明的颗粒还可以含有能使它们通过膜融合，分裂或成孔的方式穿过细胞膜的官能团(以下，这种官能团被称为核内体溶解官能团)。在阳离子前体分子是去污剂的情况下，它们自身具有膜不稳定／核内体溶解官能团。如果该共价键合是生物可逆的，并因此在细胞的环境中断裂，该去污剂分子可以行使核内体溶解功能。除了该去污剂的膜不稳定作用外，该作用能还可以由核内体溶解剂提供。可用于本发明的适合核内体溶解剂的例子已在WO93／07283中披露。优选的核内体溶解剂的例子是钝化的腺病毒颗粒，膜活性肽(即基因融合肽或溶解肽，它们的例子已经在WO93／07283中公开，并被Plank等人，(1994)，Mechtler和Wagner(1997)，Gottschalk等人_(1996)所公开；DNA键联的膜活性肽被Wyman等人_(1997)公开；两亲阳离子肽短杆菌肽被Legendre和Szoka(1993)以及Legendre和Supersaxo(1995)所公开)和pH敏感的表面活性剂例如N-烷基-咪唑，被Wilson等人，(1987)，Hugnes等人，(1996)和本说明书中的参考文献所公开。
本发明的转染颗粒的定向和／或核内体溶解官能团可以以共价键与本发明的几个，许多的或所有的阳离子分子相键合，并可以是一个转染颗粒中的相同或不同的定向官能团。定向／核内体溶解官能团存在的类型或数量取决于特定的应用，尤其是取决于要达到的细胞的类型，并可以根据实际的需要进行调整。一般的，带有这种官能团的阳离子分子的百分含量可以为约1-80％，优选约为10-50％。
带有能够与本发明的阳离子分子的前体分子以共价键相键联的定向官能团的前体分子的例子是亲油的半乳糖半胱氨酸(Remy等，1995)(见实施例5)。尽管该亲油的半乳糖半胱氨酸其自身不具有复合核酸分子所需的官能度，但是它能够与阳离子前体分子以共价键相键联来提供作为本发明转染颗粒一部分的阳离子分子(杂二聚物)。已经知道半乳糖基是可被肝细胞识别的特别的定向官能团。
定向／核内体溶解官能团也可以以共轭的形式存在，其中它连接在除了可低聚的前体分子以外而存在的DNA键联分子上。该分子可以是低聚阳离子例如低聚赖氨酸，或者是聚合物例如没有可二聚官能团的聚氮丙啶。这些定向／核内体溶解官能团共轭体可以在复合物形成之前或之中被添加至转染颗粒的其它复合配对物中。
可以通过如下方法把配位体／核内体溶解官能团引入转染颗粒中a)在复合物形成之前或期间提供具有定向／核内体溶解官能团的阳离子前体分子和／或不能低聚的小DNA键合分子；b)在前体分子共价键合之前或期间，在复合物形成之后，将定向／核内体溶解官能团连接到阳离子前体分子和／或不能低聚的小DNA键合分子上；c)在前体分子共价键合之后，连接定向／核内体溶解官能团。
在b)和c)的情况下，前体分子或不能低聚的分子已经有能够与定向／核内体溶解官能团键合的反应性基团。反应性基团是指化学上活性的基团，例如活化的酯，二硫化物，或者允许生化相互作用例如抗生蛋白链菌素／生物素键合(在这种情况下，该分子具有用于反应的抗生蛋白链菌素或生物素)的基团。选择的反应性基团必须不能干扰前体分子的共价键合过程。
实施方案a)的优点在于该带有定向／核内体溶解官能团的分子可以事先大量地以其纯净物制备，并且作为意义明确的试剂易于得到。当希望在转染颗粒中有核内体溶解官能团时，该实施例特别用于该核内体溶解官能团。
实施方案b)和c)优选用于大配位体，例如蛋白质定向配位体，或核内体溶解剂例如腺病毒，因为这些配位体／试剂可妨碍DNA复合物凝聚成为小颗粒。这些实施例的一个优点在于它们确保官能团位于颗粒的表面。如果该配位体对前体分子凝聚和／或共价键合所采用的条件敏感，实施方案c)的还具有额外的优点。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种其定向官能团由糖基提供的转染颗粒。
在优选实施方案中，该糖是半乳糖。
在另一个优选实施方案中，该糖是甘露糖。
在另一个实施方案中，该核内体溶解官能团由基因融合肽提供。
专家可以采用把具有定向／核内体溶解官能团例如小有机分子如糖，或者更大的结构如蛋白质或全病毒的试剂连接至阳离子分子的方法。
化学方法的键合可以按照已经公知的用于肽偶合的方法进行，并且如果需要的话，可以在偶合反应进行之前向各个组分提供交联物质(如果没有适合于偶合反应的可用的官能团例如巯基或醇基，这种措施是必要的)。交联物质是双官能团化合物，它可以首先与各个组分的官能团反应，然后该改性的各个组分被偶合。
偶合可以通过如下办法进行a)二硫键，它在还原条件下可以再一次裂解(例如当使用琥珀酰亚胺-吡啶基二硫丙酸酯时)；b)在生物条件下基本稳定的化合物(例如通过顺丁烯二酰亚胺与同第二组分键联的交联剂的巯基反应得到的硫醚)；c)在生物条件下不稳定的键，例如在弱酸条件下不稳定的酯键，或者缩醛或缩酮键；d)活性基团例如异硫代氰酸酯，活化酯；e)醛与氨基的反应性偶合。
在优选实施例中，转染颗粒的核酸是DNA。
该DNA可以是线形或环形的，单股或双股的。至于DNA的尺寸，本发明允许有一个从含有大约20核苷酸的小低聚核苷酸到例如大约ca．100至2000kb的人造染色体的非常宽的范围。
在优选实施方案中，该颗粒相对于DNA是单分子，这意味着它们含有单个DNA分子。当希望使用小颗粒以克服生理障碍的尺寸限制时，该实施方案特别适用于在体内传送DNA。
另外，单分子的分散稳定颗粒的存在有利于在体内和体外传送DNA大分子，因为这种颗粒与大聚集体相比更容易被细胞摄取。
但是该颗粒可以含有一个以上的DNA分子，特别是在使用小的DNA分子例如寡核苷酸的时候。
本发明的颗粒结构一般是球形的，直径在约25nm(在质粒DNA的情况下)至几百nm之间变化。已经发现所形成的颗粒的体积直接与DNA的长度成比例。这明显暗示DNA分子的凝聚是单分子的。
另一方面，本发明包括使用阳离子分子和／或阳离子前体分子制备新型核苷酸转染颗粒。
另一方面，本发明包括一种制备转染颗粒的方法，其特征在于在适当的缓冲液中向核酸分子中加入阳离子前体分子，使与核酸形成复合物，并在核酸模板上与相同或不同的阳离子前体分子共价键合。
在该方法的第一步骤中，把含有一种DNA分子或不同分子在缓冲液中的混合物的DNA溶液与前体分子的溶液相混合，任选与不同的前体分子溶液混合。
根据具体应用，从最终转染配方中所需的DNA浓度以及根据特定应用所给定的正负电荷的比例开始，可以确定前体分子的量和物理性质(溶解度，c．m．c等)。具体应用可以由给药途径确定，例如全身性途径或静脉内途径，对于它们来讲，转染颗粒不能带正电，以避免与血液组分之间发生不需要的反应，或者由被作为目标的细胞确定，它需要考虑键合带电颗粒的特异性优先顺序。对于选择合适的去污剂作为前体分子来讲，它的临界胶束浓度(c．m．c)是重要的，给定去污剂的临界胶束浓度是已知的或可由Langmuir平衡来确定。对于本发明，如果该去污剂的浓度低于c．m．c，可以得到最佳结果。
在能够形成复合物的条件下培养组分；一般在室温下在短时间内即在几分钟至几小时之内可形成复合物。在把复合配对物混合之后，取决于复合物形成的速度，前体分子可能在混合之后立刻共价键合，或在所需的更长的时间之后其价键合。依赖于能够键合的反应性基团，当与DNA键联时，在与前体分子接触时可自动发生键合。或者，键合可能需要用其它试剂例如氧气调节。该条件必须不影响DNA分子，因此优选在本发明中使用的大多数前体分子仅仅可以被空气二聚或低聚。反应步骤的合适的反应条件和时间可以通过常规实验来确定，在实验中，变化参数，监测(中间)反应产物(复合物和致密颗粒)的物理特性，例如通过激光散射测量颗粒尺寸。
在有定向／核内体溶解官能团存在或者在前体分子或者其它不可二聚的阳离子分子上有定向／核内体溶解官能团的情况下，例如为了形成复合物而进行的培养期间或者为了阳离子分子改性而引入附加步骤时，可采用该方法。
用于制备该新型转染颗粒的合适的缓冲液是形成复合物的任何缓冲液，和／或与各个阳离子前体分子间共价键合的条件以及连接可任选的定向／核内体溶解官能团的条件相适合的任何缓冲液。其它参数例如最佳pH值、培养时间、温度，以及核酸的浓度，和阳离子前体分子浓度，和可任选地定向和／或内吞分子的浓度，都取决于各单独的实施方案。可以通过常规的系列实验对这些参数进行优化，而无需增加任何专家过度的负担，因为这些参数受例如水溶液系统以及不改变核酸分子的适度条件的限制。另外实施例中描述的这些参数可以容易地改变。例如，在含有癸烷亲水基团和提供二硫键的胍阳离子官能团的核酸分子存在的情况下，氧化半胱氨酸前体分子的合适的参数是15mM pH8．4的TrisHCl的储备缓冲溶液，通过三次真空／氧气气氛的循环而用氧饱和，在加入60μm(最终浓度)质粒DNA前加入90μM(最终浓度)阳离子前体分子。
本发明的新型转染颗粒的优选用途是在治疗上用于在体内把核酸分子传送至哺乳动物细胞内。
在这种情况下，该核酸分子具有医疗活性，例如编码医疗活性的蛋白质的反义低聚核苷酸或质粒。就DNA的序列而言，不存在限制，任何对医疗例如体基因疗法或免疫疗法有用的序列，都可以使用。非限制性的例子已经在WO93／07283中给出。
因此，本发明另一方面涉及用于基因传送的药物组合物，包括含有医疗有效量的核酸的转染颗粒。
这种药物组合物可以包括在给药之前新制备的转染颗粒，或者是以冷却液形式，冷冻形式或真空冷冻干燥物保存的成品刮剂，并且其中还可以含有其他添加剂例如稳定剂，冷冻保护剂等。合适的添加剂是本领域公知的；参考Remington’s Pharmaceutical Sciences，1980，药用组合物的配制方法。在本发明的实验中，已经证明含有本发明的转染颗粒的组合物可有效的用于皮内基因传送。
在优选实施方案中，该药用组合物用于皮内应用。
除体内DNA传送外，本发明的颗粒对于将DNA大分子例如人造染色体引入哺乳动物细胞内特别有用，这对于稳定的长期基因表达是重要的。
对于体内和体外转染来讲，用于制备含有所需核酸分子的转染颗粒的试剂盒可以提供极大的便利。这样的试剂盒可以包括，例如一种或多种阳离子前体分子，可以使用其不同组合以使其性能最佳；一个或多个用于细胞特异性定向／核内体溶解功能的分子；合适的缓冲剂；和其它用于制备，提纯或者在体内或体外使用该新型转染颗粒的试剂或机械设备。
以下，以阳离子前体分子N-癸基-2-胍盐-半胱氨酸为例说明本发明。
该去污剂分子是重新设计的(实施例1)。由于对于温和化学的优先和使用类似内源性化合物，所以选择硫醇作为可二聚的官能团，选择半胱氨酸作为构筑多官能度分子的无毒受体骨架。可以预料，一旦进入核内体隔室内，亲油的半胱氨酸酯或酰胺载体将被酶催化裂解成半胱氨酸和脂肪醇或胺，伴随着DNA的解凝聚和可能的核内体溶解。
只有在去污剂浓度低于临界胶束浓度(c．m．c)时，纯净的单分子DNA才可能折卷。通过DMAP催化的二环己基碳二亚胺(DCC)的脱水反应，合成了半胱氨酸的几种正烷基酯，其c．m．c由langmuir平衡确定(20mM MES缓冲液，pH为6)，得到如下结果(正烷基链长度／c．m．c)十二烷／15μM；十一烷／80μM；癸烷／320μM；辛烷／＞2000μM。用于基因传送实验的质粒的一般工作浓度在50μM的范围之内，癸烷链是一种安全的选择。半胱氨酸酯伯胺官能团的弱碱性(pKa=6．8)不足以同时进行DNA键合(它需要质子化的去污剂)，以及在弱碱性介质中达到合理的硫醇氧化速度。因此，胺官能团转换成为高碱性的胍，已知这种高碱性的胍与DNA(C10CG+，图2)发生强烈的相互作用。
希望氧化性去污剂的二聚倾向于DNA的模板效应(图1)。快速的内复合反应是形成小而稳定的颗粒的关键方面，因为在DNA键合之前，广泛的去污剂二聚化成为脂质将把体系带回到经典的阳离子脂质／DNA复合物形成／聚集过程。在DNA存在的情况下，的确观察到空气氧化速度的提高(图3)。
低于c．m．c时，主要的吸引力是阴离子DNA对分离的阳离子两亲分子的吸引力。因此，在氧化之前，即使去污剂略微过量，复合物也应接近成为电中性。因此，把质粒DNA(60μM，在15mMpH为8．4的TrisHCl中)与C10CG+混合(至90μM)，并在有氧条件下放置24小时。在该瞬时复合物形成步骤中，DNA在260nm附近的典型紫外吸收光谱提高了15％；在氧化反应中没有发现其它变化(校正了二硫键的吸收之后)和浑浊现象。复合物的CD光谱是典型的B-DNA光谱，排除了在复合物中存在液晶Y-DNA相的可能性。在24小时之内，它仍然不随时间变化。但是在与生理相关的离子浓度条件下进行最严谨的稳定性实验时，其中已知有阳离子脂质／DNA复合物聚集3，9。值得注意的是，(C10CG+)2／DNA复合物在150mM的NaCl中放置3天后其紫外光谱保持不变。因此，波谱学提供了形成小而稳定的两亲分子／DNA复合物的间接证据。
这些复合物的未过滤溶液的透射电子显微镜(TEM)观察显示出令人吃惊的含有少量较大结构的近似球形物体的均匀颗粒(图4a)(71％单体，n=109)。而且，该较大结构很清楚是二聚物(图4b，d)或偶尔是低聚物，它不象阳离子脂质do3那样倾向于融合到更紧密融合的聚集物中。逐步把去污剂浓度增加到C10CG+的c．m．c以上，由于随时间而变化的聚集(未显示数据)而逐渐导致不太明确的UV和TEM结果，这与以该概念为基础的假设相一致。在最高放大倍数(图4c)下测得的该颗粒的尺寸为23±4nm。当把5．5Kbp的质粒的体积与5500个脂质分子的体积相加时，使用典型的DNA和两亲分子尺寸进行的粗略估算得到直径为28nm的球体。因此TEM为单分子DNA的折卷提供了有力的证据。
在一系列实验中，采用电泳方法评价了复合物形成的可逆性以及复合的DNA的降解的稳定性(图5)。当C10CG+不能阻止DNA迁移时，除了在假定发生沉淀的地方浓度远远超过c．m．c(未显示)外，氧化的(C10CG+)2／DNA颗粒不会迁移，并在电泳过程中保持稳定(图5，带2)。但是阳离子脂质／DNA颗粒会被过量的十二烷基硫酸钠去污剂(SDS，带3)破坏或者脂质会被过量的还原二硫苏糖醇(DTT，带4)转换回为初始的C10CG+去污剂。存在于细胞培养基中的血清核酸酶迅速将超螺旋质粒DNA降解(带1和带8)降解为带有许多缺口的不清晰的成片电泳条带(带5)。但是该脂质／DNA颗粒在这种介质中是物理学上稳定的(带6)，并在很大程度上保护了核酸免于降解，因为该质粒基本上被转变为迁移更慢的环状松弛形式(在SDS处理之后显露，带7)。
使用由3倍过量去污剂形成的阳离子颗粒进行的最初实验导致在BNLCL 2鼠的肝细胞中报告基因表达，证实了复合物一旦进入细胞后，它的命运就是非病毒载体的命运。使用涂覆有聚阳离子共轭体或聚阳离子配位共轭体或含有灭活的腺病毒的颗粒的DNA复合物进行的进一步的实验证实了体外的表达。另外，也能够证实在复合物在皮内传送之后发生的体内基因表达。
附图的简要说明图1阳离子去污剂引发的质粒DNA的单分子折卷的示意2亲油的胍基-半胱氨酸酰胺去污剂的合成图3在模板DNA存在的情况下，半胱氨酸去污剂C10CG+氧化为胱氨酸脂质(C10CG+)2的速度更快图4(C10CG+)2阳离子脂质／DNA颗粒的未过滤溶液的透射电子显微镜照片图5(C10CG+)2／DNA复合物的物理和化学稳定性(琼脂糖凝胶电泳)图6用C10CG+凝聚纳米级DNA颗粒，其颗粒尺寸的测量A噬菌体λDNAB噬菌体T4DNACCMVLDNA图7A，B用C10CG+凝聚纳米级DNA颗粒，单分子DNA凝聚的证据图8亲油胍基半胱氨酸酰胺(C10CG+)／DNA复合物转染成为细胞系BNLCL．2图9半胱氨酸亲油醇酯去污剂的合成图10在有和没有DNA的情况下，半胱氨酸亲油醇酯去污剂的临界胶束浓度(c．m．c．)的测定。在有C8，C10，C11和C12的半胱氨酸时去污剂的c．m．c。
图11在有和没有DNA的情况下，半胱氨酸亲油醇酯去污剂的临界胶束浓度的测定。
A在有和没有DNA的情况下，C10半胱氨酸去污剂的c．m．c。
B在有和没有DNA的情况下，C11半胱氨酸去污剂的c．m．c。
图12在有和没有DNA的情况下，C10半胱氨酸去污剂的氧化图13亲油的醇胍基半胱氨酸酯去污剂的合成图14亲油的鸟氨酰基半胱氨酸酰胺去污剂的合成图15亲油的醇半乳糖基半胱氨酸酯去污剂的合成图16精胺-N1，N12-双半胱氨酸酰胺或精胺颗粒的紫外光谱图17琼脂糖凝胶电泳，与精胺或精胺-N1，N12-双半胱氨酸酰胺形成的颗粒的稳定性图18由(C10CG+)2／DNA复合物和不同量的PEI 25KDa之间的相互作用形成的颗粒尺寸的测量图19(C10CG+)2／PEI 25KDa-Gal4／DNA复合物尺寸的测量图20使用C10CG+／DNA／PEI 25KDa复合物转染SKOV3细胞图21使用C10CG+／DNA／PEI 25KDa和C10CG+／DNA／PEI 25KDa-Gal4复合物转染BNL CL．2细胞图22使用与蛋白质键合的聚阳离子涂覆(C10CG+)2／DNA复合物图23铁传递蛋白质-聚赖氨酸涂覆的(C10CG+)2／DNA颗粒的Z电位的测量图24K562细胞的转染铁传递蛋白质-聚赖氨酸对于(C10CG+)2／DNA复合物传送的影响图25B16F10细胞的转染铁传递蛋白质-聚赖氨酸对于(C10CG+)2／DNA复合物传送的影响图26B16F10细胞的转染灭活的腺病毒颗粒对于(C10CG+)2／DNA复合物传送的影响图27在体内(C10CG+)2／DNA复合物的皮内传送图28在体内(C10CG+)2／DNA复合物的皮内传送图29在体内C10CG+／pCMVL／MannITC-PEI(25KDa)复合物的皮内传送图30使用(C12CO)2／DNA复合物转染BNL CL．2细胞缩写Ac=CH3-C(O)DCC=二环己基碳化二亚胺DMAP=二甲基氨基吡啶DCU=二环己基脲
DDT=二硫苏糖醇DMEM=Dulbeccos改性的最低必要介质EDC=N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基-碳化二亚胺盐酸盐Et=C2H5Ether=二乙基醚HEPES=羟乙基哌嗪乙磺酸Me=甲基MES=吗啉代乙磺酸MS=质谱MES=PEI=聚氮丙啶(polyethylenimine)BocON=2-叔-丁氧羰基-氧亚胺基)-2-苯乙腈μMbp=计算得到的DNA微摩尔浓度／每个碱基对(MW=660)C10-CG+=亲油胍基半胱氨酸酰胺TA=Tris-乙酸盐THF=四氢呋喃TLC=薄层色谱实施例1b)亲油胍基-半胱氨酸酰胺去污剂的合成根据图2所示的路线合成该亲油化合物。
步骤1制备N-叔-丁氧基羰基-吡唑-1-甲脒 向碳酸二-叔丁基酯(7．43g，33mmol)的100ml二氯甲烷的溶液中加入11．3ml的N，N-二异丙基乙胺(66mmol)和4．40g的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(30mmol)。将该溶液在室温下搅拌3小时后使其蒸发干燥。将所得到的白色固体溶解在200ml的醋酸乙酯中，用5％(w／w)的碳酸氢钠洗涤有机相，用硫酸镁进行干燥，最后使其蒸发干燥。用沸腾的己烷溶解残余物。该溶液在室温下存放过夜，然后在4℃下保存24小时。用过滤回收得到的结晶，在冷己烷(0℃)中洗涤。干燥后，得到5．28g的白色结晶(25mmol，产率为84％)。
C9H14N4O2210．24g／molTLCRf(20％AcOEt／己烷)=0．3反相TLCRf(60％CH3CN／30％H2O／10％甲醇)=0．5NMR1H(CDCl3)；δppm1．56(s，9H，C(CH3)3)；6．41(dd，J1=3Hz，J2=1．5Hz，1H，CH-CH=CH)；7．50-7．70(brs，1H，=NH)；7．69(d，J=1．1Hz，1H，N=CH)；8．46(d，J=3Hz，1H，N-CH)；9．01-9．20(brs，1H，NHBoc)。(在这个和其它NMR谱中，指定为信号的氢原子用黑体印刷。)MS(FAB+)，m／z211．1[MH+]；155．0[MH+-叔丁基]。
步骤2制备N，N′-二-叔-丁氧基羰基-吡唑-1-甲脒 在0℃向氢化钠(1．60g，40mmol)的70ml四氢呋喃的悬浮溶液中加入2．10g的N-叔-丁氧基羰基-吡唑-1-甲脒(10mmol)。将该悬浮溶液在0℃强力搅拌1小时。然后加入4．5g的碳酸二-叔丁基酯(20mmol)，在室温下放置，然后逐渐加热至回流。回流一夜后，将反应介质冷却至0℃；加入2．3ml的醋酸，并将该溶液搅拌15分钟。用60ml 5％(w／w)的碳酸氢钠，60ml饱和NaCl溶液洗涤有机相，用硫酸镁进行干燥，然后使其蒸发干燥。用硅胶色谱(5-15％的醋酸乙酯／己烷的梯度溶液)提纯所得到的残余物，得到2．48g的白色固体(8．0mmol，产率为80％)。
C14H22N4O4310．36g／molTLCRf(20％AcOEt／己烷)=0，3反相TLCRf(60％CH3CN／30％H2O／10％MeOH)=0．4NMR1H(CDCl3)；δppm1．52(s，9H，C(CH3)3)；1．58(s，9H，C(CH3)3)；6．43-6．46(m，1H，CH-CH=CH)；7．64-7．66(m，1H，N=CH)；8．33(d，J=3Hz，1H，N-CH)；8．93(brs，1H，NHBoc)。
MS(FAB+)，m／z311．1[MH+]；255．0[MH+-叔丁基]；211．0[MH+-Boc]；199．0[MH+-2x叔丁基]；155．0[MH+-Boc-叔丁基]。
步骤3制备N，S-二-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-癸酰胺 向N，S-二-叔-丁氧基羰基半胱氨酸(1g；3．11mmol)的6ml二氯甲烷和200μl四氢呋喃溶液中加入430mg的N-羟基琥珀酰亚胺(3．73mmol)。将该反应混合物冷却至0℃，加入713mg N，N′-二环己基碳化二亚胺(3．42mmol)。在0℃反应2小时后，加入680μl癸胺(3．42mmol)，该溶液在室温下搅拌6小时。然后过滤反应介质，蒸发至干燥，然后溶解在200ml的醋酸乙酯中。依次用100ml 5％(w／w)的碳酸氢钠，100ml水，100ml 0．5M柠檬酸，100ml水，洗涤有机相，用硫酸镁进行干燥，然后使其蒸发至干燥。用硅胶色谱(1-3％的甲醇／二氯甲烷的梯度溶液)提纯所得到的残余物，得到1．27g的半透明油(2．75mmol，产率为88％)。
C23H44N2O5S460．68g／molTLCRf(5％／甲醇／1％ AcOH／CH2Cl2)=0．6NMR1H(CDCl3)；δppm0．89(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．21-1．38(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2NH)；1．45(s，9H，NH-C(CH3)3)；1．51(s，9H，S-C(CH3)3)；1．42-1．58(m，2H，CH2-CH2NH)；3．08-3．32(m，4H，CH2-S，CH2-NH CO)；4．27(dd，J1=13Hz，J2=8Hz，1H，CH-CONH)；5．35-5．43(brs，1H，NHBoc)；6．28-6．37(brs，1H，NHCOCH)。
MS(FAB+)，m／z461．3[MH+]；405．3[MH+-叔丁基]；361．3[MH+-Boc]；349．2[MH+-2x叔丁基]；305．2[MH+-叔丁基-Boc]；261．2[MH+-2Boc]。
步骤4制备S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-癸酰胺 在0℃将461mg的N，S-二-叔-丁氧基羰基-L-半胱氨酸-癸酰胺(1mmol)溶解在3ml的2NHCl／AcOEt中，搅拌1小时。将该溶液蒸发至干燥，然后溶解在100ml的醋酸乙酯中。用5％(w／w)的碳酸氢钠洗涤有机相两次，用硫酸镁进行干燥，然后使其蒸发至干燥。用硅胶色谱(0-3％的甲醇／二氯甲烷的梯度溶液)提纯所得到的油，得到233mg的半透明油(0．65mmol，产率为65％)。
C18H36N2O3S360．56g／molTLCRf(10％甲醇／CH2Cl2)=0．7NMR1H(CDCl3)；δppm0．89(t，J=6Hz，3H，CH3)；1．10-1．40(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2NH)；1．41-1．58(m，2H，CH2-CH2NH)；1．50(s，9H，S-C(CH3)3)；1．62(brs，2H，NH2)；3．06(dd，J1=14Hz，J2=8Hz，1H，CH-S)；3．24(dt，J1=7Hz，J2=7Hz，2H，CH2-NHCO)；3．37(dd，J1=14Hz，J2=4Hz，1H，CH-S)；3．55(dd，J1=8Hz，J2=4Hz，1H，CH-CONH)；7．3-7．4(brs，1H，NH)。
MS(FAB+)，m／z361．2[MH+]；305．1[MH+-叔丁基]；261．1[MH+-Boc]。
步骤5制备N，N′-二-叔-丁氧基羰基-胍基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-癸酰胺 将N，N′-二-叔-丁氧基羰基-吡唑-1-甲脒(178mg；0．572mmol)加入到S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-癸酰胺(227mg；0．630mmol)的3ml乙腈溶液中。在室温下将该反应混合物搅拌2天，并干燥。用硅胶色谱(10-15％醋酸乙酯的己烷溶液)提纯所得到的残余物，得到白色固体(281mg；0．47mmol，产率为81％)。
C29H54N4O7S602．84g／molTLCRf(20％AcOEt／己烷)=0．6NMR1H(CDCl3)；δppm0．9(t，J=6Hz，3H，CH3)；1．18-1．40(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2NH)；1．45-1．65(m，29H，3×-C(CH3)3，CH2-CH2NH)；3．17-3．35(m，4H，CH2-S，CH2-NHCO)；4．8(dd，J1=11Hz，J2=6Hz，1H，CH-CONH)；6．98-7．07(m，1H，CH2CH2NH)；8．81(d，J=7Hz，NH-Boc)；11．36(sl，1H，NH-CN(NH))。
MS(FAB+)，m／z603．3[MH+]；547．2[MH+-叔丁基]；503．3[MH+-Boc]；447．2[MH+-叔丁基-Boc]；403．2[MH+-2Boc]；347．1[MH+-叔丁基- 2Boc]；303．2[MH+-3Boc]。
步骤6a)制备胍基-半胱氨酸-癸酰胺(C10CG+) 将N，N＇-二-叔-丁氧基羰基-胍基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-癸酰胺(60mg；0．1mmol)溶解在1ml的三氟乙酸中，并在氩气氛中在室温下搅拌2小时。该混合物干燥后得到的无色油溶解在1ml的全氘化乙醇中。所得到的0．1M的储备溶液在氩气氛中-80℃下保存。采用Riddles等人的方法使用Elmann试剂测定硫醇的含量(87％)。
C14H30N4OS302．48g／molNMR1H(CD3CD2OD)；δppm0．90(t，J=6Hz，3H，CH3)；1．27-1．42(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2NH)；1．50-1．61(m，2H，CH2-CH2NH)；2．90-3．35(m，4H，CH2-S，CH2-NHCO)；4．32-4．40(m，1H，CH-CONH)。
b)在模板DNA存在的情况下，半胱氨酸去污剂C10CG+氧化成为胱氨酸脂质(C10CG+)2的速度更快。通过三个真空／氧气循环后，该储备缓冲溶液(TrisHCl15mMpH为8．4)被氧饱和。从浓储备溶液中注入C10CG+至90μM的最终浓度。在每一个时间点，取0．5ml的等分试样并使之与0．5ml的2×Elmann试剂混合。用Riddles等人(1979)的分光光度法测量剩余的游离硫醇的数量。对于该模板实验，在加入去污剂之前，添加pCMVL质粒DNA(按照WO93／07283所述方法而制备)至最终浓度60μM。实验结果如图3所示。
c)透射电子显微镜实验(图4)(C10CG+)2阳离子脂质／DNA颗粒的未过滤溶液的透射电子显微镜实验显示(a)直径约23nm球(c，d)的很均匀群体(b)；所有照片的比例尺是100nm。通过向HEPES缓冲液(15mM，pH为7．4)中的60μM的pCMVL DNA溶液加入去污剂(90μM的最终浓度)而制备样品溶液，并将该溶液在有氧条件下放置过夜。通过在新劈开的云母上升华而制备碳膜，并通过在Cu／Rh格栅(300目，Touzard&Matignon，Courtaboeuf，France)上浮选而收回。经过一夜干燥后，将该格栅放置在Petri盘的吸水纸上。就在样品添加之前，该格栅被辉光放电(110mV，25s)。将一滴样品溶液(5μl)放在该格栅上1分钟。用30μl含水的醋酸双氧铀(1％w／w)将复合物在底片上染色20秒，用吸水纸除去多余的液体。在80kV用Philips EM 410透射电子显微镜进行观察。在0．15M的NaCl中观察复合物得到类似的结果。(图4)d)(C10CG+)2／DNA复合物的物理和化学稳定性(图5)含有0．4μg(带1-4)或0．2μg(带5-8)的pCMV-Luc质粒DNA的20μl样品的1％琼脂糖凝胶电泳(在40mM pH为8的Tris-醋酸盐缓冲液中，在8V／cm 90分钟)。通过向HEPES缓冲液(15mM，pH为7．4)中的质粒溶液(60μM)中加入100倍浓缩的C10CG+去污剂溶液(90μM的最终浓度)而制备复合物。将该溶液缓慢混合并放置氧化24小时。带160μM质粒DNA。带260μM氧化的(C10CG+)2／DNA复合物。带3如同在加样之前在3mM最终十二烷基硫酸钠中的带2。带4如同在加样之前在6mM二硫苏糖醇中的带2。带560μM质粒连同含有10％血浆的相同体积的DMEM细胞培养基在37℃温育1小时。带660μM氧化的(C10CG+)2／DNA复合物如同带5一样保温。带7如同在加样之前在3mM最终十二烷基硫酸钠中的带2。带830μM pCMV-Luc质粒DNA。
e)用C10CG+凝聚的纳米级DNA颗粒利用质粒CMV-Luc(5．6 kbp)，以及利用入噬菌体DNA(48kbp)和利用在Tris-HCl(15mM pH为8．4)中浓度为15μM bp的T4DNA(167kbp)形成复合物。温育24小时后，进行测量。结果如图6所示(图6A噬菌体λ，图6B噬菌体T4，图6CCMV-Luc。1eq．=30μM；1．2eq．=36μM；1．4eq．=42μM．)。
在DNA分子单分子凝聚的情况下，所形成的颗粒其体积与DNA的长度成正比体积=常数×DNA的长度(bp)。
在球形颗粒的情况下，该体积与直径的三次方成正比(vol=4PiR3／3)，可以由以下等式表示颗粒直径=常数×(DNA的长度(bp))1／3。当将由不同的DNA(图7B)产生的最小颗粒尺寸作为其尺寸的立方根的函数进行绘制时(图7A)，可以画出一条通过所有点包括原点的直线。这就是单分子凝聚的证据。
f)亲油醇半胱氨酸酰胺(C10CG+)／DNA复合物转染成为细胞系BNL CL．2在转染前24小时，将细胞(由ATCC获得)分配在24穴培养盘上(每个穴50，000个细胞，细胞在75-cm2的烧瓶(Costar)内在Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM，GIBCO)中培养，链霉素为100μg／ml(GIBCO)，青霉素为100国际单位／ml(GIBCO)；谷氨酰胺(glutamax)在37℃含有5％CO2的潮湿空气中为0．286g／ml(Lancaster))。
通过向质粒(30μM bp)的pH为8．4的15mM氧饱和Tris-HCl溶液中加入等量的浓缩C10CG+溶液形成有质粒CMV-Luc的复合物。然后将该溶液在氧气中温育24小时。就在转染之前，用没有血清的新鲜介质代替该介质。将含有该复合物的100μL的转染溶液添加到每一个穴中(2μgDNA)。转染3个小时之后，加入1％的血清，再过1小时加入9％的血清。转染6小时之后，用补充至10％血清的介质代替该转染介质。24小时之后，在发光计(Berthold)中使用在市场上可以买到的工具(Promega)来确定虫荧光素酶的表达。每一个实验都进行两次，结果以每mg蛋白质的光单位给出(bicinchoninic酸(BCA)实验，Pierce)．使用含有PEI(聚氢丙啶，25kDa)的10电荷当量的DNA复合物作为内标(图8)。
实施例2a)亲油醇半胱氨酸酯去污剂的合成根据图9所示的路线进行该合成。
步骤1制备N，S-二-叔-丁氧基羰基-L-半胱氨酸 将945mg的L-半胱氨酸氯水合物(chlorohydrate)(6mmol)溶解在10ml去离子水中，其中气体已通过真空除去。向该溶液中加入2．625gBocOBoc(12mmol)的10mlTHF溶液和5．4ml三乙基胺(39mmol)。在氩气氛中室温下搅拌2天后，将该反应介质蒸发，使其体积略小于10ml。然后加入10ml去离子水，用乙醚洗涤液相以除去残余的未反应BocOBoc。然后用饱和柠檬酸将水相酸化至pH值为3，并用乙醚(3×60ml)萃取。使用0．5M的柠檬酸(2×100ml)洗涤乙醚相，用硫酸镁进行干燥，和蒸发。采用硅胶柱进行色谱分离(使用含有1％醋酸的梯度为0％-2％的CH2Cl2／MeOH进行洗脱)，得到1．34gN，S-二-叔-丁氧基羰基-L-半胱氨酸(4．2mmol，产率为70％)。
TLCRf(CH2Cl2，MeOH5％，AcOH1％)=0．5利用核磁共振NMR1H(CDCl3)确认所得产品的结构，其化学位移δ(ppm)1．46(s，9H，N-Boc)；1．50(s，9H，S-Boc)；3．22(dd，J1=15Hz，J2=7Hz，1H，Ha)；3．36(dd，J1=15Hz，J2=5Hz，1H，Ha)；4．34-4．57(m，1H，Hb)；5．45(d，J=7．2Hz，1H，Hc)；6．34(brs，1H，Hd)。
MS(FAB+)322．1[MH+]。
步骤2制备N，S-二-叔-丁氧基羰基-L-半胱氨酸的亲油醇酯 向亲油醇(1．2mmol)的2．5ml无水二氯甲烷溶液中加入321mg的N，S-二-叔-丁氧基羰基-L-半胱氨酸(1mmol)和24mg的4-二甲基氨基吡啶(0．2mmol)。然后将该溶液冷却至0℃，加入268mg的DCC(1．3mmol；或EDC)。在0℃将该溶液搅拌2小时，然后在室温下放置过夜。将该反应介质蒸发至干燥，残余物再悬浮在10ml醋酸乙酯中。过滤该悬浮液，将滤液用10ml醋酸乙酯稀释。用20ml蒸馏水，20ml的5％碳酸钠水溶液和20ml蒸馏水洗涤有机相。使用MgSO4干燥有机相，然后蒸发至干燥。最后用硅胶柱对所得到的油进行色谱分离(用0％-7％的己烷／醋酸乙酯洗脱)，以获得半透明油。在使用C10的半胱氨酸(n=2)时，产率是73％。TLC(己烷，AcOEt10％)Rf=0．50。
利用核磁共振NMR1H(CDCl3)确认所得产品的结构，其化学位移δ(ppm)如下0．90(t，J=6．9Hz，3H，H5)；1．25-1．42(m，12H，H3)；1．46(s，9H，N-Boc)；1．51(s，9H，S-Boc)；1．56-1．71(m，4H，H2，H4)；3．18-3．38(m，2H，Ha)；4．14(t，J=6，6Hz，2H，H1)；4．50-4．58(m，1H，Hb)；5．30-5．38(m，1H，Hb)；5．30-5．38(m，1H，Hc)。
MS(FAB+)462．4[MH+]。
步骤3制备亲油醇半胱氨酸酯
将0．2mmol N，S-二-叔-丁氧基羰基-L-半胱氨酸的亲油醇酯溶解在1．5ml三氟乙酸中，并在氩气氛中搅拌1小时。将该反应介质蒸发，所得到的半透明油溶解在1ml氘化乙醇中，并在氩气氛中在-80℃保持。使用Ellman试剂对硫醇基团进行的测量(Riddles等，1979)显示该去保护反应是定量的。
在使用C10半胱氨酸(n=2)的情况下利用核磁共振NMR1H([D6]乙醇)确认所得产品的结构，其化学位移δ(ppm)如下0．91(t，J=6．8Hz，3H，H5)；1．24-1．48(m，14H，H3，H4)；1．66-1．78(m，2H，H2)；3．06-3．22(m，2H，Ha)；4．18-4．40(m，3H，Hb，H1)。
MS(FAB+)262．2(MH+)。
b)在有和没有DNA的情况下，确定亲油醇半胱氨酸酯的临界胶束浓度(c．m．c)ⅰ)关于C8，C10，C11和C12半胱氨酸的去污剂的c．m．c在含有10mM的DTT的MES缓冲液(20mM，pH为6)中利用Langmuir平衡进行c．m．c的测量。当将表面张力表示为去污剂浓度的对数函数时，在c．m．c上观察到一个突跃(图10)。
采用这种方法，可以确定链长度不同的化合物(C8，C10，C11，C12)的c．m．c。
ⅱ)在有和没有DNA的情况下C10和C11半胱氨酸的c．m．c。按照上述的类似方法确定C10和C11半胱氨酸的c．m．c值，缓冲液含有浓度为30μMbp的小牛胸腺DNA(图11A，B)。
c)在有和没有DNA的情况下C10半胱氨酸的氧化通过使用Ellman试剂(Riddles等，1979)，测量作为时间的函数的硫醇基团，来确定C10半胱氨酸的氧化速度。对没有DNA或有30μM bp的CMV-Luc的情况下60μM C10半胱氨酸在pH为6的20mM的MES中的溶液进行测量(图12)。
实施例3亲油醇胍基-半胱氨酸酯去污剂的合成根据图13所示的路线进行合成。
步骤1制备S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸癸基酯
将231mg的N，S-二-叔-丁氧基羰基-半胱氨酸癸基酯(0．5mmol)溶解在1．1ml的2．2N HCl／AcOEt中。将该溶液在室温下搅拌1小时后使其蒸发至干燥。将所得到的残余物溶解在50ml的醋酸乙酯中。用25ml的5％(w／w)的碳酸氢钠洗涤有机相两次，用硫酸镁进行干燥，最后使其蒸发至干燥。将得到的油用硅胶色谱进行提纯(用含有0-3％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)，得到141mg的黄色油(0．39mmol，产率为78％)。
C18H35NO4S361．55g／molNMR1H(CDCl3)；δppm0．90(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．20-1．42(m，14H，CH3-O(CH2)7-CH2CH2O)；1．50(s，9H，C(CH3)3)；1．58-1．72(m，4H，CH2CH2O，NH2)；3．03(dd，J1=14Hz，J2=7Hz，1H，CH-S)；3．26(dd，J1=14Hz，J2=5Hz，1H，CH-S)；3．71(dd，J1=7Hz，J2=5Hz，1H，CH-COO)；4．13(t，J=6Hz，2H，CH2-O)。
MS(FAB+)，m／z362．2[MH+]；306．2[MH+-叔丁基]；262．2[MH+-Boc]。
步骤2制备N，N＇-二-叔-丁氧基羰基-胍基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸癸基酯 将78mg N，N′-二-叔-丁氧基羰基-吡唑-1-甲脒(0．25mmol)加入到99mg的S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸癸基酯(0．275mmol)的1ml的乙腈溶液中。在室温下将该反应介质搅拌2天，蒸发使其干燥。用硅胶色谱(用含有0-7％醋酸乙酯的己烷溶液洗脱)提纯所得到的残余物，得到127mg的半透明油(0．21mmol，产率为84％)。
C29H53N3O8S603．82g／molTLCRf(10％AcOEt／己烷)=0．5NMR1H(CDCl3)；δppm0．9(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．25-1．42(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2O)；1．479(s，9H，C(CH3)3)；1．493(s，9H，C(CH3)3)；1．497(s，9H，C(CH3)3)；1．58-1．73(m，2H，CH2-CH2O)；3．31(dd，J1=14Hz，J2=5Hz，1H，CH-S)；3．50(dd，J1=14Hz，J2=5Hz，1H，CH-S)；4．05-4．20(m，2H，CH2-O)；5．15(dt，J1=7Hz，J2=5Hz，1H，CH-COO)；9．00(d，J=5Hz，1H，NH-Boc)；11．42(brs，1H，NH-CN(NH))。
步骤3制备胍基-半胱氨酸癸基酯
在氩气氛中将30mgN，N＇-二-叔-丁氧基羰基-胍基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸癸基酯(0．05mmol)溶解在1ml的三氟乙酸中，并在室温下搅拌2小时。将该反应介质蒸发至干燥后得到的半透明油溶解在1ml的氘化乙醇中。所得到的溶液在氩气氛中-80℃下保存。使用Elmann试剂(Riddles等，1979)测量硫醇基团的含量以确定产率。该反应产率为80％。
C14H29N3O2S303．46g／molNMR1H(CD3CD2OD)；δppm0．90(t，J=6Hz，3H，CH3)；1．25-1．47(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2O)；1．60-1．77(m，2H，CH2-CH2O)；2．98-3．27(m，2H，CH2-S)；4．12-4．30(m，2H，OCH2)；4．32-4．40(m，1H，CH-CONH)。
实施例4亲油鸟氨酰基-半胱氨酸酰胺去污剂的合成根据图14所示的路线进行合成。
步骤1制备S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸盐酸盐 将642mg的N，S-二-叔-丁氧基羰基半胱氨酸(2mmol)溶解在3ml的2．9N的HCl／AcOEt中，并将该溶液在室温下搅拌20分钟。向该反应介质中加入3ml的乙醚，过滤收集得到的结晶，用乙醚洗涤，最后真空干燥。由此得到405mg的白色结晶(1．57mmol，产率为79％)。
C8H16NO4ClS257．74g／molNMR1H(DCl 0．1M)；δppm1．44(s，9H，C(CH3)3)；3．31(dd，J1=15Hz，J2=7Hz，1H，CH-S)；3．49(dd，J1=15Hz，J2=5Hz，1H，CH-S)；4．33(dd，J1=15Hz，J2=7Hz，1H，CH-CO2)。
MS(FAB+)，m／z222．0[MH+]；166．0[MH+-叔-丁基]。
步骤2制备N，N＇-二-叔-丁氧基羰基鸟氨酰基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸 向N，N′-二-叔-丁氧基羰基鸟氨酸(160mg；0．48mmol)的1ml二氯甲烷溶液中加入60mg的N-羟基-琥珀酰亚胺(0．52mmol)。将该反应混合物冷却至0℃，加入99mg的N，N′-二环己基碳二亚胺(0．48mmol)。在0℃搅拌2小时之后，加入已溶解在含有234μl三乙基胺(1．68mmol)的1ml甲醇中的130mg盐酸S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸(0．50mmol)，然后在室温下将该溶液搅拌过夜。将该反应介质蒸发至干燥，并溶解在10ml的醋酸乙酯中，再进行过滤。将滤液用50ml的醋酸乙酯稀释后，用25ml的5％(w／w)柠檬酸洗涤两次，用硫酸镁干燥，然后蒸发至干燥。将所得到的残余物用硅胶色谱提纯(用含有2-15％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱)，得到242mg的白色固体(0．45mmol，产率为94％)。
C23H41N3O9S535．66g／molNMR1H(CD3OD)；δppm1．42(s，9H，C(CH3)3)；1．45(s，9H，C(CH3)3)；1．46(s，9H，C(CH3)3)；1．47-1．88(m，4H，CH2CH2-CH2NHBoc)；3．04(t，J=6Hz，2H，CH2-NHBoc)；3．13(dd，J1=14Hz，J2=7Hz，1H，CH-S)；3．45(dd，J1=14Hz，J2=4Hz，1H，CH-S)；4．0-4．1(m，1H，CH2CH2-CH-CONH)；4．40(dd，J1=7Hz，J2=4Hz，1H，CH-CO2)。
步骤3制备N，N＇-二-叔-丁氧基羰基鸟氨酰基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-n-烷基酰胺 向N，N′-二-叔-丁氧基羰基鸟氨酰基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸(100mg；0．187mmol)的0．5ml二氯甲烷溶液中加入26mg的N-羟基-琥珀酰亚胺(0．224mmol)。将该反应混合物冷却至0℃，加入42mg的N，N＇-二环已基碳二亚胺(0．205mmol)。在0℃反应2小时之后，加入n-烷基胺(0．205mmol)，然后在室温下将该溶液搅拌过夜。将该反应介质蒸发至干燥，并溶解在5ml的醋酸乙酯中，再进行过滤。将滤液用25ml的醋酸乙酯稀释后，顺次用10ml水，10ml的5％(w／w)碳酸氢钠和10ml水洗涤，用硫酸镁干燥，然后蒸发至干燥。将所得到的残余物用硅胶色谱提纯(用含有0-1％的甲醇的二氯甲烷梯度溶液洗脱)，得到白色固体。
在是N，N′-二-叔-丁氧基羰基鸟氨酰基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-十二烷基酰胺的情况下，得到85mg的白色固体(0．121mmol，产率为65％)。
C35H66N4O8S703．00g／molTLCRf(5％MeOH／CH2Cl2)=0．5NMR1H(CD3OD)；δppm0．89(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．25-1．35(m，18H，CH3-(CH2)9-CH2CH2NH)；1．42(s，9H，C(CH3)3)；1．45(s，9H，C(CH3)3)；1．49(s，9H，C(CH3)3)；1．5-1．9(m，6H，CH2CH2-CH2NHBoc，CH2-CH2NHCOCH)；3．00(t，J=6Hz，2H，CH2-NHBoc)；3．04-3．50(m，4H，CH2-S，CH2-NHCOCH)；3．94(dd，J1=8Hz，J2=5Hz，1H，CH2CH2-CH-CONH)；4．48(dd，J1=8Hz，J2=5Hz，1H，CH-CONHCH2)。
步骤4制备鸟氨酰基-半胱氨酸-n-烷基酰胺 将0．11mmol的N，N’-二-叔-丁氧基羰基鸟氨酰基-S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-n-烷基酰胺溶解在1ml的三氟乙酸中，并在氩气氛中在室温下搅拌1．5小时。将该反应介质蒸发后得到的半透明油溶解在1ml的氘化乙醇中。所得到的溶液在氩气氛中-80℃下保存。使用Elmann试剂(Riddles等，1979)测量硫醇官能团的含量以确定反应产率。在是鸟氨酰基-半胱氨酸-十二烷基酰胺的情况下，该反应产率为84％。
C20H42N4O2S402．64g／molNMR1H(CD3CD2OD)；δppm0．89(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．25-1．38(m，18H，CH3-(CH2)9-CH2CH2NH)；1．45-1．96(m，6H，CH2CH2-CH2NHBoc，CH2-CH2NHCOCH)；2．80-3．50(m，6H，CH2-NH3+，CH2-S，CH2-NHCO)；3．95-4．0(m，1H，CH2CH2-CH-CONH)；4．42-4．48(m，1H，CH-CONHCH2)。
实施例5亲油醇半乳糖基半胱氨酸酯去污剂的合成根据图15所示的路线进行合成。
步骤1制备S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-溴乙酰胺-癸基酯 向含有108mg S-叔-丁氧基羰基-半胱氨酸-癸基酯(0．30mmol)的1ml的二氯甲烷溶液中加入63μl的三乙基胺(0．45mmol)，再加入86mg的溴乙酸酐(0．33mmol)。将该反应介质在室温下搅拌1小时后使其蒸发至干燥。将得到的残余物用硅胶色谱进行提纯(用含有5-10％醋酸乙酯的己烷梯度溶液洗脱)，得到88mg的半透明油(0．18mmol，产率为61％)。
C20H36BrNO5S482．48g／molTLCRf(20％AcOEt／己烷)=0．5NMR1H(CDCl3)；δppm0．90(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．25-1．40(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2O)；1．50(s，9H，C(CH3)3)；1．60-1．75(m，2H，CH2-CH2O)；3．26(dd，J1=15Hz，J2=6Hz，1H，CH-S)；3．42(dd，J1=15Hz，J2=4Hz，1H，CH-S)；3．90(s，2H，CH2-Br)；4．17(t，J=7Hz，CH2-O)；4．79(ddd，J1=7Hz，J2=6Hz，J3=4Hz，1H，CH-COO)；7．20-7．35(m，1H，NH)。
MS(FAB+)，m／z482．1和484．1[MH+]；426．1和428．1[MH+-叔丁基]；382．1和384．1[MH+-Boc]。
步骤2制备S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-硫代半乳糖基乙酰胺-癸基酯 向含有48mg的S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-溴乙酰胺-癸基酯(0．1mmol)的1ml的二甲基甲酰胺溶液中加入23mg的1-硫代-D-吡喃半乳糖(0．1mmol)。将该溶液在室温下搅拌3小时后使其蒸发至干燥。将所得到的残余物用硅胶色谱进行提纯(用含有3-20％的甲醇的二氯甲烷梯度溶液洗脱)，得到52mg的玻璃状固体(0．087mmol，产率为87％)。
C26H47NO10S2597．79g／molTLCRf(10％MeOH／CH2Cl2)=0．4NMR1H(CD3OD)；δppm0．90(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．25-1．43(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2O)；1．48(s，9H，C(CH3)3)；1．58-1．73(m，2H，CH2CH2O)；3．12(dd，J1=14Hz，J2=8Hz，1H，CH-S)；3．34(s，2H，CO-CH2-S)；3．25-3．88(m，7H，CH-S，H2，H3，H4，H5，H6)；4．08-4．17(m，2H，CH2-O)；4．41(d，J=9Hz，H1)；4．55-4．70(m，1H，CH-COO)。
MS(FAB+)，m／z620．2[MNa+]；598．2[MH+]；564．2[MNa+-叔丁基]；542．2[MH+-叔丁基]；520．2[MNa+-Boc]。
步骤3制备半胱氨酸-硫代半乳糖基乙酰胺-癸基酯 将49mg的S-叔-丁氧基羰基半胱氨酸-硫代半乳糖基乙酰胺-癸基酯(0．082mmol)溶解在1ml的三氟乙酸中，并在氩气氛中在室温下搅拌1．5小时。将该反应介质蒸发至干燥后得到的油溶解在氘化乙醇中。将该溶液在氩气氛中-80℃下保存。
使用Elmann试剂(Riddles等，1979)测量硫醇官能团的含量以确定反应定量产率。
C21H39NO8S2497．67g／mol
NMR1H(CD3CD2OD)；δppm0．90(t，J=7Hz，3H，CH3)；1．20-1．43(m，14H，CH3-(CH2)7-CH2CH2O)；1．60-1．76(m，2H，CH2-CH2O)；2．85-3．08(m，2H，CH2-S)；3．35-4．00(m，8H，H2，H3，H4，H5，H6，CO-CH2-S)；4．07-4．28(m，2H，CH2-O)；4．43(d，J=9Hz，1H)；4．58-4．70(m，1H，CH-COO)。
MS(FAB+)，m/z520[MNa+]；498[MH+]。
实施例6为了形成由非脂质分子而稳定的单分散DNA转染颗粒，合成一种基于精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺(SC2)的可替换的载体类型。 该分子由精胺分子通过酰胺键与有两个游离硫醇官能团的两个半胱氨酸分子键合而形成。
a)合成精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺
N，N＇-双-叔-丁氧基羰基-N，N＇-(2-氰基乙基)-1，4-二氨基丁烷2含有2ml的1，4-二氨基丁烷⊥(20mmol)，2．63ml丙烯腈(40mmol)的10ml乙腈溶液在氩气氛中室温下搅拌，并曝露在黑暗中。搅拌18小时之后，向该溶液中加入10．835g的BocON(44mmol)和6．2ml的三乙基胺(44mmol)。三天后，将该反应介质稀释在100ml的乙醚中。用2M的NaOH(2×50ml)，50ml的蒸馏水和50ml的5％(w／w)柠檬酸洗涤有机相。然后将有机相用MgSO4干燥，并蒸发得到4．27g的白色固体。后者在乙醚中结晶，得到以白色结晶形式的3．50g化合物2(8．9mmol，产率为44％)。
C20H34N4O4394．52g／molTLCRf(CH2Cl296％／MeOH4％)=0．4NMR1H(CDCl3)；δppm1．29-1．65(m，22H，(CH2)2-CH2-CH2，C(CH3)3)；2．50-2．68(m，4H，CH2-N(Boc)-(CH2)2-CN)；3．19-3．32(m，4H，N(Boc)-CH2-CH2-CN)；3．44(t，J=6．7Hz，4H，CH2-CN)。(指定为信号的氢原子用黑体印刷。)N，N＇-双-叔-丁氧基羰基-N，N′-(2-氨基丙基)-1，4-二氨基丁烷3含有1．176g N，N＇-双-叔-丁氧基羰基-N，N＇-(2-氰基乙基)-1，4-二氨基丁烷2(3mmol)的6ml甲醇溶液和2ml 2M的NaOH(4mmol)在氢气氛中在催化量的阮内镍存在的情况下搅拌。搅拌4小时之后，通过硅藻土过滤除去镍。将滤液蒸发，所得到的残余物再悬浮在50ml的二氯甲烷中。然后用50ml的2M NaOH洗涤有机相，用MgSO4干燥，并蒸发得到以黄色粘稠液体形式的810mg化合物3(2mmol，产率为67％)。
C20H42N4O4；402．58g／molTLCRf(CH2Cl220％／MeOH60％／NEt320％)=0．4NMR1H(CDCl3)；δppm1．35-1．55(m，8H，(CH2)2-CH2-CH2，NH2)；1．45(s，18H，2×C(CH3)3)；1．64(quint_J=6．8Hz，4H，CH2-CH2-NH2)；2．69(t，J=6．7Hz，4H，CH2-NH2)；3．10-3．32(m，8H，CH2-N(Boc)-CH2)。
精胺-N4，N9-双-叔-丁氧基羰基-N1，N12-双-半胱氨酸(N，S-双-叔-丁氧基羰基)酰胺6向含有242mg的N，N＇-双-叔-丁氧基羰基-N，N′-(2-氨基丙基)-1，4-二氨基丁烷3(0．6mmol)和388mg的N，S-双-叔-丁氧基羰基-半胱氨酸(1．2mmol)的1．5ml的二氯甲烷溶液中，加入溶解在1．5ml的二氯甲烷中的248mgDDC(1．2mmol)。将该溶液搅拌1天，并过滤以除去所形成的DCU，然后蒸发。将残余物再悬浮在100ml的醋酸乙酯中，用蒸馏水(100ml)，0．5M的碳酸钠溶液(100ml)，饱和NaCl溶液(100ml)，0．2M的柠檬酸水溶液(100ml)洗涤，最后用饱和NaCl溶液(100ml)洗涤。有机相用MgSO4干燥，并蒸发。产品用硅胶柱分离，得到以白色固体形式的401mg化合物6(0．4mmol，产率为66％)。
C46H84N6O14S2；1009．35g/molTLCRf(CH2Cl297％/MeOH3％)=0．5NMR1H(CDCl3)；δppm1．50-1．89(m，8H，2×(CH2)2-CH2-CH2，2×CH2-CH2-NH-CO)；1．44(s，18H，2×C(CH3)3)；1．45(s，18H，2×C(CH3)3)；1．50(s，18H，2×C(CH3)3)；3．04-3．32(m，16H，(CH2)3-CH2-NBoc，CH2-(CH2)2-NH-CO，CH2-NH-CO，CH2-S-CO)；4．23-4．40(m，2H，CH-CH2-S-Boc)；5．37-5．54(m，2H，NH-Boc)；7．32-7．46(m，2H，CH2-NH-CO)。
MS(FAB+)1009．3(MH+)；909．2(MH+-Boc)；809．3(MH+-2Boc)；709．2(MH+-3Boc)；609．2(MH+-4Boc)；509．2(MH+-5Boc)；409．1(MH+-6Boc)。
精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺7将50mg的化合物6(0．05ml)溶解在1ml的三氟乙酸和1ml二氯甲烷中，并在氩气氛中搅拌2小时。然后将该反应介质蒸发，得到85mg的淡黄色粘稠流体。该产品在约11当量的三氟乙酸存在的情况下保存，以避免硫醇官能团的氧化。使用Elmann试剂(Riddles等，1979)测量硫醇基团表明该去保护反应是定量的。
C16H36N6O2S2: 408．64g/molNMR1H(D2O)；δppm1．64-1．96(m，8H，(CH2)2-CH2-CH2，CH2-CH2-NH-CO)；2．90-3．09(m，12H，(CH2)3-CH2-NBoc，CH2-(CH2)2-NH-CO，CH2-NH-CO)；3．21-3．37(m，4H，CH2-SH)；4．04-4．15(m，2H，CH-CH2-SH)。
MS(FAB+)410．1(MH+)。
b)精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺的生物物理性质ⅰ)uv光谱为不同的原因利用紫外光谱测定所形成的颗粒的性质。溶液中的DNA其特征吸收光谱在240-310nm。该吸收(光密度)在260nm最大，向310nm的方向趋向于0。DNA结构的变化会改变吸收光谱的形状。另外，颗粒的形成所导致的扩散加强将会通过光密度的增强而在UV光谱中表现出来。当调整波长至略大于310nm的值时(这是溶剂中的DNA没有吸收的波长)，可以监测到颗粒形成效应。
如Naroditsky等所述，在最适合于获得螺旋状结构的条件下(76μMDNA基质，65mM的精胺，25mM的NaCl)，小牛胸腺DNA与精胺复合。在DNA复合的同时，在230nm-330nm之间观察到吸收峰在10分钟之内升高。因此，可以在260nm的范围内检测到光密度的降低，260nm是DNA的最大吸收，在朝向300nm的方向它保持稳定。最后，在经过一个半小时之后，吸收稳定(图16A)。
当NaCl的浓度增加至100mM时，所观察到的光谱和DNA与精胺复合之前所观察到的光谱相同(图16B)。
从以上实验可以看出，在UV中可以观察到用精胺进行凝聚。特别是它可以显示在介质离子强度增强的情况下该过程所发生的逆转现象。
以相同浓度的精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺(SC2)代替精胺进行上述试验相同的试验。
将DNA与SC2复合和其与精胺复合进行动力学比较。利用Ellman试剂(Riddles等，1979)进行的硫醇官能团的测量显示，当除了在水中有氧以外没有氧存在时(1M的NaCl水溶液中氧的溶解度为0．8mM)，10分钟之后，50％的硫醇基团被氧化。另外，与精胺相比，DNA和SC2混合一个半小时之后，提高NaCl的浓度对其吸收峰只有很小的影响。NaCl的浓度为100mM时在330nm观察到的吸收为在25mM的NaCl时观察到的最大光密度的81％；而在150mM的NaCl时是71％。
因此，SC2以与精胺相同的方式与DNA复合和紧密结合。另一方面，所形成的颗粒相对于介质的离子强度来讲更加稳定，该离子强度与硫醇官能团的氧化有关。
ⅱ)琼脂糖凝胶电泳利用琼脂糖凝胶电泳(1％；Tris缓冲液，pH为6．5)测试由精胺或SC2由所形成的颗粒的稳定性(76μM基质RSV-Luc，65μM精胺或SC2，25mM所形成的颗粒相对于介质的离子强度来讲更加稳定，该离子强度与硫醇官能团的氧化有关。
ⅱ)琼脂糖凝胶电泳利用琼脂糖凝胶电泳(1％；Tris缓冲液，pH为6．5)测试由精胺或SC2由所形成的颗粒的稳定性(76μM基质RSV-Luc，65μM精胺或SC2，25mM的NaCl，pH为6．5，氧化2小时)。可以看出，体积更大、带电更少的致密DNA在琼脂糖凝胶中很少迁移或根本不迁移(图17)。
由精胺所形成的颗粒在用于进行电泳的条件下不稳定(单独的DNA和与精胺复合的DNA的相同迁移；带1和2)。由SC2所形成的颗粒是稳定的(带3)。该DNA-SC2颗粒即使在高的离子强度下也保持相对稳定(带5)。该复合物的稳定性是由于SC2氧化而产生的。因此，如果向与SC2复合的DNA溶液中加入二硫键的还原剂，该复合物在用于电泳的条件下不再稳定。
实施例7测定由(C10CG+)2／DNA复合物与不同量的PEI 25KDa相互作用得到的颗粒的尺寸。
通过向15mM pH为8．4的Tris／HCl缓冲液中的pCMVLDNA溶液(30μM磷酸酯)中加入去污剂C10CG+(30μM)而制备该溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。然后添加所需量的PEI 25KDa(Aldrich)，并在5分钟之后通过由Blessing等(1998)Proc．Natl．Acad．Sci．USA，95(4)，1427-1431所述的动力学光散射法(Dynamic Light Scattering)测量其尺寸(图18)。
实施例8(C10CG+)2／PEI 25KDa-Gal4／DNA复合物尺寸的测量通过向15mM的pH为8．4的Tris／HCl缓冲液中的pCMVL DNA溶液(30μM磷酸酯)中加入去污剂C10CG+(30μM)而制备该复合物溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。然后加入10当量的PEI 25KDa-Gal4(PEI-Gal4由如Zanta等，1997所述的PEI 25K与四半乳糖(Gala3GalB4 Gala3Gal)之间的还原胺化作用而制成)。在添加该聚合物1分钟之后进行测量(圆圈)。17小时以后，加入浓缩的NaCl溶液至最终浓度为150mM(三角形)。作为对照，如Bossif等，1995所述，pCMVL DNA与10当量的PEI 25KDa-Gal4复合(方形)(图19)。已经发现(C10CG+)2／PEI 25KDa-Gal4／DNA复合物远小于PEI 25KDa-Gal4／DNA复合物。
实施例9用C10CG+／DNA／PEI 25KDa复合物转染SKOV3细胞通过在15mMpH为8．4的Tris／HCl缓冲液中混合pCMVL(30μM磷酸酯)和30μMC10CG+而制备溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。然后添加所需量的PEI 25KDa。在进行转染18小时之前，将该SKOV3细胞(ovariancarcinoma，European Collection of Animal Cell Cultures(E．C．A．C．C))以每穴50，000细胞接种在24穴盘中。将等分量的复合物混合物(相当于每穴2μg的质粒)添加在保存于无血浆RPMI1640介质的细胞中。2小时后，加入10％血浆。24小时后监测荧光素酶基因的表达。该DNA条相当于单独pCMVL(每穴2μg的质粒)。(图20)实施例10用C10CG+／DNA／PEI 25KDa和C10CG+／DNA／PEI 25KDa-Gal4复合物转染BNLCL．2细胞通过在15mMpH为8．4 Tris／HCl的缓冲液中混合pCMVL(30μM磷酸酯)和30μMC10CG+而制备溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。然后添加所需量的PEI 25KDa或PEI 25KDa-Gal4(按胺总量5％支化)。在进行转染18小时之前，将细胞以每穴50．000细胞接种在24穴盘中。将等分量的复合物混合物(相当于每穴2μg的质粒)添加在保存于无血浆DMEM介质的细胞中。2小时后，加入10％血清。24小时后监测荧光素酶基因的表达。(图21)实施例11用键合于蛋白质的聚阳离子涂覆(C10CG+)2／DNA复合物测量由(C10CG+)2／DNA复合物与铁传递蛋白-聚赖氨酸共轭体相互作用所形成的颗粒的尺寸(TfpL36；见实施例13)。通过向15mMpH为8．4Tris／HCl的缓冲液中的pCMVL DNA溶液(30μM磷酸酯)中加入去污剂C10CG+(30μM)而制备复合物溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。然后添加所需量的PLL36-Tf(按胺总量2％支化)。在加入聚合物1分钟后(空心圆)和30分钟后(实心圆)进行测量。然后加入浓缩的NaCl溶液至最终浓度为15mM(空心三角形)。30分钟之后再次测量颗粒尺寸(实心三角形)(图22)。结果显示，(C10CG+)2／DNA复合物可用键合于蛋白质的聚阳离子涂覆，并且尺寸仍保持很小。
实施例12测量铁传递蛋白-聚赖氨酸涂覆的(C10CG+)2／DNA颗粒的Z电势通过向15mMpH为8．4的Tris／HCl缓冲液中的pCMVL DNA溶液(30μM磷酸酯)中加入去污剂C10CG+(30μM)而制备复合物溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。然后添加所需量的TfpL(按胺总量2％支化)。在测量之前，加入浓缩的NaCl溶液至最终浓度为150mM(图23)。结果显示该铁传递蛋白-聚赖氨酸涂覆的(C10CG+)2／DNA颗粒保持带负电。
实施例13转染K562细胞铁传递蛋白-聚赖氨酸对于(C10CG+)2／DNA复合物传送的影响为了进行转染，首先通过混合其最终浓度为30μM的1ml的HEPES(15mM，pH为8．5)中的10μg的pCMVL和其最终浓度为30μM的C10CG+去污剂而制备DNA／C10CG+复合物(1当量)。将该溶液逐渐混合，并在室温下放置24小时进行氧化。然后，将该复合物与在50μl的HEPES(15mM，pH为8．5)中的hTf-pL36共轭体[人铁传递蛋白和和聚赖氨酸的共轭体，所述聚赖氨酸平均分子聚合度为36个赖氨酸单体，铁传递蛋白∶聚赖氨酸摩尔比=1／1．5]按聚赖氨酸的氮原子与DNA磷酸基的摩尔比(N／P)为0．1；0．2；0．4；1．0的比例而混合，并在室温下温育30分钟。
K562悬浮细胞(ATCCCCL243)在补充有10％的胎牛血清(FCS)，1％L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640中增长，并在37℃温育。为了进行转染，将细胞以每穴500000细胞的密度置于24穴盘中。用1．05ml转染复合物和1ml RPMI1640(10％FCS，1％L-谷氨酰胺，抗生素)和最终浓度为100μM的氯奎的混合物代替该培养基。在37℃温育4小时以后，用2ml的新鲜培养基代替该转染介质。在转染24小时之后，细胞被收集起来，在PBS中洗涤，并再次悬浮在100μl的Tris(0．25M，pH=7．9)中。经过冰冻-解冻循环，细胞被裂解。该细胞裂解产物在10000g离心10分钟成为片状碎片。从10μl的上层清液记录荧光素酶光单位。
图24所示的光单位代表每个转染细胞试样的总荧光素酶活性。
实施例14转染B16F10细胞铁传递蛋白-聚赖氨酸对于(C10CG+)2／DNA复合物传送的影响为了进行转染，首先通过混合其最终浓度为30μM的0．5ml的HEPES(15mM，pH为8．5)中的5μg的pCMVL和其最终浓度为30μM的C10CG+去污剂而制备DNA／C10CG+复合物(1当量)。将该溶液逐渐混合，并在室温下放置24小时进行氧化。然后，在50μl的HEPES(15mM，pH为8．5)中将该复合物与hTf-pL36共轭体按聚赖氨酸的氮原子与DNA磷酸基的摩尔比(N／P)为0．1；0．2；0．5；1．0的比例而混合，并在室温下温育30分钟。
B16F10粘性细胞(NIH DCT Tumor Deposiory)在补充有10％的胎牛血清(FCS)，1％L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM中增长，并在37℃温育。细胞在25cm2的组织烧瓶中进行转染。在进行转染18小时之前，每个烧瓶放置400000细胞。用0．55ml转染复合物和1ml DMEM(10％FCS，1％L-谷氨酰胺，抗生素)和最终浓度为100μM的氯奎的混合物代替该培养基。
在37℃温育4小时以后，用2ml的新鲜培养基代替转染介质。在转染24小时之后，测定荧光素酶的活性。试验结果如图25所示。
实施例15转染B16F10细胞灭活的腺病毒颗粒对于(C10CG+)2／DNA复合物传送的影响为了进行转染，首先通过混合0．5ml的HEPES(15mM，pH为8．5)中的5μg的pCMV-Luc和其最终浓度为30μM的C10CG+去污剂而制备DNA／C10CG+复合物(1当量)。将该溶液逐渐混合，并在室温下放置24小时进行氧化。然后，向该复合物中添加如下物质1)生物素酰基化的8-MOP(甲氧基补骨脂素)-灭活的腺病毒颗粒dl1014(8．6×109颗粒)，其用在50μl的HEPES(15mM，pH为8．5)中的抗生蛋白链菌素酰基化的聚赖氨酸(250)处理，并在室温下保温30分钟。
2)生物素酰基化的8-MOP-灭活的腺病毒颗粒dl1014(8．6×109颗粒)与在50μl HEPES(15mM，pH为8．5)中的聚氮丙啶(PEI，分子量25kDa)以PEI的氮原子与DNA磷酸基的摩尔比(N／P)为0．4或1．0的比例混合，得到的混合物在室温下温育30分钟。
再过30分钟之后，使用该复合物进行转染实验。
B16F10粘性细胞在补充有10％的胎牛血清(FCS)，1％L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM中增长，并在37℃温育。细胞在25cm2的组织烧瓶中进行转染。在进行转染18小时之前，每个烧瓶放置500000细胞。用0．55ml转染复合物和1ml DMEM(10％FCS，1％L-谷氨酰胺，抗生素)和最终浓度为100μM氯奎的的混合物代替该培养基。
在37℃保温4小时以后，向该转染介质中加入1ml的新鲜培养基。
在转染24小时之后，收集该细胞，并准备萃取物。所得到的荧光素酶的活性见图26(相当于500000细胞)。
实施例16用于体内的复合物形成和浓缩通过向pCMVL质粒DNA的HEPES缓冲液(15mM，pH=8．5)溶液中加入浓缩的C10CG+储备溶液(7．2mM乙醇溶液；在使用Elmann试剂进行硫醇分析测定之后)的方式，而使用pCMVL质粒DNA和去污剂C10CG+来形成复合物。在加入去污剂之前，加入80μg的pCMV-Luc DNA至最终浓度为30μM(在8ml的缓冲液中)。注入C10CG+至最终浓度为1)30μM(1当量)2)21μM(0．7当量)将该溶液逐渐混合，并在室温下放置24小时进行氧化。然后，向该复合物中添加0．8ml的50％葡萄糖，使该溶液中葡萄糖浓度为5％。
将该试样用Vivaspin 4浓缩器，100000MW膜浓缩。经过在高达4000rpm离心后，得到包括如下组分的0．3ml的复合物1)44μg pCMVL DNA(产率55％)2)50μg pCMVL DNA(产率63％)实施例17体内(C10CG+)2／DNA复合物的皮内基因传送如实施例16所述方法制备复合物。
向pCMVLDNA溶液(8ml缓冲液中为80μg；30μM)中添加C10CG+去污剂至最终浓度为1)21μM(0．7当量)2)30μM(1．0当量)3)37．5μM(1．25当量)4)45μM(1．5当量)用Vivaspin浓缩器浓缩后，得到包括如下组分的0．3ml的复合物1)43μgpCMVLDNA(产率53％)
2)53μgpCMVLDNA(产率65％)3)47μgpCMVLDNA(产率58％)4)33μgpCMVLDNA(产率41％)在各种情况下该复合物每次以足够量用于引入每只小鼠10μg pCMVLDNA。
各组中的小鼠注入以下量的复合物1)70μl溶液中0．7当量的C10CG+／DNA2)57μl溶液中1．0当量的C10CG+／DNA3)64μl溶液中1．25当量的C10CG+／DNA4)90μl溶液中1．5当量的C10CG+／DNA为了进行体内实验，使用8-12周龄的雌性A／J小鼠(Harlan)。对于所有的实验组来讲，复合物皮内应用的方法、组织试样的制备和通过化学发光分析的定量荧光素酶表达都是一样的。在1天前将小鼠的背部剃光，然后使用(0．40mm×21mm)注射针头将C10CG+／LucDNA复合物进行皮内注射。将注射位置做好标记。24小时之后，将小鼠杀死，切取平均直径为15mm注射位置的皮肤。将该连同皮下脂肪组织的皮肤加入到600μl的TRIS缓冲液中，并进行冰冻。为了使荧光素酶定量表达，将冰冻的皮肤位置粉碎。然后将该试样在温度4℃离心8分钟(15000rpm)。从上层清液测定荧光素酶表达。
注射后24小时的荧光素酶基因表达(以相应的光单位／位置)如图27所示(每组的平均值和STDEV)。在0．7当量-1．25当量的C10CG+／DNA的范围内可以得到类似的表达程度。
实施例18体内(C10CG+)2／DNA复合物的皮内基因传送如实施例16所述制备复合物(用于1组)。向pCMVL DNA溶液中(10ml缓冲液中为100μg；30μM)添加C10CG+去污剂至最终浓度为30μM(1当量)，并放置使之氧化。最后，添加1ml的50％葡萄糖，使该溶液中葡萄糖浓度为5％。用Vivaspin浓缩器浓缩后，得到0．4ml含有60μg pCMVL DNA的复合物(产率60％)。
2)组含有41μl的相同的pCMVL DNA储备溶液与229μl的水(Aquabidest．)和30μl的50％葡萄糖混合，以得到最终浓度为10μg pCMVLDNA／50μl的溶液。
对于3)组，向268μl的水(Aqua bidest．)和30μl的50％葡萄糖中加入2μl的pCMVL DNA储备溶液，使DNA浓度为0．5μg／50μl。
在该三组中，使用以下量的DNA或复合物1)1．0当量C10CG+／DNA(10μg)2)裸露的pCMVL DNA(10μg／50μl)3)裸露的pCMVL DNA(0．5μg／50μl)将该不同组的复合物进行皮内注射，在24小时之后按实施例17所述的方法获取该注射部位。蛋白质提取物的荧光素酶活性(以相应的光单位／位置)如图28所示(每组的平均值和STDEV)。
实施例19体内C10CG+／pCMVL／MannITC-PEI(25KDa)复合物的皮内传送对于1组，按照实施例17所述的方法制备C10CG+／DNA复合物，然后涂覆甘露糖基化的(mannosylated)聚氮丙啶(PEI)。向pCMVL DNA溶液(10ml缓冲液中为100μg；30μM)中添加C10CG+去污剂至最终浓度为30μM(1当量)，并放置使之氧化。接下来，将该复合物与30μg的MannITC-PEI(25KDa)共轭体混合(该共轭体的制备将在下面描述)，混合比例为PEI的氮原子与DNA磷酸基(N／P)摩尔比为2．4，然后在室温下温育30分钟。最后，添加1ml的50％葡萄糖，使该溶液中葡萄糖浓度为5％。浓缩后，得到0．25ml含有21μgpCMVLDNA(产率21％)的复合物。
对于2)组没有C10CG+的类似复合物是通过以PEI的氮原子与DNA磷酸基(N／P)摩尔比为2．4混合pCMVL和MannITC-PEI(25KDa)而制备的。将120μl中的60μg的pCMVLDNA和150μl中的18μg的MannITC-PEI(25KDa)的混合物温育20分钟(在室温下)。最后，添加30μl的50％葡萄糖，使其最终葡萄糖浓度为5％。
按以下各组给药(50μl中的10μg的DNA和3μg的甘露糖ITC-改性PEI／小鼠)1)C10CG+／pCMVL／MannITC-PEI(25KDa)N／P=2．42)pCMVL／MannITC-PEI(25KDa)N／P=2．4皮内注射24小时之后，获取皮肤部位，并测定荧光素酶表达。该表达(以相应的光单位／位置)如图29所示(每组的平均值和STDEV)。
MannITC-PEI(25KDa)，一种甘露糖通过异硫氰酸苯酯键与PEI相键合的共轭体，使用吡喃甘露糖基异硫氰酸苯酯(ManITC，Sigma)作为偶合剂而制备。通过0．33ml的250mM的NaCl水溶液中的25mg PEI(25KDa分子量，Aldrich)与0．2ml二甲基亚砜中的25mg MannITC反应至少1天而进行偶合，然后用4ml水进行稀释，并调整至0．5M氯化钠，然后是阳离子交换色谱分离(Biorad Macroprep High S，用从0．5M至3M的氯化钠进行盐梯度)，并用150mM的NaCl进行渗析。MannITC-PEI(25KDa)所含的PEI／MannITC重量比为1．4∶1。这表示平均每隔10个PEI(25KDa)的氮原子被甘露糖改性。
实施例20用(C12CO)2／DNA复合物转染BNL CL．2细胞通过在15mM pH为8．4的Tris／HCl缓冲液中混合pCMVL(30μM磷酸酯)和不同量的鸟氨酰基-半胱氨酸-十二烷酰胺去污剂C12CO(实施例4，步骤4；相当于当量60μMC12CO4)而制备该溶液，并将该溶液在有氧条件下保存24小时。在进行转染18小时之前，将细胞以每穴50，000细胞种在24穴盘中。将等量的复合混合物(相当于每穴2μg的质粒)添加在保存于无血清DMEM介质的细胞中。2．5小时后，加入10％血清。24小时后监测荧光素酶基因的表达。结果如图30所示。
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权利要求
1．一种用于利用核酸分子在体内和体外转染高级真核生物细胞的颗粒，包括一个或多个用有机阳离子分子凝聚的核酸分子，所述颗粒是通过使核酸分子与相同或不同的有机阳离子前体分子复合，而不使核酸分子之间交联，并且在该核酸模板上该前体分子彼此之间共价键合而制备的。
2．如权利要求1所述的转染颗粒，其中所述阳离子分子是通过阳离子去污剂前体分子的二聚或低聚而得到的脂质。
3．如权利要求2所述的转染颗粒，其中该阳离子去污剂前体分子包含a)至少一个用于与一个或多个其它去污剂分子键联的官能团，b)至少一个亲油性基团，c)无毒的受体主链d)用于与核酸分子键联的阳离子基团。
4．如权利要求3所述的转染颗粒，其中该阳离子前体去污剂分子与其它去污剂分子键联的官能团是可二聚或可聚合的官能团，其选自硫醇，酰肼，醛，胺，和被适当取代以提供烯胺的乙烯基。
5．如权利要求4所述的转染颗粒，其中该亲油残基选自亲油的酰胺，酯或醚。
6．如权利要求3所述的转染颗粒，其中用于与核酸分子键联的官能团选自胺或其衍生物。
7．如权利要求6所述的转染颗粒，其中用于与核酸分子键联的官能团是胍。
8．如权利要求1所述的转染颗粒，其中所述有机阳离子前体分子以如下通式Ⅰ表示 其中R1表示(C1-C10-亚烷基)-SH，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基；R2表示-NR4R5，-NHR4R5+，-N(R4)2R5+，-C(=NR4)NR5R6，-C(=X)-C1-C10-亚烷基，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基，并可被至多4个二烷基氨基或一个硫代单糖所取代；R3表示直链或支链的并可任选被最好是一个或多个卤原子或二烷基氨基所取代的C5-C30-烷基，或者表示直链或支链的至多含有10个C=C双键，并可任选被最好是一个或多个卤原子或二烷基氨基所取代的C5-C30-烯基，或者表示直链或支链的至多含有10个C≡C双键，并可任选被最好是一个或多个卤原子或二烷基氨基所取代的C5-C30-炔基，或者表示可任选被取代的C6-C10-芳基，或者表示可任选被取代的C7-C16-芳烷基，或者表示C5-C30-烷基链，该烷基链被至多10个氨基-NR4-所间断并任选含有一个可任选被氨基酸所取代的氨基；R4，R5和R6分别独立地表示氢或C1-C4-烷基；X表示O或S；Y表示C=O或C=S和Z表示O、S或-NR4-。
9．如权利要求8所述的转染颗粒，其中阳离子前体分子对应于如下通式Ⅰ，其中R1表示(C1-C6-亚烷基)-SH，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基；R2表示-NR4R5，-NHR4R5+，-N(R4)2R5+，-C(=NR4)NR5R6，-C(=X)-C1-C4-亚烷基，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基，并可被至多4个氨基-NR4R5或一个硫代单糖所取代；R3表示直链或支链的并可任选被最好是F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C5-C20-烷基，或者表示直链或支链的至多含有5个C=C双键，并可任选被最好是F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C5-C20-烯基，或者表示直链或支链的至多含有5个C≡C双键，并可任选被最好是F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C5-C20-炔基，或者表示可任选被取最好是C1-C4-烷基，F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C6-C10-芳基，或者表示可任选被最好是C1-C4-烷基，F，Cl，Br或-NR4R5所取代的C7-C14-芳烷基，或者表示C5-C20-烷基链，该烷基链被至多10个氨基-NR4-所间断，并任选含有一个可任选被氨基酸所取代的氨基；R4，R5和R6分别独立地表示氢或C1-C4-烷基；X表示O或S；Y表示C=O或C=S和Z表示O，S或-NR4-。
10．如权利要求8所述的转染颗粒，其中所述阳离子前体分子对应于通式Ⅰ，其中R1表示(C1-C4-亚烷基)-SH，其中亚烷基可以是直链或支链的烃基；R2表示-NR4R5，-NHR4R5+，-N(R4)2R5+，-C(=NR4)NR5R6，-C(=X)-C1-C4-烷基，其中烷基可以是直链或支链的烃基，并可被至多4个氨基-NR4R5或一个硫代单糖所取代；R3表示直链或支链的并任选被最好是F，Cl，Br或-NH2所取代的C5-C12-烷基，或者表示C5-C15-烷基链，该烷基链被至多7个氨基-NR4-所间断并任选含有一个可任选被氨基酸半胱氨酸所取代的氨基；R4，R5和R6分别独立的表示氢或甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基或叔丁基；X表示O或S；Y表示C=O或C=S和Z表示O，S或-NR4-。
11．如权利要求8所述的转染颗粒，其中所述阳离子前体分子对应于通式Ⅰ，其中R1表示-CH2-SH；R2表示-NH2，-NH3+，-C(=N+H2)NH2，-C(=O)-C1-C4-直链或支链烷基，并任选被F，Cl，Br或-NH2所取代，或是一个鸟氨酸基或一个S-半乳糖基；R3表示直链或支链的并可任选被最好是F，Cl，Br或-NH2所取代的C6-C15-烷基；Y表示C=O；Z表示O或-NH-。
12．如权利要求8至11中任何一项所述的转染颗粒，其中R2是胍基鸟氨酸。
13．如权利要求8至12中任何一项所述的转染颗粒，其中R3是癸基。
14．如权利要求8至11中任何一项所述的转染颗粒及其可药用盐，其中R1是亚甲基硫醇基，R2是胍基，R3是直链的癸基，Y是羰基，Z是胺基。
15．如权利要求14所述的转染颗粒，其中所述阳离子分子是N-癸基-胍盐-半胱氨酸。
16．如权利要求8至11中任何一项所述的转染颗粒及其可药用盐，其中R1是亚甲基硫醇基，R2是鸟氨酸基，R3是癸基，Y是羰基，Z是胺基。
17．如权利要求16所述的转染颗粒，其中所述阳离子分子是N-癸基-鸟氨酸基-半胱氨酸。
18．如权利要求8至11中任何一项所述的转染颗粒，其中通过硫原子键联的单糖可选自半乳糖，乳糖，葡萄糖，阿拉伯糖，果糖，山梨糖，木糖，核糖，甘露糖，每一种可以是其D-或L-形式。
19．如权利要求1所述的转染颗粒，其中所述阳离子前体分子是多胺。
20．如权利要求19所述的转染颗粒，其中所述阳离子前体分子是精胺衍生物。
21．如权利要求20所述的转染颗粒，其中该阳离子前体分子是精胺-N1，N12-双-半胱氨酸酰胺。
22．如权利要求21所述的转染颗粒，其中所述阳离子分子之间的键合在细胞条件下是可降解的。
23．如权利要求1所述的转染颗粒，其中包括一个单核酸分子。
24．如权利要求1或23所述的转染颗粒，其中所述核酸分子是DNA分子。
25．如权利要求24所述的转染颗粒，其中所述DNA分子是质粒。
26．如权利要求1所述的转染颗粒，其中该核酸分子是RNA分子。
27．如权利要求1至26任何一项所述的转染颗粒，其特征在于它带有一个或多个细胞定向官能团和／或一个或多个可有利于细胞内吞作用的官能团。
28．如权利要求27所述的转染颗粒，其中所述官能团键合于所述阳离子分子上。
29．如权利要求27所述的转染颗粒，其中所述官能团连在除该阳离子分子之外存在的与核酸键联的分子上。
30．如权利要求27所述的转染颗粒，其中所述定向官能团是细胞蛋白质配位体。
31．如权利要求27所述的转染颗粒，其中所述定向官能团是糖基。
32．如权利要求31所述的转染颗粒，其中所述糖是半乳糖。
33．如权利要求31所述的转染颗粒，其中所述糖是甘露糖。
34．如权利要求1所述的转染颗粒，其特征在于它带有一个或多个核内体溶解官能团。
35．如权利要求34所述的转染颗粒，其中所述核内体溶解官能团键合于所述阳离子分子上。
36．如权利要求34所述的转染颗粒，其中所述官能团连在除该阳离子分子之外存在的与核酸键联的分子上。
37．如权利要求34所述的转染颗粒，其中所述核内体溶解官能团是基因融合肽。
38．如权利要求34所述的转染颗粒，其中所述核内体溶解官能团是病毒。
39．如权利要求38所述的转染颗粒，其中所述病毒是腺病毒。
40．一种制备如权利要求1至39中任何一项所述的转染颗粒的方法，其中在适当的缓冲液中向核酸分子中添加阳离子前体分子，使与核酸形成复合物，并使其在核酸模板上与相同或不同的阳离子前体分子共价键合。
41．如权利要求40所述的方法，其中所述阳离子前体分子是亲油的，并在温和的氧化条件下可以共价键合。
42．一种药物组合物，包括药物有效量的权利要求1的转染颗粒，其中所述核酸分子具有治疗活性。
43．如权利要求42所述的药物组合物，其中所述核酸分子是编码有治疗活性蛋白质的质粒。
44．一种将有治疗活性的核酸引入哺乳动物的方法，其中将权利要求1所述的转染颗粒以皮内的方式对所述哺乳动物给药。
45．一种试剂盒，包括一个或多个核酸分子，一个或多个阳离子前体分子，合适的的缓冲液，和其它用于制备、提纯以及在体内和体外使用权利要求1至39中任何一项所述转染颗粒的试剂或机械设备。
46．如权利要求45所述的一种试剂盒，还包括一个或多个用于细胞定向的官能团。
47．如权利要求45所述的一种试剂盒，还包括一个或多个核内体溶解官能团。
全文摘要
用于在体内和体外传送核酸至高级真核生物细胞内的转染颗粒,包括一个或多个由有机阳离子分子凝聚的核酸分子。该分散的稳定的颗粒通过该核酸分子与相同或不同的有机阳离子前体分子之间复合,而不是核酸分子之间交联,并且在该核酸模板上该前体分子彼此之间共价键合而制成。为了明确的细胞定向,该颗粒载有定向分子,例如糖。优选的阳离子前体分子是键合以形成脂质的亲油去污剂。该颗粒优选只含有一个能使其有效用于基因疗法和传送大DNA分子的核酸分子。
文档编号A61K48/00GK1290178SQ98813498
公开日2001年4月4日 申请日期1998年11月28日 优先权日1997年12月4日
发明者让－保罗·贝尔, 托马斯·布辛莱, 厄恩斯特·瓦格纳, 苏珊娜·舒勒 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司, 路易斯帕斯特尔斯特拉斯堡大学