一种建立基于微rna干扰的肝纤维化动物受精卵的方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种建立基于微RNA干扰的肝纤维化动物受精卵的方法，属于生 物技术领域。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化患者晚期常出现肝功能衰竭和门脉高压，表现为肝性脑病、食管胃底静 脉破裂出血、腹膜炎等严重并发症，甚至能演变为肝硬化、肝癌，危及病人的生命安全。早期 防治和逆转肝纤维化成为研宄热点，实验动物模型是进行肝纤维化机制研宄及新药研发评 价的重要条件。对于肝纤维化的动物模型，目前主要有化学方法（四氯化碳等）、酒精诱导 等。
[0003] 人类疾病绝大多数源于基因表达的异常。近年，发现了一类具有基因表达转录后 水平调节作用的小分子非编码RNA，称为"微RNA (microRNA，miRNA) "。通常，miRNA通过与 特定mRNA的3'非翻译区（UTR)结合，导致mRNA降解或以mRNA为模版的翻译过程受到抑 制，从而达到负向调节某一基因表达的作用。miRNA功能的研宄对于进一步揭示疾病的发生 发展具有重大意义。
[0004] 在研宄某一具体miRNA与肝纤维化关系时，常常在细胞水平验证miRNA对肝星状 细胞活化情况，即通过某种方法使肝星状细胞特定miRNA含量增加或减少，再通过观察细 胞出现的表型，分析该miRNA的功能；或者是在肝纤维化造模过程中，在动物体内注射特定 miRNA模拟物或抑制剂。但这些具有明显的不足：注射特定miRNA模拟物或抑制剂都是一 过性表达增加，不能很好的反映miRNA对疾病的作用；成本较高，需要反复转染或注射，并 且都属于体外实验，不能很好反应体内真实作用情况。其中，较为突出的是作用时间短和无 法传代。
[0005] 我们前期报道，miR-483在肝纤维化过程中的发挥着重要的保护作用。随后我们研 发了针对miR-483干扰的遗传改变小鼠。该小鼠可以作为一种新的肝纤维化研宄的模型。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种具有可稳定干扰微RNA表达，用于在体研宄肝纤维化 的动物平台。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：
[0008] 一种建立基于微RNA干扰的肝纤维化动物受精卵的方法，其特征在于：包括以下 步骤：
[0009] (1)构建CAGG-Sponges-miR-483质粒：针对选取NCBI上小鼠miR-483序列，设计 合成六拷贝的反义序列：六拷贝的反义序列的核苷酸序列为SEQ ID No. 1，将该反义序列两 端引入EcoR I的酶切位点，EcoR I分别单酶切六拷贝的miR-483反义序列与含有启动子 CAGG的pCAGGs载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物测序 正确后转化入感受态细胞DH5 a，建立重组质粒CAGG-Sponges-miR-483 ;
[0010] (2)建立miR-483稳定干扰的转基因小鼠的受精卵：以Sal I和Hind III双酶切 上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括启动子CAGG，六 拷贝的miR-483反义序列和转录终止信号；将获得纯化的转基因构件经显微注射导入成活 的受精卵中。
[0011] 在本发明中，优选的，所述的构建CAGG-Sponges-miR-483质粒时EcoR I分别 单酶切六拷贝的miR-483反义序列与含有启动子CAGG的pCAGGs载体3h，CIP对载体 去磷酸化lh，纯化后得到5 y g产物，经T4连接酶将二者连接，连接产物测序正确后转 化入感受态细胞DH5 a 50 yL，涂板，次日，挑取5个菌落进行测序鉴定，确定重组质粒 CAGG-Sponges-miR-483〇
[0012] 在本发明中，优选的，调整所述的转基因构件的浓度至lng~2ng/uL用于显微注 射。
[0013] microRNA "海绵"（Sponges，SP，S)技术于 2007 年由诺贝尔奖得主 Phillip A. Sharp提出，他的团队利用多拷贝、不完全互补的miRNA反义序列特异"吸附"miRNA，以降 低成熟miRNA含量。几年来，应用这种靶基因拟似物过表达的方式敲减miRNA的报道逐年 增多。其设计简单、操作容易，不仅适于细胞的转染，也可利用于整体水平转基因动物的制 作，其敲减效率还与外源片段的整合位点及整合拷贝数相关。
[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0015] 本发明主要是解决现有技术所存在的不足，即：作用时间短、无法传代和不能真实 反应动物体内环境。本发明提供了一种能够稳定干扰miR-483表达的遗传改变小鼠模型， 该模型是基于外源核酸序列整合入小鼠基因组实现的，为后续的肝纤维化研宄及药物筛选 提供动物模型，该模型具有可稳定遗传性，自身具有一定的抑制肝纤维化的特性，是一种新 的肝纤维化研宄的动物模型。该模型的建立为微RNA在肝纤维化中作用的在体功能研宄提 供了可靠的平台。
[0016] 此外，目前针对基因"失功能"的策略，主要为基因敲除，虽经胚胎干细胞及同源重 组、TALENs及CRISPR/Cas9等技术的不断发展，都是基于染色质DNA的编辑，进行基因组的 改变。microRNA作为基因表达调控的重要分子，相当比例的microRNAs由多个基因位点编 码（即同一成熟体miRNA，可由不同的基因编码产生）。这对以改变基因组DNA为主要方式 的基因敲除来说，是极具挑战的。本发明利用过表达反义序列，在胞浆中"吸附"成熟miRNA， 使其失去功能，达到抑制功能的目的，是具有理论意义的。
【附图说明】
[0017] 图1为显微注射用转基因构建不意图；
[0018] 图2为外源片段的整合与效果示意图；其中，A图为外源片段整合入小鼠基因组的 琼脂糖凝胶电泳图，72-77 :转基因型（TG)小鼠的转基因片段，NC :阴性对照，PC :阳性对照， M :Marker ;B图中的条形图表示外源基因的表达情况，WT :野生型，B图中的点图表示成熟体 miR-483的含量，WT :野生型。
[0019] 图3为野生型（WT)与miR-483干扰（knockdown)后的转基因型（TG)小鼠对 CC14诱导的肝纤维化严重程度的比较示意图；其中，上面一行的图表示miR-483干扰 (knockdown)后的转基因型（TG)小鼠对CC14诱导的肝纤维化严重程度示意图，下面一行的 图表示野生型（WT)小鼠对CC14诱导的肝纤维化严重程度示意图。
【具体实施方式】
[0020]