用于肝再生的负载vegf的水凝胶纤维膜及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗材料技术领域，特别涉及一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肝切除后余肝再生不足是影响安全肝切除的重要因素，因此提高术后余肝再生能力是一个亟待解决的问题。生长因子具有促进余肝再生的作用，目前将外源性生长因子输送至肝脏的策略主要包括直接注射法、转染生长因子基因至作用细胞、高分子可降解微球包裹生长因子等。但是，(1)生长因子在体内半衰期非常短，大多在数秒至数分钟内失去活性，因此直接注射后生长因子会迅速失活；(2)采用转染方法具有转染效率低下和细胞毒性的缺点；(3)高分子可降解微球包裹生长因子在于生长因子容易失活，以及分子量大的生长因子在微球内不宜释放。
[0003]VEGF(vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子)和HGF(hepatocyte growth factor，肝细胞生长因子)已被证明可促进肝组织再生。近期研究证实VEGF在肝窦内皮细胞(SECs)的分裂、迀移过程中扮演着重要的角色。通过结合SECs上面VEGF受体和KDR/flk-Ι)调控血管通透性。我们前期研究显示大鼠肝切除后前24小时内肝脏内源性VEGF表达显著降低，影响肝再生过程中早期SECs的增殖，表明VEGF在促进肝再生过程中起着重要作用。Assy等首次采用全身系统给予外源性VEGF促进大鼠30%肝切除后余肝再生。此后多个研究证实采用上述方法给予外源性VEGF可促血管再生进而促进肝再生。然而，采用静脉注射给药促进肝再生的效率低。由于肝脏血流丰富，以往采用局部给药方式所提供的促进肝再生的药物不易在肝脏停留，导致作用浓度不足而缺乏有效性。因而，解决有效控制肝脏局部释放生长因子这一问题将大大提高临床肝切除后再生的成功率，并扩大肝切除作为临床治疗手段的范围，以挽救更多肝癌患者。因此目前亟待找到一种新的将外源性生长因子输送至肝脏的策略方法。
【发明内容】
[0004]为克服上述现有生长因子给药技术效率低、靶向性差的缺点及不足，本发明的首要目的在于提供一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法。本发明结合电纺丝技术的优势和天然可降解生物材料的特点，设计了一种新型电拉伸水凝胶纤维的制备方法。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜。将包裹生长因子的纤维膜贴附于术后肝脏创面并控释生长因子，具有高效促进余肝再生的性能。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，包括以下步骤:
[0007]负载步骤:
[0008]所述的水凝胶纤维膜为海藻酸钙水凝胶纤维膜、纤维蛋白水凝胶纤维膜、明胶水凝胶纤维膜或透明质酸水凝胶纤维膜中的一种。
[0009]所述的海藻酸钙水凝胶纤维膜，可以通过下述制备方法获得:将1.5-3.0被％藻酸盐和0.1-0.6wt%聚氧乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，使用20-100mMCaCl2稳定，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得海藻酸盐水凝胶纤维膜。
[0010]所述的纤维蛋白水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得:从含有0.67wt%纤维蛋白原，1.0被％藻酸钠和0.lwt%聚氧化乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，用含有50mMCaCld^ 5U/ml的凝血酶中交联20分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得纤维蛋白水凝胶纤维膜。
[0011]所述的明胶水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得:通过3.2wt%的甲基丙烯酸酉旨胶，0.9界1:%藻酸盐，0.lwt%聚氧化乙稀和0.4wt%紫外发光齐lj (Irgacure 2959)，于50mMCaCl2S液交联20分钟，然后在365nm波长的紫外光下照射10分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得明胶水凝胶纤维膜。
[0012]所述的透明质酸水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得:以lwt%硫醇化透明质酸，0.7*1:%藻酸盐和0.2wt%聚氧化乙稀，在SOmMCaCljP lwt%聚乙二醇二丙稀酸酯(PEGDA)中交联进行制备，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得透明质酸水凝胶纤维膜。
[0013]上述水凝胶纤维膜冻干后，将合适浓度和体积的生长因子溶液加到冻干的水凝胶纤维膜，即每张膜规格为lcmX0.5cm，加入外源性VEGF lOOOng/张。待生长因子完全吸收后，再冻干即获得负载生长因子的水凝胶纤维膜。该水凝胶纤维膜还可加载其他生长因子包括HGF等，剂量范围为500-1000ng。每张膜的尺寸可以根据手术创面任意更改大小，通常为lcmX0.5cm-2cmX2cm，这些尺寸适用于大鼠动物实验。临床使用时可制备更大的尺寸。
[0014]为了调节生长因子释放速率，在冻干的水凝胶纤维膜上可以采取溶液喷涂或浸涂方法、涂上一层可降解的聚己内酯/聚乳甘酸涂层。溶液浓度可以使用5-12.5wt%。
[0015]本发明中的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法完全使用水溶剂，避免有机溶剂，因此可用此方法在水凝胶纤维中包裹生长因子，并最小程度影响其生物活性。
[0016]一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜由上述制备方法获得。
[0017]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0018]本发明结合电纺丝技术的优势和天然可降解生物材料的特点，设计了一种新型电拉伸水凝胶纤维的制备方法。所述的制备方法的重要特征就是利用电场和单向机械拉伸促使纤维束内部分子链进行取向，使得纤维内部和表面有纳米取向特征，并且纤维的机械和生物性能优越。目前已用这一方法制备出几种天然高分子水凝胶纤维，包括海藻酸、胶原蛋白、血纤蛋白、透明质酸及其混合纤维等。这些天然高分子原材料已广泛用于临床，并有很好的安全使用纪录，因此有较好的临床转化前景。
【附图说明】
[0019]图1为水凝胶纤维膜的制备及其特性；其中，a为电纺水凝胶纤维膜的示意图，b为海藻酸钙的水凝胶纤维；c为纤维蛋白的水凝胶纤维；d_f为水凝胶纤维表面纳米取向特征，d为海藻酸钙的水凝胶纤维表面纳米取向特征，e为纤维蛋白的水凝胶纤维表面纳米取向特征，f透明质酸的水凝胶纤维表面纳米取向特征；g为冻干纤维束外观；h为冻干纤维膜外观为水凝胶纤维制成管状结构的外观为单根纤维重叠后在偏光显微镜下现示完全消光，证实纤维内部高度取向。
[0020]图2为带聚己内酯(PCL)/聚乳甘酸(PLGA)涂层的水凝胶纤维膜对生长因子释放速率的影响结果图。
[0021]图3为干预组和对照组术后肝转氨酶变化趋势图；其中，a为ALT变化趋势图；b为AST变化趋势图。
[0022]图4干预组和对照组术后余肝内源性VEGF mRNA表达规律图。
[0023]图5干预组和对照组术后余肝内源性flt-1和KDR/flk-lmRNA表达规律图；其中，a为内源性flt-1表达规律图，b为KDR/f lk-lmRNA表达规律图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0025]实施例1
[0026]1.制备方法及原料:
[0027]海藻酸钙水凝胶纤维膜:将1.5-3.0wt %藻酸盐和0.1-0.6wt %聚氧乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，使用20-100mMCaCl2稳定，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、制备海藻酸盐水凝胶纤维膜；
[0028]纤维蛋白水凝胶纤维膜:从含有0.67界1:%纤维蛋白原，1.0界1:%藻酸钠和0.lwt%聚氧化乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，用含有50mMCa