萘啶酮类化合物、及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种萘啶酮类化合物、及其制备方法和应用。

背景技术：

丙型肝炎是常见的血源性传染疾病，其病因是丙型肝炎病毒(hapatitiscvirus，hcv)的感染。hcv感染人肝细胞，导致慢性肝炎，肝纤维化，肝硬化和肝癌。全球范围内约有1.7亿人感染丙肝病毒，我国普通人群抗hcv阳性检出率达3.2％，预计hcv感染者在4千万以上。hcv属黄病毒科肝炎病毒属，病毒粒子球形，有包膜。基因组为单正链rna，全长约9.6kb，有两侧非编码区(utr)和中间以开放读码框(orf)组成。5’utr带有内部核糖体进入位点(ires)，非常保守；3’utr与复制起始有关。orf编码3010-3033个氨基酸的nh2-c-e1-e2-p7-ns2-ns3-ns4a-ns5a-ns5b-cooh多聚蛋白前体。

ns3蛋白酶也称丝氨酸蛋白酶，位于631个氨基酸残基构成的ns3蛋白的n末端区，由180氨基酸构成，是一种序列相对保守的多功能蛋白酶。ns3n端180个氨基酸与ns2可构成含zn²⁺的金属蛋白酶，催化ns2-3的裂解，与ns4a结合则构成丝氨酸蛋白酶，可以水解病毒前体蛋白，ns3-ns4a-ns4b-ns5a-ns5b间的连接，直接决定着病毒各功能蛋白的成熟，而且ns3蛋白酶还直接影响着ns3c端螺旋酶/ntpase和ns5brna复制酶活性，因此，抑制其活性可有效地抑制病毒前体蛋白成熟和病毒复制，是丙型肝炎治疗药物研究的重要靶点。目前已成功的开发了多种ns3/4a蛋白酶抑制剂，已上市的有特拉匹韦、波普瑞韦和司美匹韦。然而，由于ns3/4a蛋白酶抑制剂耐药屏障低，易交叉耐药，因此开发结构新颖、价格低廉的新型hcvns3/4a丝氨酸蛋白酶抑制药物显得十分必要。

微生物次级代谢产物历来是天然药物的重要来源，天然产物具有独特的 生物活性机制，具有立体构型的优势。微生物药物来源丰富、化学结构独特，因此筛选新的菌株合成生物体原本难以合成的化合物机率较大，并且微生物发酵及代谢产物分离纯化过程具有条件温和、环境友好、成本低、可在人工控制的条件下实现大规模生产等优点。

技术实现要素：

本发明提供了一种萘啶酮类化合物、及其制备方法和应用。萘啶酮类化合物1，2-二甲基-5-(三氮环杂丙烷)-2，3-二氢-2，7-萘啶-4(1h)-酮对丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶具有一定的抑制作用；且该化合物的制备方法具有材料来源方便、制备周期短、绿色环保和工艺简单的优势。

本发明提供了一种如式i所示的萘啶酮类化合物1，2-二甲基-5-(三氮杂环丙烷)-2，3-二氢-2，7-萘啶-4(1h)-酮：

本发明还提供了一种上述式i化合物的制备方法，其包括以下步骤：发酵培养毕赤属真菌(pichia)，收集菌体，将菌体与有机溶剂混合，破碎菌体，固液分离，收集上层清液，即可。

本发明所述的毕赤属真菌可为本领域常规的毕赤属真菌，只要属于毕赤属真菌属并且在发酵过程中能够产生式i化合物，即可。所述的毕赤属真菌较佳地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏的菌株编号为2.3663的蒙毕赤酵母(pichiaguilliermondii)。

本发明所述的发酵培养毕赤属真菌的发酵条件可采用本领域毕赤属真 菌发酵培养的常规发酵培养条件，其中，发酵培养基较佳地为：葡萄糖25～30g/l(更佳地为30g/l)，(nh4)so415～20g/l(更佳地为20g/l)，酵母提取物8～10g/l10g/l)，mgso4·7h2o0.8～1g/l(更佳地为1g/l)，feso4·7h2o0.05～0.08g/l(更佳地为0.05g/l)，水(优选去离子水)，g/l是指各组分与发酵培养基的质量体积比；所述的发酵培养基的ph值为5～7.5(更佳地为5.5～6.5)。培养温度较佳地为25～37℃，更较佳地为30～35℃；培养时间较佳地为144～240h，更较佳地为168h；震荡速度较佳地为150～250r/minr/min，更较佳地为220～240r/min。

其中，在所述的发酵培养毕赤属真菌之前还可包括毕赤属真菌菌株种子液的制备过程，其制备的步骤和条件可以参照本领域的常规选择，本发明较佳地包括以下步骤：将保藏在甘油管的毕赤属真菌菌株接种至种子培养基中培养，即可；其中，所述的种子培养基较佳地为：酵母提取物5～15g/l(更佳地为5g/l，葡萄糖10～30g/l(更佳地为20g/l)，蛋白胨5～15g/(更佳地为10g/l)，水(优选去离子水)，g/l是指各组分与种子培养基的质量体积比；所述的种子培养基的ph为5～7.5(更佳地为5.5)。所述的甘油管中为甘油水溶液，所述的甘油水溶液的浓度可为本领域常规的浓度，较佳地为20％的甘油水溶液，所述的百分比为体积百分比。所述的种子液的制备过程中，培养温度较佳地为25～35℃，更佳地为30℃；震荡速度较佳地为150～250r/min，更佳地为220r/min；培养时间较佳地为16～36h，更佳地为24h。在所述的种子液制备好之后，还可包括将所述的种子液接种至所述的发酵培养基中的过程，其中，所述的接种的方法和条件可以参照本领域的常规进行选择，所述的种子液与所述的发酵培养基的体积比可为本领域常规的体积比，本发明较佳地1∶100～1∶250，较佳地为1∶200～1∶220。

本发明所述的式i化合物的制备方法中，所述的收集菌体的方法可参照本领域的常规选择，一般为将发酵培养毕赤属真菌(pichia)得到的发酵液经固液分离，得到所述的菌体；其中，所述的固液分离的方法可参照本领域的常规选择，较佳地为离心方法；所述的离心方法中，转速较佳地为3000～ 5000r/min，离心时间较佳地0.5～1h。

本发明所述的式i化合物的制备方法中，所述有机溶剂可参照本领域的常规进行选择，较佳地为酮类有机溶剂和/或醇类有机溶剂；所述的酮类有机溶剂较佳地为丙酮；所述的醇类有机溶剂较佳地为甲醇或乙醇。所述的破碎菌体的方法可采用本领域常规破碎菌体的方法，较佳地为超声处理法或高压匀浆破壁法。所述超声处理法的条件可参照本领域常规进行选择，超声频率较佳地为40～70khz(更佳地为42khz)；超声处理时间较佳地为60～120min(更佳地为40min)；超声处理的次数较佳地为3次。所述的固液分离的方法可参照本领域的常规选择，较佳地为离心方法；所述的离心的条件为，转速较佳地为3000～5000r/min，离心时间较佳地为0.5～1h。

本发明所述的式i化合物的制备方法，还可进一步包括浓缩所述的上层清液，得式i化合物粗品的过程。所述的浓缩可采用本领域常规的浓缩技术，较佳地为减压浓缩。所述的减压浓缩的条件可参照本领域的常规进行选择，温度较佳地为40～50℃(优选40～45℃)，真空度较佳地为700～800mmhg(例如758mmhg)。

本发明还提供了一种式i化合物的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将上述式i化合物粗品采用反相硅胶柱层析分离，以流动相为水进行洗脱，或者以流动相依次为水、甲醇-水混合液、甲醇进行梯度洗脱，收集含式i化合物的洗脱液并浓缩；

(2)将步骤(1)所得产物采用反相硅胶柱层析进行分离纯化，流动相为体积含量为15％的甲醇水溶液，收集含式i化合物的洗脱液并浓缩；

(3)将步骤(2)所得产物采用反相硅胶柱层析进行分离纯化，流动相为体积含量为10％的甲醇水溶液，收集含式i化合物的洗脱液并浓缩。

步骤(1)中，所述的反相硅胶层析柱可参照本领域常规进行选择，较佳地以十八烷基硅烷键合硅胶(ods-c18)为填充剂，更佳地为ymc公司生产的批号为9955的ods-c18。流动相的流速可参照本领域的常规进行选择，本发明较佳地10～40ml/min，更佳地10ml/min。所述的浓缩可采用 本领域常规浓缩技术，较佳地为减压浓缩。所述反相硅胶层析柱的填充物与步骤(1)所得产物的质量比可参照本领域常规进行选择，本发明较佳地为6∶1～1∶1，更佳地为4.4∶1。

步骤(1)中，当流动相为水进行洗脱时，所述的水与步骤(1)所得产物的体积质量比可参照本领域常规进行选择，本发明较佳地为80～40ml/g，更佳地为55ml/g。

步骤(1)中，当流动相依次为水、甲醇-水混合液、甲醇进行梯度洗脱时，所述的流动相较佳地为梯度依次为水、20％、40％、50％、60％、80％和100％的甲醇-水混合液，其中，所述的百分比为甲醇占甲醇-水混合液的体积比。每个梯度洗脱液与步骤(1)所得产物的体积质量比可参照本领域常规进行选择，本发明较佳地为80～40ml/g，更佳地为55ml/g。所述的收集含式i化合物的洗脱液，较佳地为收集流动相较佳地为收集0％甲醇-水混合液。

步骤(1)所得产物的储存条件一般为4℃下进行低温保存。

步骤(2)中，所述的反相硅胶层析柱可参照本领域常规进行选择，较佳地为aq-c18反相硅胶层析柱；所述反向硅胶层析柱的柱内径×柱长较佳地为14×150～14×250mm；所述的aq-c18的粒径较佳地为10μm。流动相的流速可参照本领域的常规进行选择，本发明较佳地为2～4ml/min，更佳地为4ml/min。柱温可参照本领域常规进行选择，较佳地为40℃。进样量可参照本领域常规进行选择，本发明优选400μl；所述的式i化合物的出峰时间较佳地为9.5～10.5min(更较佳地为10min)。化合物的检测波长可参照本领域常规进行选择，一般为210nm。所述的浓缩可采用本领域常规浓缩技术，较佳地为减压浓缩。所述的减压浓缩的条件可参照本领域常规进行选择，温度较佳地为40～50℃，真空度较佳地为700～800mmhg。

步骤(3)中，所述的反相硅胶层析柱可参照本领域常规进行选择，较佳地为aq-c18反相硅胶层析柱；所述反向硅胶层析柱的柱内径×柱长较佳地为14×150～14×250mm；所述的aq-c18的粒径较佳地为5μm。流动相 的流速可参照本领域的常规进行选择，本发明较佳地为2～4ml/min，更佳地为4ml/min。化合物的检测波长可参照本领域常规进行选择，一般为210nm。进样量可参照本领域常规进行选择，本发明优选400μl；所述的式i化合物的出峰时间较佳地为15.0～16min(更较佳地为15.5min)。所述的浓缩可采用本领域常规浓缩技术，较佳地为减压浓缩。柱温可参照本领域常规进行选择，较佳地为40℃。所述的减压浓缩的条件可参照本领域常规进行选择，温度较佳地为40～50℃，真空度较佳地为700～800mmhg。

步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)中可以采用液相检测洗脱液中是否含式i化合物，所述的液相检测的检测条件较佳地为：色谱柱：ultimateaq-c18，ultimateaq-c18的粒径为5μm，柱内径×柱长为14×150mm；检测波长：210nm，流动相：a)甲醇b)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：10μl，洗脱浓度：30％(v/v)甲醇。式i化合物的出峰时间一般为7.4～7.5min(较佳地为7.45min)。

本发明还提供了一种式i化合物在制备丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种式i化合物在制备用于治疗和/或预防与丙型肝炎病毒相关的疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的式i化合物，和药学可接受的载体和/或赋形剂。

本发明还提供了一种式i化合物在制备用于免疫调节、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗纤维化、降血糖、抗细胞凋亡药物中的应用。

本文中使用的术语“药学上可接受的”是指所限定的化合物、盐、组合物、赋形剂或载体等在化学和/或毒理学上与对象相容，并且在与对象接触时不引发过度的毒性、刺激性、变态反应或其它不良反应并且不损及其有益效果。

本文中使用的术语“治疗有效量”是指足以提供需要或预期的生物学效果的量，该生物学效果可以是减轻和/或缓解疾病或医学状况的体征、症状或起因，或者对生物系统的任何其它期望的改变。具体地，在疾病状态、症状 或医学状况中提供临床相关变化所需的式i所示化合物或其药学可接受的盐或药物组合物的量，可由本领域普通技术人员根据具体情况通过常规实验进行确定。

可以将本发明所述的式i化合物或所述的药物组合物配制成适合于期望的给药途径的剂型，可为：适合于口服给药的剂型，例如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂和锭剂等；适合于舌下给药的剂型例如含片剂等；适合于肠胃外给药的剂型，例如无菌溶液剂和混悬剂等；适合于透皮给药的剂型，例如透皮贴剂等；适合于直肠给药的剂型，例如栓剂；适合于鼻腔或口腔吸入给药的剂型，例如气雾剂和干粉剂等；适合于局部给药的剂型，例如乳膏剂、洗剂、糊剂、喷雾剂、泡沫剂和凝胶剂等，以及其它本领域已知的适合于静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内等给药途径的剂型。所述剂型可以根据本领域已知的常规方法进行配制。

本文中使用的术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指与本发明所述药物组合物的给药方式或剂型相容并且在与对象接触时不引发过度的毒性、刺激性、变态反应或其它不良反应并且不损及该组合物本身的有益效果的载体和/或赋形剂。可用于本发明所述的药物组合物中的赋形剂的实例包括但不限于，例如，稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、塑化剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂及其它本领域已知的常规赋形剂。可用于本发明所述的药物组合物中的载体的实例包括但不限于，例如，增溶剂、等渗剂、缓冲剂、含水载体、水溶性载体、油性载体及其它本领域已知的常规载体。适合的含水载体包括但不限于，例如，无菌水、生理盐水、林格溶液、等渗葡萄糖注射液，及其它本领域已知的常规含水载体。适合的油性载体包括但不限于，例如，植物来源的非挥发油例如蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、豆油、豆油、椰子油、棕榈油或其氢化衍生物，及其它本领域已知的常规油性载体。适合的水溶性载体包 括但不限于，例如，一元醇如乙醇、二元醇如乙二醇、丙二醇或丁二醇，多元醇如甘油、聚乙二醇、n-甲基-2-吡咯烷酮、n，n-二甲基乙酰胺、二甲亚砜，及其它本领域已知的常规水溶性载体。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明中式i化合物1，2-二甲基-5-(三氮杂环丙烷)-2，3-二氢-2，7-萘啶-4(1h)-酮对丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶有一定的抑制作用；且该化合物的制备方法具有材料来源方便、制备周期短、绿色环保和工艺简单的优势。

附图说明

图1为实施例1中步骤(1)的流程图。

图2为实施例1中步骤(2)的流程图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

步骤(1)真菌的发酵：

将保藏在甘油管(20％v/v的甘油水溶液)中的季也蒙毕赤酵母(pichiaguilliermondii)菌种接种至含50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃，220r/min振荡培养24h，作为种子液。

种子培养基：酵母提取物5g/l，葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，实验用水，ph5.5。

接种1ml的种子液至750ml的三角摇瓶(含200ml发酵培养基)中，30℃， 220r/min的条件下培养168h。共富集30l真菌发酵液。

发酵培养基为：葡萄糖30g/l，(nh4)so420g/l，酵母提取物10g/l，mgso4·7h2o1g/l，feso4·7h2o0.05g/l，实验用水，ph5.5。

制备发酵粗产物

富集得到30l真菌发酵液后，4000r/min离心30min，弃去上层清液，加入15l丙酮浸泡菌体，辅以超声(42khz)处理40min。反复三次超声处理。4000r/min离心30min，取上层清液，旋转蒸发(40-45℃，真空度758mmhg)至干，得到真菌菌体的丙酮萃取组分(即式i化合物粗品)，共18g，真菌发酵液预处理过程如图1所示。

步骤(2)式i化合物1，2-二甲基-5-(三氮杂环丙烷)-2，3-二氢-2，7-萘啶-4(1h)-酮的分离纯化

1)、将步骤(1)得到的式i化合物粗品用40ml甲醇溶解，采用反相硅胶柱层析(80g，ods-c18)(ymc公司，批号：9955)依次用0％、20％、40％、60％、80％、100％甲醇-水混合液洗脱(所述的百分比为甲醇占甲醇-水混合液的体积比)，流速10ml/min，每个梯度用1l洗脱液洗脱，将0％甲醇-水混合液洗脱液减压浓缩至干，低温(4℃)保存，备用，所述分离纯化过程如图2所示。产物的hplc的色谱分析条件如下：色谱柱：ultimateaq-c18(5μm)(14×150mm)，检测波长：210nm，流动相：a)甲醇b)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：10μl，洗脱浓度：30％甲醇(即体积含量为30％的甲醇水溶液)。所得产物的出峰时间：7.45min。

2)、将1)得到的产品分离纯化

将将步骤1)得到的0％甲醇-水混合液的洗脱组分用5-10ml水溶解，采用反相硅胶柱层析(10μm，aq-c18)，制备用反相硅胶柱分离条件如下：层析柱：ultimateaq-c18(10μm)(14×250mm)，检测波长：210nm，流动相：a)甲醇b)水，流速：4ml/min，柱温：40℃，进样量：400μl。洗脱浓度：15％甲醇(即体积含量为15％的甲醇水溶液)。所得产物出峰时间：10min。收集10min出峰产物，合并液减压浓缩至干。

3)、将2)得到的产品的分离纯化

将2)得到的产品用5ml水溶解，采用反相硅胶柱层析(5μm，aq-c18)，制备用反相硅胶柱分离条件如下：层析柱：ultimateaq-c18(5μm)(14×250mm)，检测波长：210nm，流动相：a)甲醇b)水，流速：4ml/min，柱温：40℃，进样：400μl。洗脱浓度：10％甲醇。所得产物出峰时间：15.5min。收集15.5min出峰产物，合并液减压浓缩至干，得式i化合物，共12mg，其理化性质及核磁共振波谱数据如下：

白色粉末，可溶于二甲基亚砜、水、甲醇等有机溶剂。esi-msm/z：242.06[m+na]^＋，hr-msm/z：220.1192[m+h]+，分子式为c10h13on5。¹h(400mhz，dmso-d6)和¹³c(100mhz，dmso-d6)核磁共振数据见表1。

表1式i化合物的碳氢化学位移数据

效果实施例1：式i化合物体外抑制丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶活性实验

采用ns3/4a蛋白酶抑制剂筛选模型来检测式i化合物对ns3/4a蛋白酶抑制活性，具体的ns3/4a蛋白酶抑制剂筛选模型参照专利：上海医药工业研究院，丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶及基因、检测抑制剂活性的方法，cn201510098364.2，2015-03-06。

式i化合物的ns3/4a蛋白酶抑制活性检测方法：

将ns3/4a蛋白酶与底物p06221进行反应，用式i所示化合物进行抑制实验，实验仪器为biotek多功能酶标仪和96孔黑色酶标板。式i所示化合物用甲醇溶解，分别稀释至10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.1mg/ml，在反应体系中加入ns3/4a蛋白酶、底物，进行温育，所述的反应体系为：1μl待测化合物、96.5μlns3/4a蛋白酶液，2.5μl底物，ph7.5条件下温育60分钟。30℃温育后在360nm的激发光和512nm的发射光下检测荧光强度的变化。抑制实验结果如表2。

表2式i化合物对ns3/4a蛋白酶的抑制率(％)

表2的结果说明，式i所示化合物的ic50值为8.23mg/ml，表明该化合物具有一定的ns3/4a蛋白酶抑制活性，有望成为丙型肝炎病毒ns3/4a蛋白酶抑制剂的先导化合物。

其中，所述的底物p06221是一条多肽(ac-asp-glu-glu-glu-glu-alg-ala-ser-lys)，并用荧光剂edans和猝灭剂dabcul标记(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)

其中，所述的hcvns3/4a蛋白酶的制备方法参考专利申请文件记载内容(专利申请号：cn201510098364.2)，具体为：

1、构建重组质粒pet28a-ns3

1)从ncbi网站获得所有报道的丙型肝炎1b亚型的全基因序列共计164 条，利用http：//www.drive5.com/uclust软件进行聚类分析，选择相似度达到90％以上的、最具有代表性的序列作为研究对象，即序列hcv-1b/us/bid-v130/1994(genbank：eu155330.2)。选取其中的编码ns3/4a的全部序列，该序列的核酸全长为2055bp，编码685个氨基酸。为了增加ns3/4a蛋白酶的体外活性及稳定性，对基因序列进行密码子优化。对优化后的基因采用化学合成的方法进行全基因合成(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，把合成的全长基因连接到载体pgh(购自上海捷瑞生物工程有限公司)上，获得克隆载体pgh-ns3，测序验证序列完全正确(由上海捷瑞生物工程有限公司测序验证)。

2)设计用于pcr扩增ns3/4a蛋白酶基因的引物，上游引物s3-up的序列为5’-aaacatatggcgcctatcacggcttactc-3’，下游引物s4a-down的序列为5’-aaaggatccttattacttcttctttcc-3’。

3)以含有密码子优化的ns3/4a蛋白酶序列的克隆载体pgh-ns3为模板，利用引物s3-up和s4a-down在la(takara)的催化下进行pcr扩增，获得2.1kb的ns3/4a蛋白酶序列。扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30个循环，72℃再延伸5min。

4)用bamhi和ndei分别对pcr扩增获得的ns3/4a蛋白酶基因的核苷酸序列和大肠杆菌表达载体pet28a(购自上海捷瑞生物工程有限公司)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用t4连接酶(购自takara)于4℃连接过夜，连接产物转化e.colidh5α，利用含有30μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板，37℃培养12h。

5)挑取抗性平板上生长的单菌落接种5ml含有30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，200rpm37℃下过夜培养，提取质粒，进行bamhi和ndei双酶切鉴定，得到含有ns3/4a蛋白酶基因的核苷酸序列的重组质粒pet28a-ns3。对酶切鉴定正确的重组质粒进行测序验证。

2、构建重组菌株、诱导表达及蛋白纯化。

1)将重组质粒pet28a-ns3转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)中，涂布含有30μg/ml卡那霉素的lb琼脂平板，37℃培养12h。挑取抗性平板上生长的单菌落接种于5ml含有30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，200rpm37℃下过夜培养，提取质粒，进行bamhi和ndei双酶切鉴定，即获得重组菌株。保存验证正确的菌株。

2)接50μl步骤(1))所述验证正确的单菌落于5mllb中，200rpm37℃下震荡过夜，得过夜培养物。接500μl过夜培养物于50mllb中，200rpm37℃下震荡培养至od600为0.6时，添加0.5mmiptg进行诱导，18℃，200rpm下诱导培养22h后收集菌液。

3)将步骤(2))获得的收集菌液4℃7000～8000g离心10min，收集沉淀的菌体。将1g菌体加20ml裂解缓冲液(包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)25mm、nacl300mm、咪唑(imidazole)10mm、edta1mm、甘油10％和tritonx-100)，在冰上混合，涡旋震荡混匀。将细胞悬浮起来，加入溶菌酶(0.3mg/ml)，混匀，冰上静置30min。加入10％tritonx-100，使triton的终浓度为0.05％，所述的百分比为体积百分比，充分混匀，超声破碎细胞，4℃8000g离心30min，取上清。在上清中加入1mlresin(上海生工)4℃震荡过夜，充分结合，过亲和层析柱空柱，依次用15ml缓冲液(包括hepes25mm、nacl300mm、imidazole10mm、edta1mm、甘油10％和tritonx-100)、15ml冲洗缓冲液(包括hepes25mm、nacl300mm、imidazole20mm、edta1mm、甘油10％和tritonx-100)洗脱，得洗脱液。洗脱液中含有目的蛋白ns3/4a蛋白酶，将目的蛋白进行透析，用1l的透析液(包括hepes25mm、nacl150mm、甘油10％、tritonx-1000.1％和二硫苏糖醇(dtt)10mm，ph7.5)4℃透析过夜后得纯化的目的蛋白，通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的目的蛋白的大小及纯度。后在纯化的目的蛋白中加入10mm的dtt，分装，-70℃保存。