一种个体化药物的筛选方法及其应用与流程

本发明属于生物医学领域，特别涉及一种基于蛋白分析的药物筛选方法，还涉及该方法使不同患者的不同疾病特点与不同药物建立一一对应关系，使新个体化药物的开发、使用有据可依，推动精准医疗。

背景技术：

精准医疗的基础是个体化病因分析：精准医疗是将患者的各种个体化致病因素(遗传与环境)进行精确的测量和解读，在分子水平体现出来，继而制定以个体化的分子致病因素为靶向的、有针对性的个体化治疗。

个体化分子致病因素的最佳分析手段是蛋白质分析:精准医疗的精髓是极尽可能地全面搜集和分析患者的个体化分子致病因素，籍以极尽可能地制定符合其个体分子特征的治疗方案，因此，治疗方案的精准程度与个体化分子病因信息的详实程度成正比。然而，当前个体化分子致病因素的收集仅仅依靠基因测序技术，这只限于对患者“遗传性”分子致病因素的分析，完全忽略了更为重要的“环境”分子致病因素。以基因测序为主体的精准医疗仅仅是片面的、遗传角度上的精准，这不但有悖于精准医疗初衷、误导其走向，更导致精准医疗赖以生存的大数据库存有严重遗漏，将使精准医疗尝试全面崩溃。申请人认为：根据生物学中心法则，遗传性基因的致病性变异最终将会以蛋白质变异的形式表现出来，同时，环境致病因素同样会体现在独立于基因之外的蛋白质改变，因而全面、准确的蛋白质分析才是个体化致病病因分析的最佳技术手段。

液相色谱仪与质谱仪联用(LC/MS/MS)是全面、准确分析蛋白质的最佳技术：LC/MS/MS技术发展迅速，是当今世界上最为先进、全面、准确的蛋白质定性、定量分析方法，是在蛋白质水平的“基因测序”技术。自2014年，所有人类基因所编码的蛋白质均可以由LC/MS/MS检测出，并包含检测诸如蛋白含量、修饰变化等多种基因测序所无法反应的、却对生物功能起决定作用的分子信息。同时，与传统以抗体为基础的蛋白质分析技术相比，LC/MS/MS又具有客观、直接、全面、高效等优势。因而，LC/MS/MS在精准医疗所需的全面、准确分析患者分子致病因素的工作中，是目前唯一的、无可替代的技术方法。

精准医疗之所以“精准”是在于其治疗方案迎合患者的个体化病因，即“对症下药”：而当前基于基因测序的精准医疗尝试，由于(如前述)基因测序对致病因素分析的片面性，仅是片面的“对因下药”，这将严重影响对个体化药物的筛选、阻碍新个体化药物的开发。申请人认为：基于蛋白质的患者个体化病因千变万化，精准医疗的治疗方案也必将千变万化，精准医疗方案将是多种现有药物的有机组合，或者是新开发的、针对各种个体化分子致病因素的药物的多元化配伍。

基于以上背景和精准医疗的需求，申请人提出一种基于蛋白质分析的、旨在推进精准医疗实践的、新个体化药物的筛选方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的在于提供服务于精准医疗的、新个体化药物的筛选方法，用以克服传统个体化药物筛选中片面性。

技术方案：本发明提供的一种个体化药物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)疾病相关致病蛋白分子数据库的构建：利用LC/MS/MS分别检测某种患病人群的病理组织样本和无患病人群的相应组织样品，对比分析患病人群和无患病人群的蛋白分子，找出患病人群和无患病人群不同的蛋白分子作为该疾病的分子致病因素，建立该疾病相关致病蛋白分子数据库；

(2)患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库的建立：在患病人群内分析蛋白分子致病因素特征个体间差异，对患病人群细分，建立疾病细分患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库；

(3)疾病模型中目标药物-蛋白响应相关性数据库的建立：从个体化药物筛选角度，通过对被筛选药物在药理试验模型中的蛋白LC/MS/MS分析，，确定待筛选药物对该疾病致病蛋白的影响，建立疾病模型中待筛选药物-蛋白响应相关性数据库，并得到药物筛选结果。

优选地，所述个体化药物的筛选方法，包括以下步骤:

(1)疾病相关致病蛋白分子数据库的构建：

(1.1)分别将患病人群的病理组织样本与无患病人群的相应组织样本进行LC/MS/MS质谱检测分析；

(1.2)比较患病人群和无患病人群样本的蛋白分布、含量、蛋白修饰或其他蛋白特征的差别，发现与该疾病相关的蛋白异常情况作为蛋白分子致病因素；

(1.3)构建该疾病相关致病蛋白分子数据库；

(2)患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库的建立：

(2.1)在患病人群内，详尽记录患者各种临床病程特点(包括但不限于病理等)；

(2.2)将记录的临床病程特点分别对比当前传统检测手段对病情的描述，利用前传统检测手段对病情的描述和相应疾病蛋白致病分子双重指标对该疾病患者人群进行亚群分类；

(2.3)构建患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库；

(3)疾病模型中对照药物-蛋白响应相关性数据库的构建：

(3.1)建立该疾病的药理试验模型；

(3.2)建立空白对照组、对照药物组和待筛选药物组，对药理试验模型分别不给药、给予对照药物和给予待筛选药物；

(3.3)分别将空白对照组、对照药物组和待筛选药物组的病理样本进行LC/MS/MS质谱分析；

(3.4)比较空白对照组、对照药物组和待筛选药物组的病理样本的蛋白分布、含量、蛋白修饰或其他蛋白特征的差别，确定待筛选药物对该疾病致病蛋白的影响；

(3.5)建立疾病模型中对照药物-蛋白响应相关性数据库、待筛选药物-蛋白响应相关性数据库，得到筛选药物结果。

步骤(1)中，所述病理组织样本包括手术中切除病理组织、活检病理组织、血样、尿样、脑脊液或其他体液样本。

步骤(2)中，所述蛋白分子致病因素特征个体间差异包括蛋白分子含量、蛋白分子分布、蛋白修饰或其他蛋白特征改变。

步骤(3)中，所述药理实验模型为动物模型、细胞模型或组织模型。

本发明还提供了一种个体化药物的筛选及验证方法，包括以下步骤：

(1)疾病相关致病蛋白分子数据库的构建：

(1.1)分别将患病人群的病理组织样本与无患病人群的相应组织样本进行LC/MS/MS质谱检测分析；

(1.2)比较患病人群和无患病人群样本的蛋白分布、含量、蛋白修饰或其他蛋白特征的差别，发现与该疾病相关的蛋白异常情况作为蛋白分子致病因素；

(1.3)构建该疾病相关致病蛋白分子数据库；

(2)患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库的建立：

(2.1)在患病人群内，详尽记录患者各种临床病程特点(包括但不限于病理等)；

(2.2)将记录的临床病程特点分别对比当前传统检测手段对病情的描述，利用前传统检测手段对病情的描述和相应疾病蛋白致病分子双重指标对该疾病患者人群进行亚群分类；

(2.3)构建患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库；

(3)疾病模型中对照药物-蛋白响应相关性数据库的构建：

(3.1)建立该疾病的药理试验模型；

(3.2)建立空白对照组、对照药物组和待筛选药物组，对药理试验模型分别不给药、给予对照药物和给予待筛选药物；

(3.3)分别将空白对照组、对照药物组和待筛选药物组的病理样本进行LC/MS/MS质谱分析；

(3.4)比较空白对照组、对照药物组和待筛选药物组的病理样本的蛋白分布、含量、蛋白修饰或其他蛋白特征的差别，确定待筛选药物对该疾病致病蛋白的影响；

(3.5)建立疾病模型中对照药物-蛋白响应相关性数据库、待筛选药物-蛋白响应相关性数据库，得到筛选药物结果；

(4)疾病患者亚群与被筛选药物对该亚群患者疾病疗效的相关性数据库：

(4.1)对该疾病新发病例的病理样本进行蛋白LC/MS/MS分析，找到该疾病相关致病蛋白分子数据库中该疾病蛋白致病分子的特征，并将该患者依据患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库对患者进行亚群归类；

(4.2)依据步骤(4.1)中检测的该患者的疾病蛋白致病分子的特征及药物-蛋白响应相关性数据库，对该病理样本进行离体培养，并给予对照药物或筛选出的药物对离体培养样本；

(4.3)对离体培养后的样本做LC/MS/MS分析，观察致病蛋白分子改变，同时以当前传统检测手段对治疗后样本进行评价。

本发明还提供了上述方法在药物筛选中的应用。

本发明还提供了上述方法在对已知或待验证的抗癌药进行其蛋白水平的药效检测中的应用。

本发明还提供了上述方法在精准医疗中的应用。

有益效果：本发明提供的个体化药物筛选方法是一种全新的、应用于个体化精准医疗的药物筛选方法，属于开拓性的发明，其使用能够更准确、全面地将遗传、环境致病因素及患者病程特点综合体现于蛋白质分子的检测分析结果，并根据目标药物对这些蛋白致病分子的纠正，筛选适用于不同患者病程特征的、更为客观而精准的、个体化的治疗药物。

本发明方法是一种以蛋白质为核心、强调蛋白质是遗传与环境致病因素在患者上的综合体现、以LC/MS/MS质谱技术为蛋白质检测手段、以药物对蛋白质的影响为标准的新型药物筛选方法。

本发明方法应用广泛，具有很强的实用性，可在为多种疾病的个体化用药进行不同的药物筛选，具有很高的商业前景和实践意义，例如可在精准医疗中：对已知或待验证的抗癌药进行其蛋白水平的药效检测，同时对个体癌症患者肿瘤样本进行蛋白质分析，找出肿瘤相关蛋白与抗肿瘤药在该类型肿瘤中的一一对应关系，继而为实施肿瘤治疗制定精准治疗方案。

本发明相对于现有技术具有以下突出的优势：

(1)本发明为开拓性发明：首次提出致病蛋白分子能够反映精准医疗中“精准”所需的遗传与环境致病因素，并为之设立了“精准”药物筛选的方法，目前属于一个崭新的研究进展；

(2)全面、客观、准确：由于利用了蛋白质LC/MS/MS分析技术，本发明对疾病与药物的特征分析更为全面而准确，同样提高了药物筛选的客观性与个体化用药的准确性；

(3)经济：目前耗资巨大的精准医疗仅仅考虑了遗传性(基因)因素，这不但有悖于精准医疗初衷、误导其走向，更导致精准医疗赖以生存的大数据库存有严重遗漏，将使精准医疗尝试全面崩溃，最终会推到重来。本发明首先倡导遗传、环境因素综合分析，加之对于相应大数据库的合理设计，无疑使精准医疗的诊治工作得到更有效的开展，因而具有极高的经济价值。同时，通过对患者的精准划分并为划分后的患者匹配精准药物，使现有药物的使用范围极具扩大，可以提高新药开发的成功率，减少医疗资源的浪费。

(4)应用范围广：本发明提出的个体化药物筛选方法，适用于包括各类实体肿瘤在内的、各种能够获得病理组织从而可以进行LC/MS/MS分析的临床疾病，适用范围广，并符合全球精准医疗的发展方向，因而具有广阔的应用领域。

附图说明

图1为创建“乳腺癌的相关蛋白分子致病因素”数据库的示意图。

图2为创建“乳腺细分患者个体化临床病程特征-蛋白致病因素响应特征相关性”数据库的示意图。

图3为创建“乳腺癌模型中目标药物-蛋白响应相关性”数据库的示意图。

图4为创建“乳腺癌亚群患者-个体化药物疗效相关性”数据库的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做出进一步说明。

个体化药物的筛选和验证方法，包括以下步骤：

(1)疾病相关致病蛋白分子数据库的构建：利用LC/MS/MS分别检测某种患病人群的病理组织样本和无患病人群的相应组织样品，对比分析患病人群和无患病人群的蛋白分子，找出患病人群和无患病人群不同的蛋白分子作为该疾病的分子致病因素，建立该疾病相关致病蛋白分子数据库；

(2)患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库的建立：在患病人群内分析蛋白分子致病因素特征个体间差异，对患病人群细分，建立疾病细分患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库；具体而言，从患者个体间差异的角度，通过对某疾病患者群内个体患者的临床病程特点的记录及其与步骤(1)中数据库所示的疾病相关蛋白分子致病因素的相关性分析，在患者群内根据临床病程特点总结具有该特点的患者的蛋白分子致病因素特征(含量、分布、蛋白修饰或其他蛋白特征改变等)，籍此将患者群进一步细分，创建患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库数据库；

(3)疾病模型中目标药物-蛋白响应相关性数据库的建立：从个体化药物筛选角度，通过对被筛选药物在药理试验模型中的蛋白LC/MS/MS分析，，确定待筛选药物对该疾病致病蛋白的影响，建立疾病模型中待筛选药物-蛋白响应相关性数据库，并得到药物筛选结果；

(4)对筛选结果验证：某疾病新发病例患者就诊后，在将对其病理样本进行蛋白LC/MS/MS分析、找到步骤(1)数据库中该疾病蛋白致病分子的特征、并将该患者依据步骤(2)数据库进行细分归类的同时，对该患者的病理样本进行离体培养，建立该患者的个体化疾病模型。再根据步骤(3)中数据库信息找到纠正该患者蛋白致病分子的药物(或药物组合)，并治疗该患者的离体培养疾病模型，观察记录药物疗效。最后，将步骤(2)数据库的患者归类信息与药物疗效进行相关分析，构建“疾病亚群患者-个体化药物疗效相关性”数据库。检查、治疗结果将继续添加、完善上述数据库。

具体地，个体化药物的筛选及验证方法，包括以下步骤：

(1)疾病相关致病蛋白分子数据库的构建：

(1.1)分别将患病人群的病理组织样本与无患病人群的相应组织样本进行LC/MS/MS质谱检测分析；

(1.2)比较患病人群和无患病人群样本的蛋白分布、含量、蛋白修饰或其他蛋白特征的差别，发现与该疾病相关的蛋白异常情况作为蛋白分子致病因素；

(1.3)构建该疾病相关致病蛋白分子数据库；

(2)患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库的建立：

(2.1)在患病人群内，详尽记录患者各种临床病程特点(包括但不限于病理、等)；

(2.2)将记录的临床病程特点分别对比当前传统检测手段对病情的描述，利用前传统检测手段对病情的描述和相应疾病蛋白致病分子双重指标对该疾病患者人群进行亚群分类；

(2.3)构建患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库；

(3)疾病模型中对照药物-蛋白响应相关性数据库的构建：

(3.1)建立该疾病的药理试验模型；

(3.2)建立空白对照组、对照药物组和待筛选药物组，对药理试验模型分别不给药、给予对照药物和给予待筛选药物；

(3.3)分别将空白对照组、对照药物组和待筛选药物组的病理样本进行LC/MS/MS质谱分析；

(3.4)比较空白对照组、对照药物组和待筛选药物组的病理样本的蛋白分布、含量、蛋白修饰或其他蛋白特征的差别，确定待筛选药物对该疾病致病蛋白的影响；

(3.5)建立疾病模型中对照药物-蛋白响应相关性数据库、待筛选药物-蛋白响应相关性数据库，得到筛选药物结果；

(4)疾病患者亚群与被筛选药物对该亚群患者疾病疗效的相关性数据库：

(4.1)对该疾病新发病例的病理样本进行蛋白LC/MS/MS分析，找到该疾病相关致病蛋白分子数据库中该疾病蛋白致病分子的特征，并将该患者依据患者个体化临床病程征-蛋白致病因素响应特征相关性数据库对患者进行亚群归类；

(4.2)依据步骤(4.1)中检测的该患者的疾病蛋白致病分子的特征及药物-蛋白响应相关性数据库，对该病理样本进行离体培养，并给予对照药物或筛选出的药物对离体培养样本；

(4.3)对离体培养后的样本做LC/MS/MS分析，观察致病蛋白分子改变，同时以当前传统检测手段对治疗后样本进行评价；

(4.4)将步骤(4.1)的患者归类情况及其对应药物治疗的疗效、治疗前后蛋白分子的变化进行总结与数据相关性分析，构建数据库。

更具体地，本发明实施例利用上述方法在精准医疗实践中，筛选乳腺癌个体化药物，如利用5例乳腺癌临床样本及其正常组织、2种乳腺癌细胞模型、筛选2种小分子药物作为抗乳腺癌药物。

1. 5例乳腺癌及其正常对照组织样品蛋白提取：选取1克样本加入1毫升8摩尔浓度尿素蛋白提取液，均浆打碎，冰上孵育30分钟，离心，液体部分移入新试管，得到脑脊液蛋白混合物。

2.蛋白酶切、去盐：将提取的蛋白混合物经还原剂、碱化剂处理后，以1微克胰蛋白酶比50微克蛋白的比例混合，过夜消化；以C18反相柱去盐纯化，再经真空抽干离心机除去有机溶剂后，用含有乙腈和三氟醋酸的溶液稀释到最终1微克/微升浓度溶液，即为待测蛋白混合液。

3.LC/MS/MS质谱检测：将各待测蛋白混合液上样于美国Waters公司的nanoACQUITY与美国Thermo公司的Q-Exactive连接成的超高压液相色谱仪-质谱仪系统(LC/MS/MS)，按照质谱厂家提供的程序进行质谱信号采集。

4.组间蛋白分子对比：将乳腺癌组与其对照组的质谱数据进行定性、定量对比，找出并记录与乳腺癌相关的蛋白分子(致病蛋白)，建立与乳腺癌相关的蛋白分子致病因素数据库，如图1所示，结果发现EGFR等蛋白在乳腺癌中升高、p53等蛋白在乳腺癌中下降。

5.收集、记录5例乳腺癌患者的各自各种临床病程、致病蛋白分子特点：临床病程特点包括(但不限于)常规病理分型等，如根据病理将3例患者归为导管型、2例归为腺叶型乳腺癌；仔细对比2型间LC/MS/MS蛋白分析结果，发现二者的致病蛋白分子特征不同：导管型EGFR高、p53正常；腺叶型EGFR正常、p53低。

6.根据步骤5的结果，建立患者亚型-蛋白分子特征数据库，如图2所示。

7.抗乳腺癌小分子药物筛选：从美国Sigma公司购买Marbofloxacin、Eutanol g两种小分子药物；从美国ATCC公司购买MDA-MB-435S、MCF7两种乳腺癌培养细胞。5％二氧化碳37摄氏度下，按厂家说明书用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液(美国Invitrogen公司)进行常规细胞培养，每种细胞培养3个培养皿：其中一皿加入10微摩尔终浓度Marbofloxacin，另一皿加入10微摩尔终浓度Eutanol g，剩余一皿不予处理(仅加入相应浓度的溶剂作为对照)。药物治疗后24小时，如步骤1至4方法进行致病蛋白比较分析，发现Marbofloxacin在2种乳腺癌细胞中均可以降低EGFR、但对p53无影响；而Eutanol g相反：对EGFR无影响、但能够提升p53蛋白水平。

8.根据步骤7的结果，建立患者亚型-蛋白特征数据库，如图3所示。

9.患者样本离体组织培养：在进行1项所述提取样本蛋白的同时，另外留取1克样本用无菌剪刀将组织剪切成1毫米见方组织块，加入2.5％胰蛋白酶，在37摄氏度消化2小时，制成单细胞悬浮液，离心去除胰蛋白酶溶液，更换为含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液(美国Invitrogen公司)，在5％二氧化碳的37摄氏度培养箱常规培养。细胞铺满培养皿底部时更换新培养液进行常规传代至2个培养皿。

10.药物筛选：

将步骤9所述3例导管型乳腺癌培养细胞各自的2皿细胞，如步骤7所述，其中一皿加入10微摩尔终浓度Marbofloxacin，另一皿不予处理(仅加入相应浓度的溶剂作为对照)。药物处理24小时后，如步骤1至4方法进行致病蛋白比较，发现Marbofloxacin在3例导管型乳腺癌培养细胞中可以降低EGFR、并发现如核分裂比例等常规肿瘤特有恶性度检测指标趋于好转。

将步骤9所述2例腺叶型乳腺癌培养细胞各自的2皿细胞，如步骤7所述，其中一皿加入10微摩尔终浓度Eutanol g，另一皿不予处理(仅加入相应浓度的溶剂作为对照)。药物治疗后24小时，如步骤1至4方法进行致病蛋白比较，发现Eutanolg在2例腺叶型乳腺癌培养细胞中可以提升p53蛋白水平、并发现如核分裂比例等常规肿瘤特有恶性度检测指标趋于好转。

11.根据步骤10的结果，建立乳腺癌亚型患者-个体化药物疗效相关性数据库，如图4所示。至此，2种目标个体化药物被筛选完毕。

12.利用步骤1至11，对任意待测药物筛选，可分别筛选得到对导管型乳腺癌和腺叶型乳腺癌治疗好的抗肿瘤药物。