一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染载体的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染 载体的应用。
【背景技术】
[0002] 近些年来，小核酸分子药物得到越来越多的关注与研究。不仅在哺乳细胞上得到 了广泛的研究与应用，也成为抗菌药物研究新的突破点。小核酸分子是通过碱基互补配对 原理，根据细胞内基因组学相关信息，以细胞内增殖、致病等相关基因为靶点，干扰基因的 解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工至输出和翻译等各个环节，从阻断相关基因表达入手，进 而达到治疗作用。然而，一个未经修饰的由10个单体组成的寡核苷酸分子量一般在2_3kDa， 各种化学结构修饰将进一步增加其大小，核酸分子量增大，细胞摄入率降低，从而不能更好 地进入细胞而发挥治疗作用。此外，在细菌中，由于细菌的细胞壁具有不同寻常的结构，这 种有效的屏障会使外来分子难以透过，包括小分子化合物和小核酸分子，特别是脂多糖组 成的革兰阴性菌的外膜也是阻碍分子进入细菌的一个主要障碍。
[0003] 多种反义基因靶向核酸药物递药系统已成功地应用于真核细胞的基因治疗，然而 由于细菌细胞和真核细胞尺寸、结构组成不同，这些适用于真核细胞的基因递药系统并不 完全合适。研究表明，除了脂质体递药系统之外，透膜肽(CPPs)也可用于抗菌反义寡核苷酸 分子的运载工具，但相关研究却很少，目前仅发现HIV-TAT，pVEC和(RXR)4三种透膜肽通过 与反义寡核苷酸共价结合，可实现反义抗菌分子的递送。但这种共价结合导致合成成本较 高，载药量低及工业化生产困难等问题，极大地限制了小核酸药物抗菌的发展。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之一是提供一种多肽。该多肽的结构 为：
[0005]
[0006] i = 3,6或 10;
[0007] XP3 为-R-K-R，Υρ3 为-R-W-L-A-W-L;
[0008] ΧΡ6 为-R-R-K-R，Υρ6 为-W-L-A-W-L-Ac;
[0009] Xp1q 为-R-R-H-R，Υρ3 为-W-L-A-W-L-Ac。
[0010] 本发明同时提供了多肽-核酸分子复合物的制备方法:方法包括多肽与脂质混合 后加入核酸分子制备多肽-核酸分子复合物;所述脂质为D0TAP、D0PC、D0DAG、D0PE、DMTAP、 DPPC、RPR 209120、Chol、Cardiolipin、D0DMA、DSPC、DGG、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、PEG2000-C-DMA、AtuFECTO1、DphyPE、DSGLA或DSPE。
[0011] 进一步，本发明的制备方法中盐离子浓度小于0.2mM。
[0012]进一步，本发明的制备方法中多肽与核酸中N与P的摩尔比为8:1，脂质的质量与核 酸质量相等。
[0013 ] 本发明的核酸分子为asRNA、s iRNA、miRNA或质粒DNA 〇
[0014] 本发明还提供了上述多肽作为细菌转染载体的应用。
[0015] 本发明同时还提供了上述多肽作为哺乳细胞转染载体的应用。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0017] 脂质体转染具有毒性;慢病毒转染有免疫原性;共价结合方式的多肽转染合成成 本高，而且转染对象单一。本发明的转染体系，能够转染多种类型小核酸分子，分枝状肽与 小核酸分子以非共价方式结合形成纳米粒，纳米粒制备简单;不仅适用于细菌的转染，同时 也适用于真核细胞的转染。
【附图说明】
[0018] 图1为P3的质谱谱图；
[0019] 图2为P3的高效液相图谱；
[0020] 图3为P6的质谱谱图；
[0021]图4为P6的高效液相色谱谱图；
[0022]图5为P10的质谱谱图；
[0023]图6为P10的高效液相色谱谱图；
[0024]图7为Pep3/PS-0DN/D0TAP纳米复合物的电镜照片；
[0025] 图8为Pep6/PS-0DN/D0TAP纳米复合物的电镜照片；
[0026] 图9为Pepl0/PS-0DN/D0TAP纳米复合物的电镜照片；
[0027] 图 10 为 Pep3、Pep6、Pep 10 包裹 PS-0DN 的包封率；
[0028] 图 11为Pep3/PS-0DN/D0TAP、Pep6/PS-0DN/D0TAP、Pepl0/PS-0DN/D0TAP 纳米复合 物4°C保存4周的粒径稳定性；
[0029] 图12为Pep3/PS-0DN/D0TAP纳米复合物的细菌摄取检测结果，其中A为PS-0DN对照 组;B为实验组，结果显示P印3/PS-0DN/D0TAP纳米复合物可被细菌高效摄取；
[0030] 图13为Pep6/PS-0DN/D0TAP纳米复合物的细菌摄取检测结果，其中A为PS-0DN对照 组;B为实验组，结果显示P印6/PS-0DN/D0TAP纳米复合物可被细菌高效摄取；
[0031] 图14为Pepl0/PS-0DN/D0TAP纳米复合物的细菌摄取实验结果，其中A为PS-0DN对 照组;B为实验组，结果显示P印10/PS-0DN/D0TAP纳米复合物可被细菌高效摄取；
[0032] 图 15为anti-rpoD Pep3/PS-0DN/D0TAP纳米复合物（浓度0·5μΜ)对ESBLs-E.coli 生长的抑制实验结果；
[0033] 图 16为anti-rpoD Pep 10/PS-0DN/D0TAP纳米复合物（浓度0 · 5μΜ)对ESBLs-E · co 1 i 生长的抑制实验结果；
[0034] 图17为Pepl0/PS-0DN/D0TAP纳米复合物抑制细菌靶基因 mecA mRNA的水平实验结 果；
[0035] 图18为PeplO/siRNA/DOTAP纳米复合物抑制哺乳细胞靶基因 GATOH mRNA的水平实 验结果。
【具体实施方式】
[0036] 一、本发明多肽的结构 [0037]表1本发明多肽的结构
[0038]
[0039]二、本发明多肽的合成方法及表征
[0040] P3、P6和P10同属于两亲性肽，以P6的合成方法为例（合成方法采用Fmoc固相合成 法)。
[0041] 1、合成原料及相关试剂：
[0042 ]保护氨基酸原料:Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Trp (BOC) -OH，Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Lys(BOC)-OH，Fmoc-L-Lys(BOC)-OH，Fmoc-L-Lys(DDE)-OH，Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH等（成都诚诺）；缩合试剂:HBTU(昊帆生物科技），DIEA(国药集团上海化学试 剂公司）；溶剂:DMF(Dikma)，DCM(Dikma)，甲醇(Fisher )，乙腈(Fisher);树脂：取代度为 0.28mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin(天津市南开合成科技有限公司）；脱保护试剂:哌啶 (国药集团上海化学试剂公司）；检测试剂:苯酚试剂（自配），吡啶试剂（自配），茚三酮试剂 (自配）；切割试剂:TFA(J.T.Baker)，TIS(ALDRICH)，EDT，无水乙醚(上海试一化学试剂有限 公司）；精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司）；仪器设备：十二通道半自动多肽合成 仪，SHMADZU高效液相色谱仪（型号：制备型，分析型，软件:Class-VP.Sevial System，厂 商：SHMADZU);LABC0NC0冻干机（型号：Freezone · Plus · 6，厂商：LABC0NC0，离心机（上海安 亭科学仪器厂型号:TDL-40B)。
[0043] 2、合成过程：
[0044] (1)树脂溶涨
[0045] 将Rink Amide-MBHA Resin放入反应管中，加 DMF(15ml/g)，振荡60min.
[0046] (2)脱氨基保护
[0047] 去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液（15ml/g)，5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液（15ml/ g)，15min.
[0048] (3)检测
[0049] 抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴， 105°C - 110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应。
[0050] (4)清洗
[0051 ] DMF (1 Oml/g)清洗两次，甲醇（1 Oml/g)清洗两次，DMF (1 Oml/g)清洗两次。
[0052] (5)接第一个氨基酸
[0053] 通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量Fmoc-L-Lys(DDE)-OH，3倍摩尔过量HBTU， 再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。吡啶：乙酸酐=