肝纤维化治疗方法
【专利摘要】本发明涉及用于抑制哺乳动物S100A4基因表达的试剂在制备用于治疗所述哺乳动物的肝纤维化的药物中的用途。
【专利说明】肝纤维化治疗方法
【技术领域】
[0001]本发明属于肝纤维化治疗领域。具体地，本发明涉及通过抑制哺乳动物S100A4基因的表达来治疗所述哺乳动物的肝纤维化。
【背景技术】
[0002]肝纤维化是指肝脏中细胞外基质成分的大量沉积，它是一种对肝脏慢性损伤的修复反应^肝纤维化是各种慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段，由于肝硬化是肝脏实质性病变，医学界普遍认为较难逆转，在治疗上除肝脏移植外，缺乏其它有效措施2。近年来，随着医学分子生物学技术的应用，人们对肝纤维化发生的机制进行了广泛而深入的讨论，明确提出了肝纤维化可以逆转的论点。因此，逆转肝纤维化的研究已成为世界医学攻关中的一个热点课题。[0003]目前，国内外对于肝纤维化治疗的研究已经取得了一些成果。临床上常用的治疗肝纤维化的药物主要有干扰素、秋水仙碱、白介素-10等，但是这些药物的治疗效果有限，且副作用大，不宜长期使用。因此亟需肝纤维化治疗的新靶点和新方法。
[0004]S100A4是SlOO钙结合蛋白超家族中的一员，它在细胞质、细胞核以及胞外基质中均有分布3。S100A4在哺乳物种间的保守性很高，人S100A4(NCBI数据库编号:NP_002952)与小鼠S100A4(NCBI数据库编号:NP_035441)在氨基酸序列上的相似性高达93%。已有研究表明S100A4能通过多种途径促进肿瘤的转移，如促进肿瘤血管新生4、增强肿瘤细胞的运动性5以及上调胞外基质中金属蛋白酶的表达6’7等。但是S100A4在治疗肝纤维化方面的作用至今还没有报道。
[0005]为了探讨新的肝纤维化治疗的方法，发明人进行了本发明。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种通过靶向S100A4分子治疗肝纤维化的方法。所述方法具体是通过RNA干扰沉默S100A4基因来治疗肝纤维化。
[0007]为了抑制S100A4的表达，本发明采用了 RNA干扰技术。RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解8O其中短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)包括两个短反向重复序列，中间由一莖环(loop)序列分隔的，组成发夹结构。
[0008]目前常用的体内RNA干扰方法是将干扰RNA序列作为“短发夹”克隆到质粒载体中，在体内该发夹序列被表达出来，形成一个双链RNA，并被双链RNA复合体降解为有效的小RNA分子。将双链RNA导入动物体内的方法主要包括:直接注射含RNA干扰序列的质粒、将含RNA干扰序列的质粒包装成腺病毒或逆转录病毒注射入体内、以及脂质体介导的体内转染等。[0009]因此，靶向S100A4的RNA干扰可以通过直接注射含RNA干扰序列的质粒、将含RNA干扰序列的质粒包装成腺病毒或逆转录病毒注射入体内、以及脂质体介导的体内转染等方法来实现。
[0010]在本发明的一些实施方案中，采用腺病毒介导的RNA干扰。采用其他方式的RNA干扰同样可以实现本发明。
[0011]腺病毒是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。目前常用的应用于基因治疗的腺病毒多为复制缺陷型重组人V型腺病毒，删除了与腺病毒复制相关的El和E3基因。尽管一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、呼吸系统或眼部的急性感染，但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介导的基因治疗不仅可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得基因治疗易于推广应用。腺病毒易于制备、纯化和浓缩，病毒滴度可以高达10npfu/ml。所以，腺病毒是目前基因治疗临床试验中应用最多的一种载体 。
[0012]因此本发明采用腺病毒介导的RNA干扰技术抑制S100A4基因的表达。首先根据小鼠S100A4mRNA序列设计与其互补的shRNA序列，将其克隆到表达腺病毒载体中。进而利用AdEasy?系统重组出携带靶向S100A4shRNA的腺病毒，经氯化铯密度梯度离心纯化出腺病毒。纯化的腺病毒通过尾静脉注射的方式给予诱导肝纤维化的小鼠。
[0013]更具体地，本发明提供以下各项:
[0014]1.用于抑制哺乳动物S100A4基因表达的试剂在制备用于治疗所述哺乳动物的肝纤维化的药物中的用途。
[0015]2.根据I所述的用途，其中所述试剂是针对所述S100A4基因的RNA干扰试剂。
[0016]3.根据2所述的用途，其中所述RNA干扰试剂包含与递送载体结合的针对所述S100A4基因的RNA干扰序列。
[0017]4.根据3所述的用途，其中所述递送载体选自:质粒载体、病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖和脂质体。
[0018]5.根据3所述的用途，其中所述递送载体选自:腺病毒载体和逆转录病毒载体。
[0019]6.根据3所述的用途，其中所述递送载体是腺病毒载体。
[0020]7.根据1-6中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物选自人、猴、狗、猫、牛、马、羊、猪、兔、小鼠和大鼠。
[0021]8.根据7所述的用途，其中所述哺乳动物是小鼠，并且所述S100A4基因的序列如SEQ.1D.N0.1 所示。
[0022]9.根据7所述的用途，其中所述哺乳动物是人，并且所述S100A4基因的序列如SEQ.1D.N0.2 所示。
[0023]10.一种药物组合物，其包含与递送载体结合的针对哺乳动物S100A4基因的RNA干扰序列，
[0024]11.根据10所述的药物组合物，其中所述递送载体选自:质粒载体、病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖和脂质体。
[0025]12.一种治疗哺乳动物肝纤维化的方法，所述方法包括抑制所述哺乳动物S100A4基因的表达。
[0026]13.用于抑制哺乳动物S100A4基因表达的试剂作为治疗所述哺乳动物的肝纤维化的药物的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1:用于将干扰序列构建到其上的腺病毒载体pRNAT-Hl.1/Adeno (上海闪晶分子生物科技有限公司)的载体图谱。
[0028]图2:注射到体内的携带绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒可以感染肝脏组织几乎所有细胞，如图所示腺病毒组肝组织全部为绿色，没有注射腺病毒的空白对照组则没有绿色。图中蓝色为细胞核。
[0029]图3:通过流式细胞术检测所有肝脏细胞GFP的表达情况，sh-con及sh_S100A4组GFP的表达峰明显高于空白对照组。
[0030]图4:sh-S100A4重组腺病毒可以有效降低肝脏组织中S100A4，图中所示为肝组织匀衆后的western blot结果，β-actin为内参。
[0031]图5:sh-S100A4 重组腺病毒降低S100A4基因后肝纤维化水平降低。
【具体实施方式】
[0032]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0033]实施例1:RNA干扰敲低S100A4基因
[0034]1.针对小鼠S100A4基因的shRNA序列设计及合成
[0035]小鼠S100A4(NM_011311.2)的序列如SEQ.1D.N0.1所示，针对其第3外显子序列(194-499)，设计出与其互补的一段序列，如下:
[0036]sh-S100A4:5，-GGACAGATGAAGCTGCATT-3’
[0037]同时，设计一段无关的对照序列，如下:
[0038]sh-con:5’ -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3，
[0039]按照酶切位点(Mlu I) +正向序列+茎环序列+反向序列+polyT+酶切位点(HindIII)的原则，合成如下寡核苷酸序列:
[0040]sh-SlOOA4-正向:5，-cgcgtGGACAGATGAAGCTGCATTTTC[0041 ] AAGAGAAATGCAGCTTCATCTGTCCTTTTTTCCAAa-3，
[0042]sh-S100A4-反向:5’ -agcttTTGGAAAAAAGGACAGATGAAGC
[0043]TGCATTTCTCTTGAAAATGCAGCTTCATCTGTCCa-3，
[0044]sh-con-正向:5，-cgcgtTTCTCCGAACGTGTCACGTTTC
[0045]AAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCCAAa-3，
[0046]sh-con-反向:5’ -agcttTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCA
[0047]CGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAa-3，
[0048]shRNA序列的合成由上海闪晶分子生物科技有限公司完成。
[0049]将合成得到的正向和反向两条单链DNA序列用TE溶解，两条单链各取5ul混合，退火(95°C 2min, 72°C 2min,37°C 2min,25°C 2min,4°C IOmin)形成双链结构，待连接(注:对sh-S100A4以及sh-con分别进行以下步骤2-步骤6的处理)。
[0050]2.腺病毒载体双酶切，凝胶回收[0051]根据pRNAT-Hl.1/Adeno质粒(Genscript, SD1209)白勺结构图，该质粒携带珊瑚虫 GFP(cGFP)标签(图1)，将 pRNAT-Hl.1/Adeno 质粒用 Mlu I (Promega, R6381)和HindIII (Promega, R6041)进行酶切(酶切体系为:质粒 IOul, 10Xbuffer2ul, BamHllul,Hind III lul,双蒸水 6ul,总体系为 20ul,37°C 4h)。
[0052]参照凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP214)说明书步骤，对酶切后产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收较大的(约8kb)pRNAT-Hl.1/Adeno线性化片段。
[0053]3.载体与shRNA DNA双链连接与转化
[0054]步骤I中的DNA双链片段与步骤2中的线性化载体的摩尔数比为3:1，反应体系为 1.5ul T4DNA 缓冲液(Promega, C126A)，lul T4DNA 连接酶(Promega, M1801), 8.5ul 双蒸水，总体系为15ul，充分混匀，37 °C反应4h。
[0055]将连接后的体系转化到大肠杆菌ToplO感受态细胞(全式金生物技术有限公司，⑶101)。转化的具体步骤:将连接体系与感受态细胞混合后冰浴30min，42°C水浴热激90s，冰浴lmin。在混合体系中加入Iml LB培养基(配方:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L)于37°C摇床温育lh。铺板37°C培养12-16h。将平皿中单菌落挑入5ml LB培养基培养过夜，用试剂盒提取质粒(天根生化科技有限公司，DP103)。
[0056]4.重组腺病毒质粒的构建
[0057]I)准备大肠杆菌 BJ5183-AD1 感受态细胞(Stratagene，200157)；
[0058]2)利用Pme I (New England Biolabs, R0560)酶切、线性化并回收步骤3中得到的质粒，浓度约为IOOng/μ I ；
[0059]3)取出2管I)中准备好的BJ5183-AD1感受态细胞，放在冰上融化，将1_5 μ I (约I μ g)在2)中制备的线性化的质粒加入至含约50 μ I BJ5183-AD1感受态的1.5ml离心管中混匀，冰上放置30min,42°C热激90s转化,快速将离心管移至冰上,放置Imin后每管加Iml LB培养基，在37°C摇床温育lh，使细菌复苏；
[0060]4)取50 μ I步骤3)中的转化细胞液涂于50 μ g/ml卡那霉素(Sigma，K0879)抗性平板，37°C培养16-20h ；
[0061]5)次日挑取平板上长出的菌落(选择最小的菌落)，接种于3ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基，37 °C培养15h ；
[0062]6)用试剂盒提取质粒(天根生化科技有限公司，DP103)，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以Pac I (NewEngland Biolabs,R0547)单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段(约30kb)，及一条小片段(约3.0或4.5kb)，则确定为阳性克隆；
[0063]7)取1-5 μ I阳性质粒转化至大肠杆菌ToplO感受态细胞(全式金生物技术有限公司，⑶101)扩增细菌并提取质粒，得到的即为重组腺病毒质粒；
[0064]8)利用Pac I酶切，线性化并回收重组质粒。
[0065]5.重组腺病毒的包装
[0066]l)AD-293细胞(Stratagene，240085)在转染前24小时接种于六孔板的I个孔中，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基(Gibco, 12800-017)中，在 pH值7.2-7.4、温度37°C、相对湿度95%、5%C02的条件下培养，使之在转染时细胞汇合率为50-70% ；[0067]2)用 Lipofectamine? 2000Transfection Reagent 转染试剂(Invitrogen,11668027)，依照说明书将4 μ g线性化的重组质粒转染AD-293细胞；
[0068]3) 6个小时后移去上清液，加入3ml DMEM37°C预热的完全DMEM培养液(含10%胎
牛血清，1%青霉素/链霉素)；
[0069]4)在转染后7到10天，在显微镜下看到含绿色荧光的彗星状细胞脱落，将细胞从瓶中刮下并移入15ml锥形管。4000g, 5min离心后将细胞重悬于0.5ml磷酸盐缓冲液(PBS，配方:NaC1137mmol/L，KC12.7mmol/L，Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L)中。液氮中冻结细胞，37°C水浴中溶解40s-60s。此步骤共重复3次，中间可剧烈振荡一次；之后lOOOOg，IOmin离心，取上清液(含重组腺病毒)，存于-80°C冰箱。
[0070]6.重组腺病毒的扩增和纯化
[0071]I) AD-293细胞铺于含IOml完全DMEM培养基的IOOmm2培养皿中，在pH值7.2-7.4、温度37 °C、相对湿度95%、5%C02的条件下培养。至50-70%的汇合率时，用不含血清的DMEM5ml培育细胞半小时，之后加入100 μ I步骤5中得到的含重组腺病毒的上清液，10小
时后弃掉上清，换为正常完全培养基；
[0072]2)上述细胞被感染3-4天后，观察到有1/3到1/2的细胞脱离漂浮；此时，将细胞从皿中刮下并移入15ml锥形管。4000g，5min离心后将细胞重悬于Iml PBS中。液氮中冻结细胞，37°C水浴中溶解40s-60s。此步骤共重复3次，中间可剧烈振荡一次；之后lOOOOg，IOmin离心，取上清液(含重组腺病毒)，分装后存于-80°C冰箱。
[0073]3)为了进一步扩增和纯化，新铺20个175mm2细胞培养瓶的AD-293细胞，在pH值
7.2-7.4、温度37°C、相对湿度95%、5%C02的条件下培养。至50-70%的汇合率时，用不含血清的DMEMlOml培育细胞半小时，之后加入步骤2)中的病毒上清(每瓶50 μ I)孵育10h，之后换为含血清的完全培养基。2-3天后，将细胞从皿中刮下并移入15ml锥形管。4000g，5min离心后将细胞重悬于12ml PBS中。液氮中冻结细胞，37°C水浴中溶解40s-60s。此步骤共重复3次，中间可剧烈振荡一次；之后lOOOOg，IOmin离心，取上清液(含重组腺病毒);
[0074]4)病毒纯化:CsCl不连续梯度离心，20ml超速离心管中缓慢加入8mll.4g/mlCsCl(53g+87mL10mM Tris-HCl，ρΗ=7.9)，上面小心加入 6mLl.2g/mlCsCl (26.8g+92mL10mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入3)中获得的病毒上清液至体积达到20ml。平衡后，4°C,23000rpm,离心90min,用注射器抽吸下层蓝白色病毒带；
[0075]5)病毒透析去盐:配置透析液(IOmM Tris pH8.0, 2mM MgCl2,5%鹿糖)，灭菌处理。4°C透析，更换3次透析液，每次一小时，可基本去除CsCl，病毒保存于-80°C。
[0076]6)病毒滴度测定:在Eppendorf Biophotometer中测量透析后的病毒中的总蛋白量，Iyg病毒蛋白相当于4XIO9病毒颗粒；
[0077]7.RNA干扰沉默S100A4治疗肝纤维化
[0078]18只6周龄的BALB/c小鼠(购自维通利华公司)，分为两组(实验组:sh_S100A4组，以及对照组:sh-con组)，每组9只小鼠。将CCl4与玉米油(Sigma, C8267)按体积比1:9混合，按照每20g小鼠100 μ I的剂量腹腔注射，16小时后，通过尾静脉注射4X 101°个步骤6中制备的病毒颗粒，之后继续按照相同剂量一周两次注射CCl4与玉米油的混合液，共注射5次，在第5次注射CCl4与玉米油的混合液后48小时，断颈处死小鼠，取肝脏组织进行免疫组织化学染色观察肝纤维化程度。[0079]在尾静脉注射腺病毒7天后，取小鼠肝脏，通过免疫荧光染色检测肝脏细胞(具体方法参照文献 Zhang，J.，et al.FSPl+fibroblasts promote skin carcinogenesis bymaintaining MCP-l—mediated macrophage infiltration and chronic inflammation.The American journal of pathologyl78，382-390 (2011))，如图 2 所不，携带 GFP 标签的腺病毒在所釆用剂量下，即AXIOki个步骤5中制备的病毒颗粒，可以感染所取的全部肝脏组织。
[0080]同时，通过流式细胞术检测肝脏细胞(具体方法参照文献Zhao，X.，et al.TNFsignaling drives myeloid-derived suppressor cell accumulation.The Journal ofclinical investigationl22, 4094-4104 (2012))，如图 3 所示，携带 GFP 标签的腺病毒在所釆用剂量下，即4X 101°个步骤5中制备的病毒颗粒，可成功感染肝脏组织中的细胞。
[0081]在第5次注射CCl4与玉米油的混合液后48小时，通过肝组织匀浆的Westernblot检测S100A4蛋白质的表达，可以观察到sh-S100A4可成功抑制肝脏中S100A4的表达(图 4)。同时，通过参照所引文献(Wang，J.，et al.CD137_mediated pathogenesis fromchronic hepatitis to hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus-transgenicmice.Journal of immunology 185，7654-7662 (2010))中所述的方法对肝脏组织切片进行天狼星红染色(组织中胶原蛋白染色呈红色，其他组织染色呈绿色)，如图5所示，sh_S100A4组中的胶原含量明显少于sh-con组(p=0.0019，t检验)，说明sh_S100A4组的肝纤维化水平低于sh-con组。
[0082]参考文献
[0083]1.Batallerj R.&Brenner, D.A.Liver fibrosis.The Journal of clinicalinvestigation115, 209-218(2005).[0084]2.Cohen-Naftalyj M.&Friedman，S.L.Current status of novel antifibrotictherapies in patients with chronic liver disease.Therapeutic advances in gastroenterology4,391-417 (2011).[0085]3.Boyej K.&Maelandsmo, G.M.S100A4and metastasis:a small actor playingmany roles.The American journal of pathologyl76, 528-535(2010).[0086]4.Ambartsumian, N.，et al.The metastasis-associated Mtsl (S100A4)proteincould act as an angiogenic factor.0ncogene20,4685-4695 (2001).[0087]5.Kimj E.J.&Helfman, D.M.Characterization of the metastasis-associatedprotein,S100A4.Roles of calcium binding and dimerization in cellularlocalization and interaction with myosin.The Journal of biologicalchemistry278, 30063-30073(2003).[0088]6.Saleemj M., et al.S100A4accelerates tumorigenesis and invasion ofhuman prostate cancer through the transcriptional regulation of matrixmetalloproteinase9.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of Americal03, 14825-14830(2006).[0089]7.Zhang, H.Y., et al.S100A4mediated cell invasion and metastasis ofesophageal squamous cell carcinoma via the regulation of MMP_2and E—cadherinactivity.Molecular biology reports39,199-208 (2012).[0090]8.Voinnetj 0.&Baulcombe, D.C.Systemic signalling in gene silencing.Nature389, 553(1997).
【权利要求】
1.用于抑制哺乳动物S100A4基因表达的试剂在制备用于治疗所述哺乳动物的肝纤维化的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂是针对所述S100A4基因的RNA干扰试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述RNA干扰试剂包含与递送载体结合的针对所述S100A4基因的RNA干扰序列。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述递送载体选自:质粒载体、病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖和脂质体。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述递送载体选自:腺病毒载体和逆转录病毒载体。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述递送载体是腺病毒载体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物选自人、猴、狗、猫、牛、马、羊、猪、兔、小鼠和大鼠。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述哺乳动物是小鼠。
9.根据权利要求 7所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
10.一种药物组合物，其包含与递送载体结合的针对哺乳动物S100A4基因的RNA干扰序列，所述递送载体选自:质粒载体、病毒载体、胆固醇、纳米颗粒、壳聚糖和脂质体。
【文档编号】A61P1/16GK103520740SQ201310495250
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】秦志海, 陈琳, 李洁 申请人:中国科学院生物物理研究所