干转染组合物及其制备和使用方法
【专利说明】干转染组合物及其制备和使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年11月5日提交的美国临时专利申请序列 No.61/900,232的申请日期的优先权，所述申请的公开内容通过引用并入本文。
[0003] 引言
[0004] 能够有效引入外源分子，诸如DNA、SiRNA、蛋白质等至生物细胞中在生物学和生物 工程中是非常重要的。转染是指转移核酸至细胞中。用核酸分子有效转染生物细胞是阐明 基因功能如何在复杂的细胞环境中起作用和可如何调控其活性以用于治疗干预的必要前 提。细胞转染通常用于基础生物学研究和药学开发中。
[0005] 可将核酸通过将核酸与带电脂质、类脂质、肽、聚合物或其混合物预先复合而体外 和体内递送至细胞。此类转染试剂可商购获得并且广泛用于递送核酸至培养中的细胞。暴 露于转染试剂-核酸复合物的细胞可通过内吞或其它方式内化这些复合物。
[0006] 概述
[0007] 提供干聚合转染剂组合物，如冻干聚合转染剂组合物。所述干组合物包含聚合转 染剂和缓冲液。在一些情况下，所述组合物还包含一种或多种核酸。还提供了制备和使用所 述组合物的方法，以及包括所述组合物的试剂盒。
[0008] 附图简述
[0009] 图1描绘了为了测定转染效率而在转染后72小时转染细胞的荧光激活细胞分选 (FACS)分析的结果。阳性细胞％表示为条形图（左Y-轴)并且平均荧光强度(MFI)表示为线 图（右Y-轴）。
[0010] 图2描绘了为了测定产生的慢病毒量而由冻干包装组分产生的慢病毒储液的定量 RT-PCR (qRT-PCR)的结果。
[0011] 图3描绘了为了测定产生的慢病毒滴度而用冻干包装组分产生的慢病毒储液的每 ml测定感染单位(IFU/ml)的结果。
[0012] 图4描绘了当用另外的样品再测试一次时(N = 8液体;N=13干燥），测定由冻干包 装组分产生的慢病毒储液的转染效率(上图：阳性细胞％和1?1)和拷贝/ml的病毒（下图： qRT-PCR)的结果。
[0013]图5提供了根据本发明的一个实施方案的多孔基质的图。
[0014] 详述
[0015] 提供了干聚合转染剂组合物，如冻干聚合转染剂组合物。所述干组合物包含聚合 转染剂和缓冲液。在一些情况下，所述组合物还包含一种或多种核酸。还提供了制备和使用 所述组合物的方法，以及包括所述组合物的试剂盒。
[0016] 在详细描述本公开的方法之前，应理解所述方法不限于所述的特定实施方案，因 此当然可以发生变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定实施方案，并非旨在 进行限制，因为本发明的范围将只由所附权利要求书限定。
[0017] 当提供数值范围时，应理解该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单 位的十分之一，除非本文另外清楚地规定）以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值 都涵盖在本方法中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也 涵盖在本方法中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之 一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本方法中。
[0018] 本文中提供了某些在数值之前加有术语"约"的范围。术语"约"在本文中用于为其 之后的确切数字以及与所述术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字 是否与明确引用的数字接近或近似中，接近或近似的未引用的数字可以是在其出现的上下 文中提供明确引用的数字的基本等同物的数字。
[0019] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本方法所属领域中普通 技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何 方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述代表性说明方法和材料。
[0020] 本说明书中引用的所有公布和专利通过引用并入本文，就如同特定地及个别地表 明各个公布或专利通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与公布一起被引用 的方法和/或材料。任何公布的引用是针对其提交日期之前的公开内容，并且不应当解释为 本发明无权先于因先前发明所作的此类披露。此外，提供的公布的日期可与可能需要独立 确认的实际公布日期不同。
[0021] 应指出的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文明确地另有说明，否 则单数形式"一种/个(a)"、"一种/个(an)"和"该(the)"包括复数指示物。还应指出，可撰写 权利要求来排除任何可选元素。这样，该陈述意图用作与权利要求要素的引用联合使用此 类排他性术语"单独地"、"仅仅"等或使用"否定(negative)"限制的在先基础。
[0022]应理解，也可在单个实施方案中组合地提供本发明的某些特征，所述特征为清楚 起见描述于分开的实施方案的上下文中。反之，为简明起见而在单个实施方案的语境中描 述的本方法的多个特征也可以分开或以任何合适的子组合提供。所述实施方案的所有组合 明确地包括在本发明中并且公开于本文中，就如同各个和每一个组合被个别地且明确地公 开一样，至此类包括可操作的工艺和/或装置/系统/试剂盒的程度。此外，描述此类变量的 实施方案中所列的所有子组合还明确地包括在本方法中并且公开于本文中，就如同各个和 每一个子组合被个别地且明确地公开于本文中一样。
[0023]如在阅读本公开内容后对于本领域技术人员是很显然的，本文中描述的和例举的 单个实施方案的每一个具有可容易地与其它几个实施方案的任一个的特征分开或组合的 独立的组分和特征而不背离本发明的范围或精神。可以以所引用事件的顺序或以逻辑上可 能的任何其它顺序进行任何引用的方法。
[0024]干转染剂组合物
[0025] 如上所概述，本发明的各方面包括干聚合转染剂组合物。由于所述组合物被干燥， 所以它们基本上(如果不完全)不含未结合的水。基本上不含未结合的水意指所述组合物包 含0.1重量％或更少，诸如0.01重量％或更少，包括0.001重量％或更少的未结合的水，包括 在一些情况下无未结合的水。干组合物可为颗粒组合物。颗粒组合物是由颗粒组成的组合 物，其中所述颗粒的尺寸可变化，在一些情况下范围为5至lOOOnm、诸如10至500nm并包括50 至400nm。
[0026] 在一些情况下，干聚合转染剂是冻干组合物。冻干意指所述组合物已经经受冷冻 干燥条件，使得所述组合物可被描述为冷冻-干组合物。适合的冷冻干燥条件的实例在下文 提供。
[0027] 本文所述的干组合物包含聚合转染剂。聚合转染剂意指一种或多种具有转染活性 的聚合物，即当与核酸合并和与细胞接触时，它们增强运输核酸至细胞中。增强的幅度可变 化，其中在一些情况下如与不存在转染剂的适合对照相比，增强的幅度为2倍或更大、诸如3 或5倍或更大、包括10-倍或更大。
[0028] 由于转染剂是聚合的，它们是由较小单元即单体残基的多个重复组成的大分子。 在一些情况下，聚合转染剂是杂聚物，并且在一些情况下是聚(β氨基酯）及其盐和衍生物。 目标聚合转染剂是可生物降解和生物相容的。在一些情况下，聚合转染剂的聚合物在聚合 物的主链中具有一个或多个叔胺，诸如每重复主链单元一个或两个叔胺。所述聚合物还可 为共聚物，其中组分之一是聚(β_氨基酯）。本发明的聚合物由下式的任一种表示：
[0029
[0030] 其中A和B是可为任何取代或未取代、支化或未支化碳原子或杂原子链的连接子。 所述聚合物的分子量的范围可为l〇〇〇g/mol至20，000g/mol、诸如5000g/mol至15 ,OOOg/ mol。在某些实施方案中，B是一至十二个碳原子的烷基链。在其它实施方案中，B是含有总共 一至十二个碳原子和杂原子的杂脂族链。基团RjPR 2可为各种各样取代基的任一种。在某些 实施方案中，RdPR2可含伯胺、仲胺、叔胺、羟基和烷氧基。在某些实施方案中，所述聚合物是 胺-封端的;并且在其它实施方案中，所述聚合物是丙烯酸酯化封端的。在一些情况下，基团 心和/或1? 2与连接子A形成环状结构。含有此类环状部分的聚合物具有在较低pH下更可溶的 性质。目标聚合物是那些不溶于处于生理pH(pH 7.2-7.4)的水溶液中并且可溶于处于低于 生理pH(pH〈7.2)的水溶液中的聚合物。其它目标聚合物是那些可溶于处于生理pH(pH 7.2-7.4)和低于其的水溶液中的聚合物。在一些情况下，聚合转染剂是美国专利No. 6，998，115 和7,427,394中描述的聚合物;其公开内容通过引用并入本文。这些专利中描述的一种特异 性目标转染剂是XFECT?转染剂（Clontech ,Mountain View CA) 〇
[0031] 干组合物中的聚合转染剂的量可变化。尽管所述组合物中的聚合转染剂的量可变 化(并且可基于多种因素诸如但不限于转染剂的特定类型、核酸类型、靶细胞类型、组合物 中的其它组分等），但在一些情况下干组合物中存在的聚合转染剂的量的范围为5至75重 量％，诸如5至50重量％并且包括10至30重量％，如25至27.5重量％。
[0032] 除了聚合转染剂之外，本文所述的干组合物还包含缓冲液组分。所述缓冲液组分 可变化，其中目标缓冲液包括但不限于:磷酸钾如磷酸钠或钾，柠檬酸盐如柠檬酸钠或钾， 马来酸，乙酸盐如乙酸钠、钾或铵，三_(羟甲基)_氨基甲烷(tris)，三(羟甲基）甲基甘氨酸 (Tri cine )，HEPES，MOPS等。干组合物中存在的缓冲剂的量可变化。在一些情况下，选择该量 使得当将Iyg干组合物与Ι0μ1水合并时，缓冲液在所得水性组合物中的浓度范围为50至 500mM、诸如约75至350mM并包括约225至275mM，如250mM。干组合物中缓冲组分的量可变化， 其范围在一些情况下为10至95重量％、诸如25至90重量％且包括50至80重量％，如72.5% 重量％。在某些实施方案中，所述缓冲剂将以足以提供在与水合并后从干组合物制备的所 得水性组合物中范围为约5.0至10.0、诸如6.0至9.5的pH的量存在。
[0033] 在一些情况下，干组合物包含冷冻保护剂。冷冻保护剂意指用于在干燥期间如冷 冻-干燥过程中保护所述组合物组分的物质。在一些情况下，冷冻保护剂是也不用作缓冲剂 的化合物。适合的冷冻保护剂包括但不限于:二醇，诸如乙二醇、丙二醇和甘油，一种或多种 糖(如一种或多种二糖，诸如海藻糖、松三糖(melizitose)、棉子糖），其中所述糖可与一种 或多种多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)等混合。在那些包括冷冻保护剂的实施方案中，冷冻保 护剂可以各种量存在，其范围在一些情况下为0.01至90重量％，诸如0.05至50重量％并包 括0.1至10重量％。在一些情况下，所述组合物不含冷冻保护剂，其中它们不包含至少不是 用作所述组合物组分所用的冷冻保护剂的量的冷冻保护剂。在此类情况下，所述组合物中 冷冻保护剂的量如果存在为1.0重量％或更少、诸如0.5重量％或更少、包括0.1重量％或更 少。
[0034] 除了聚合转染剂和缓冲液之外，干组合物还可包含多种不同的组分，诸如但不限 于:粘合剂、填充剂、增量剂、张度剂、稳定剂、表面活性剂、增溶剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐 剂等。当存在时，这些组分可构成组合物的0.1至99重量％、诸如1至50重量％、包括2至10重 量％。在一些情况下，干组合物仅由转染剂组分和缓冲液组分构成。
[0035] 在一些情况下，干组合物包含一种或多种核酸。目标核酸包括由脱氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸或其组合组成的任何长度的聚合物，其中核酸长度可变化，如10个碱基或更长、 20个碱基或更长、50个碱基或更长、100个碱基或更长、500个碱基或更