专利名称：筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物的方法。
背景技术：
筛选肝星状细胞激活相关蛋白有助于理解肝纤维化发生的分子机制，但由于基于传统双向凝胶电泳(2-DE)的蛋白质分离鉴定技术对于样本蛋白需要量较大，而原代肝星状细胞分离纯化困难，目前仅有Kristensen的研究组采用了双向凝胶电泳加银染的方法，鉴定比较了大鼠原代肝星状细胞激活前后蛋白表达的变化。由于方法所限，Kristensen等共计鉴定了约150种蛋白，其中43种蛋白在激活肝星状细胞中表达显著变化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、易操作的筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法。本发明的技术解决方案是一种筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法，其特征是包括下列步骤(I)原代肝星状细胞体外培养自动激活模型将原代肝星状细胞以O. 04%台盼蓝染色并进行细胞计数和活力检测，然后以含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培液稀释，调整细胞密度为IO6细胞/ml，接种于细胞培养瓶或培养板中，置于含5% C02，95%空气的37°C培养箱中培养，次日换液，以后每48hr换液，3-4天传代；通过UV激发波长观察肝星状细胞胞浆中维素A脂滴的自发荧光、苏丹III脂肪染色及免疫荧光检测大鼠肝星状细胞特异性标志结蛋白，所获原代肝星状细胞纯度高于90% ;体外培养第2-3天的肝星状细胞胞浆富含脂滴，为处于静止状态(D2);第10天的肝星状细胞脂滴大部分丢失，表达α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原，为处于激活状态(DlO)；(2)静止和激活肝星状细胞蛋白样品的制备0. 25%胰蛋白酶分别消化静止状态肝星状细胞及激活状态肝星状细胞，用4°C预冷的PBS洗3次，400 X g离心5min，弃上清，按每IO6个细胞100 μ I用量加入细胞裂解液，40C 15000g离心20min，取上清，Brandford法测定蛋白浓度，分装、_80°C保存备用；将来源于静止状态肝星状细胞和激活状态肝星状细胞的细胞总蛋白各100 μ g中，分别加入终浓度为8 lOmmol/L 二硫代苏糖醇，37°C Ih还原，再加入终浓度为20 25mmol/L碘乙酰胺室温避光30min进行烷基化修饰，最后用pH8. O 的90 lOOmmol/L三-(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)稀释上述样品使尿素浓度低于2mol/L，加入测序级胰蛋白酶，37°C孵育16h酶解，得到肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物；测序级胰蛋白酶与蛋白的质量比为I : 50。(3) iTRAQ结合2D nanoLC-MS/MS的差异蛋白组学分析经烷基化和酶解的静止和激活肝星状细胞蛋白样品分别用分子量114和116的iTRAQ试剂标记，室温孵育Ih后，两组标记了 iTRAQ试剂的蛋白样品混合、经阳离子交换柱进一步纯化后进行在线二维纳升级串联液相质谱分析；所得质谱数据通过Proteinpilot 软件搜索IPI非冗余数据库，参数设定如下MS允许误差范围为O. 10 O. 15amu，MS/MS允许误差范围为O. lamu，酶漏切位点为1，固定修饰为半胱氨酸甲基化修饰，蛋白鉴定标准为得分大于I. 3，对肽和蛋白进行鉴定和定量分析。所述细胞裂解液为4mol/L尿素，I % 3_[ (3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸(CHAPS)，O. 5%十二烷基磺酸钠(SDS)，1% 曲拉通 X-100 (Triton X-100)和 50mmol/L三-(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris-HCL)，ImM钒酸钠(Na3V04)，Roch蛋白酶抑制剂，pH8. O。本发明方法简单、易操作。通过本发明筛选出519种与肝星状细胞激活密切相关 的蛋白，为潜在的肝星状细胞激活及肝纤维化的生物标志，包括一些与细胞外基质(ECM)合成代谢相关、与免疫调控相关的蛋白(如biglycan, glypican-l, glypican-4和B7H3等)，与成纤维母细胞转化相关的蛋白(如calponin-l等)，经进一步验证可用于指导制备诊断肝纤维化及肝纤维化级别的试剂盒；而与肝星状细胞增殖、迁移相关的蛋白(如BAG2和BAG3等)可以指导研发抑制肝星状细胞激活、新型肝纤维化治疗药物。(表1，表2)表I激活肝星状细胞中上调的蛋白
登录号_基因名称_登录号_基因名称_
Asam Adipocyte adhesionFlna Filamin, alpha (Predicted), iso form
IPI00200134.1IPI00951791.1
moleculeCRA—a
IPI00391995.2 Tpml Isoform 2 of Tropomyosin IPI00214192.1 Sh3gl1 Endophilin-A权利要求
1.一种筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法，其特征是包括下列步骤 (1)原代肝星状细胞的分离培养和体外培养自动激活模型将原代肝星状细胞以O.04%台盼蓝染色并进行细胞计数和活力检测，然后以含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培液稀释，调整细胞密度为IO6细胞/ml，接种于细胞培养瓶或培养板中，置于含5% C02,95%空气的37°C培养箱中培养，次日换液，以后每48hr换液，3-4天传代；通过UV激发波长观察肝星状细胞胞浆中维素A脂滴的自发荧光、苏丹III脂肪染色及免疫荧光检测大鼠肝星状细胞特异性标志结蛋白，所获原代肝星状细胞纯度高于90% ;体外培养第2-3天的肝星状细胞胞浆富含脂滴，为处于静止状态;第10天的肝星状细胞脂滴大部分丢失，表达α -平滑肌肌动蛋白和I型胶原，为处于激活状态； (2)静止和激活肝星状细胞蛋白样品的制备0.25%胰蛋白酶分别消化静止状态肝星状细胞及激活状态肝星状细胞，用4°C预冷的PBS洗3次，400 Xg离心5min，弃上清，按每IO6个细胞100 μ I用量加入细胞裂解液，40C 15000g离心20min，取上清，Brandford法测定蛋白浓度，分装、_80°C保存备用；将来源于静止状态肝星状细胞和激活状态肝星状细胞的细胞总蛋白各100 μ g中，分别加入终浓度为8 lOmmol/L 二硫代苏糖醇，37°C Ih还原，再加入终浓度为20 25mmol/L碘乙酰胺室温避光30min进行烷基化修饰，最后用pH8. O的90 lOOmmol/L三-(羟甲基)氨基甲烷盐酸稀释上述样品使尿素浓度低于2mol/L，加入测序级胰蛋白酶，37°C孵育16h酶解，得到肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物；测序级膜蛋白酶与蛋白的质量比为I : 50 ; (3)iTRAQ结合2D nanoLC-MS/MS的差异蛋白组学分析经烷基化和酶解的静止和激活肝星状细胞蛋白样品分别用分子量114和116的iTRAQ试剂标记,室温鮮育Ih后,两组标记了 iTRAQ试剂的蛋白样品混合、经阳离子交换柱进一步纯化后进行在线二维纳升级串联液相质谱分析；所得质谱数据通过Proteinpilot 软件搜索IPI非冗余数据库，参数设定如下MS允许误差范围为0. 10 0. 15amu, MS/MS允许误差范围为0. Iamu,酶漏切位点为I,固定修饰为半胱氨酸甲基化修饰，蛋白鉴定标准为得分大于I. 3，对肽和蛋白进行鉴定和定量分析。
2.根据权利要求I所述的筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法，其特征是所述细胞裂解液为4mol/L尿素，I % 3- [ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸，0. 5%十二烷基磺酸钠，1%曲拉通X-100和50mmol/L三_(羟甲基)氨基甲烷盐酸，ImM钒酸钠，Roch蛋白酶抑制剂，pH8. O。
全文摘要
本发明公开了一种筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法，包括原代肝星状细胞的分离培养和体外培养自动激活模型、静止和激活肝星状细胞蛋白样品的制备步骤。本发明方法简单、易操作。
文档编号C07K1/14GK102618613SQ20121010005
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者刘海鸥, 姚婵, 季煜华, 季秋虹, 季菊玲, 陆锦标, 陆鹏, 鞠剑峰 申请人:南通大学