小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学领域，涉及小鼠肝脏特异性基因转染方法以及转基因人源化小 鼠模型的构建方法，包括肝脏高效表达调控元件调控的肝脏特异性重组慢病毒载体构建， 肝脏高效表达调控元件调控的重组慢病毒制备，通过水动力基因转染技术建立的持续表达 HCV入侵分子h⑶81和hOCLN并可被HCV自然感染的转基因人源化小鼠模型的建立。本发 明涉及该模型在未来的抗HCV药物筛选和疫苗评价中的医学应用。
【背景技术】
[0002] 慢病毒基因转染法是以慢病毒作为载体的基因转染方法。该技术作为一种常规 的基因转染方法，可以将外源基因递送到分裂期细胞或者不处于分裂期的细胞，通常被用 于基因治疗或转基因动物模型的建立。慢病毒载体系统是在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV)基因组的基础上改造而成。该载体系统由包装质粒、包膜 质粒和表达质粒构成，其中表达质粒是慢病毒载体的核心质粒。慢病毒载体系统相对于腺 病毒载体或重组逆转录病毒载体具有不可比拟的优势，可稳定整合于靶细胞基因组，实现 基因的持续稳定表达。然而，该技术由于诱导宿主天然免疫反应导致慢病毒的清除，从而造 成转染失败。
[0003] 水动力基因转移技术是一种简便、高效的体内基因转染方法，近年来已有成熟发 展。它是在高压下经小鼠尾静脉快速注射含目的基因重组质粒的生理盐水，从而在小鼠体 内（主要在小鼠肝脏）实现目的基因的高效表达，常用于动物实验和实验动物的造模。然 而，这种经典的小鼠活体动物转染技术也存在许多局限性，例如转入的目的基因重组质粒 在小鼠体内存留时间短，不能整合到宿主染色体内，从而无法实现基因的持续表达。然而， 该技术由于转染时间短，不易诱导宿主免疫反应。
【发明内容】
[0004] 针对现有的转基因人源化小鼠模型构建方法（慢病毒基因转染法和水动力基因 转移技术）中转染失败和表达时间短等问题，本发明的目的联合慢病毒基因转染法和水动 力基因转移技术，提供一种在肝脏中特异、持续表达外源基因的转基因人源化小鼠模型构 建方法。
[0005] 本发明所提供的基因转染方法，是将大于IO5IFU携带有目的基因的重组慢病毒溶 解于相当于小鼠体重8% -12%的生理盐水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，24小 时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达。
[0006] 在上述基因转染方法中，所述携带有目的基因的重组慢病毒的注射量优选为 IO6IFU,所述生理盐水的注射量优选为小鼠体重的10%，所述注射速度优选为3秒，所述目 的基因的表达时间优选为24小时以上。
[0007] 在上述基因转染方法中，所述目的基因可以根据需要构建的小鼠模型进行选择， 外源基因既可以是表达指示作用的报告基因，如萤火虫荧光素酶基因，还可以是介导外源 病原体进入肝细胞的分子编码基因，如介导HCV进入肝细胞的h⑶81和hOCLNcDNA。
[0008] 在上述基因转染方法中，用于构建携带有目的基因重组慢病毒质粒的出发质粒可 为任何一种表达外源基因的慢病毒表达质粒，如以P⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro为出发质粒构 建的携带Fluc基因的重组表达质粒为p⑶H-EFl-Fluc。
[0009] 所述的小鼠模型可根据需要构建的小鼠模型进行选择，如成年鼠、新生鼠或乳鼠， 优选6-8周龄的成年鼠。
[0010] 本发明还提供了一种转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
[0011] 1)携带目的基因的重组慢病毒载体构建；
[0012] 2)重组慢病毒制备；
[0013] 3)将携带有目的基因的重组慢病毒溶解于相当小鼠体重8% -12%的生理盐水 中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，24小时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达，得到 转基因小鼠模型。
[0014] 其中目的基因、出发质粒、小鼠类型均参考上述基因转染方法的内容。
[0015] 在肝脏特异性转基因小鼠模型构建中，所述目的基因为编码介导HCV感染肝脏的 基因，具体可为肝脏特异性增强子和启动子调控的h⑶81和hOCLN cDNA。
[0016] 具体肝脏特异性转基因人源化小鼠模型的构建，包含以下步骤：
[0017] (1)以P⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro为出发载体构建嵌合肝脏特异性增强子和启动子 序列调控的慢病毒表达载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro ;
[0018] (? 将 hCDSl 和 hOCLN cDNA 插入 pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro 中，分别构建重 组慢病毒表达质粒命名为 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-OCLN ;
[0019] (3)将质粒 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 分别转入包装细胞 得到慢病毒；
[0020] (4)将h⑶81和hOCLN基因的慢病毒各IO5IFU,溶解于生理盐水中，通过尾静脉将 两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，转染24h后得到肝脏中特异性表达hCDSl和 hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型。
[0021] 在肝脏中特异性表达h⑶81和hOCLN的转基因小鼠模型也属于本发明。
[0022] 所述转基因小鼠模在疫苗评价或抗HCV药物筛选中的应用也属于本发明。
[0023] 基于上述提供的基因转染方法、转基因小鼠模型构建方法、小鼠人源化肝脏特异 性基因转染方法，本发明联合了慢病毒基因转染技术和水动力基因转移技术，将慢病毒基 因整合特性和水动力的肝脏特异转染特性巧妙地结合在一起，通过该方法可以使外源性基 因特异性地在小鼠肝脏中表达，且验证对肝脏组织所造成的损伤可在4天左右恢复。该方 法可实现包含人源基因的重组慢病毒质粒在小鼠肝脏内表达目的蛋白。该技术可用于HCV 感染小鼠模型的建立和HCV疫苗评价和抗HCV药物筛选，例如，通过转染介导HCV入侵靶细 胞的分子h⑶81和hOCLN cDNA到6~8周的Balb-C小鼠，可以建立持续表达HCV入侵分 子的转基因人源化小鼠模型。用本发明的方法可以评价转基因人源化小鼠模型的肝脏对嗜 肝性病原体的易感性改变，也是建立疾病动物模型的一种手段，应用前景广泛。
[0024] 下面结合具体实施对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0025] 图1为重组慢病毒载体p⑶H-AlbEhAATP-Luc构建示意图
[0026] 图2A和图2B为活体荧光成像结果显示慢病毒水动力法转染重组慢病毒 PCDH-AlbEhAATP-Luc后不同时间点小鼠肝脏中萤火虫荧光素酶的表达情况
[0027] 图3A和图3B为慢病毒水动力法转染重组慢病毒p⑶H-AlbEhAATP-Luc后不同时 间点小鼠肝功能转氨酶ALT和AST的检测结果
[0028] 图4为重组慢病毒载体p⑶H-AlbEhAATP-h⑶81构建示意图
[0029] 图5为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hOCLN构建示意图
[0030] 图6显示实时定量RT-PCR法检测转基因人源化小鼠模型肝脏中h⑶81和 hOCLNmRNA的转录
[0031] 图7显示免疫组化法检测转基因人源化小鼠模型肝脏中h⑶81 (A)和hOCLN(B)分 子的表达
[0032] 图8显示实时定量RT-PCR法检测HCV阳性血清感染小鼠的肝脏中病毒核酸含量
[0033] 图9显示实时定量RT-PCR法检测HCVcc感染小鼠的肝脏中病毒核酸含量
【具体实施方式】
[0034] 针对现有的转基因人源化小鼠模型构建（慢病毒基因转染法和水动力基因转移 技术）分别存在转染失败和表达时间短的问题，本发明联合慢病毒基因转染法和水动力基 因转移技术，提供一种在肝脏中特异、持续表达外源基因的