调控4对棉花DELLA蛋白基因GhGAIs表达的植物表达载体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控4对棉花DELLA蛋白基因 GhGAIs表达的植物表达载体及其用途。
【背景技术】
[0002] 棉花是最重要的天然纤维作物，我国是世界上最大的产棉国和纺织品出口国，棉 花在我国国民经济中占有举足轻重的地位。
[0003] 棉花纤维是由棉花外珠被表皮细胞经起始、伸长、次生壁合成和成熟四个时期发 育而成的单细胞纤维。植物激素对棉花纤维的发育起着非常重要的调控作用。在棉花纤维 和胚珠中上调赤霉素（GA)、生长素（IAA)和油菜素内酯（BR)合成酶基因，提高胚珠和纤维 中相关激素的水平，可以促进棉花纤维的起始或生长、定向改良棉花纤维产量和品质性状， 表明植物激素对棉花纤维的发育起着非常重要的调控作用。关于靶标植物激素信号转导元 件从而调控植物激素在纤维发育中信号转导的研究目前还很少。
[0004] DELLA蛋白是GA信号传导途径中一个关键的负调控因子。GA通过诱导DELLA蛋 白的泛素化和降解，解除DELLA蛋白的抑制，促进GA反应基因的表达。此外，多种激素和 环境信号都能直接或间接调控DELLA蛋白的降解，进而影响植物的生长发育及对环境的反 应。迄今为止还未见通过调控棉花DELLA基因来改良棉花纤维的报道。根据棉花基因组 测序的结果，棉花中DELLA蛋白由1个基因家族编码，单个棉花基因组含有4个编码基因， 而异源四倍体的陆地棉中含有4对编码基因，分别命名为GhGAIlA和GhGAI ID、GhGAI2A和 GhGAI2D、GhGAI3A和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAMD (表1)。每对基因为不同亚基因组（A和 D亚基因组）上的直系同源基因，相同核苷酸序列>95%。前人通过克隆及异源表达等手段 分析了部分棉花DELLA蛋白基因的功能，但目前还没有棉花DELLA蛋白基因在棉花纤维发 育中功能的报道，也没有通过调控DELLA蛋白基因改良棉花纤维产量品质的报道。
[0005] 表1棉花DELLA蛋白基因及其在已测序的基因组中的编码序列
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是为提高棉花产量提供一种新选择。
[0008] 本发明的技术方案是调控4对棉花DELLA基因 GhGAIs表达的植物表达载和 GhGAI3D、GhGAMA 和 GhGAI4D。
[0009] 具体的，所述载体包含串联了革El向所述4对基因的RNAi元件，该RNAi元件具有如 SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列。
[0010] 具体的，调控所述RNAi元件的启动子为纤维次生壁合成期特异性启动子。
[0011] 优选的，所述的启动子为棉花FbLate-2基因启动子（pFbl2)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示。
[0012] 具体的，所述的植物表达载体具有如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。
[0014] 具体的，所述的宿主细胞为根癌农杆菌。
[0015] 本发明还提高棉花纤维产量的物质，其主要活性成分为所述植物表达载体，或者 含有所述植物表达载体的宿主细胞。
[0016] 本发明还提供了所述的载体在提高棉花纤维产量中的用途。
[0017] 本发明还提供了所述的宿主细胞在提高棉花纤维产量中的用途。
[0018] 本发明的有益效果：本发明通过研究和分析，证明DELLA蛋白在棉花纤维生长发 育中具有重要作用。并通过在棉花纤维次生壁合成时期全面下调8个DELLA基因 GhGAIs的 表达，获得了衣分（棉花纤维占种子重量的百分比）和衣指（百粒棉籽上纤维的重量）明 显提高的转基因棉花。试验结果证明，经本发明载体对目标基因进行调控后，改良的棉花衣 分和衣指明显提高，纤维产量明显增加。本发明方法简便易行，效果显著，有产生巨大经济 效益的潜力。
【附图说明】
[0019] 图I =GAIsRNAi的表达载体T-DNA区的基因结构图
[0020] CaMV35S-P，花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV35S-T，花椰菜花叶病毒35S终止子； D1-D4,棉花GAI1-4基因的DELLA和VHYNP结构域的编码序列，两个反向重复的D1-D4串联 序列及间隔序列构成GAIsRNAi元件；GUS:NPTII，β -葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融 合基因；LB，T-DNA左边界；Nos-T，农杆菌冠癭碱合成酶基因终止子；pFbl2,棉花FbLate-2 基因启动子；RB, T-DNA右边界。
[0021] 图2 :P5-pFbl2-GAIRNAi表达载体构建流程
[0022] 具体实验方法见实施例2。CaMV35S_P，花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV35S_T， 花椰菜花叶病毒355终止子；64^^〇^，4个棉花641片段的串联序列；《^ :即111，0-葡 萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；LB，T-DNA左边界；Nos-T，农杆菌冠癭碱合成酶 基因终止子；pFbl2,棉花FbLate-2基因启动子；RB, T-DNA右边界；REP origin，质粒复制原 点。相关酶切位点及位置在各个载体上标出。
[0023] 图3 :4对棉花DELLA蛋白基因 和GhGAI3D、GhGAMA和GhGAMD)在GAIsRNAi转基因棉花开花后18天纤维中的表达水平
[0024] WT代表非转基因棉花。FGi为GAIsRNAi转基因棉花，其后的数字显示不同的转化 子和纯合株系。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所用到的常规实验操作：
[0026] I. DNA 的提取
[0027] 基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab)提取，详细步骤见说明 书。
[0028] 2. RNA 的提取
[0029] RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab)提取，详细步骤见说明书。
[0030] 3. DNA片段的PCR扩增
[0031] 扩增体系如下：10XEx PCR buffer(Mg2+free)2. 5 yL，2. 5mmol/L dNTPs 2 yL， 25mmol/LMgCl22μL，引物l(5μmol/L)lμL，引物2(5μmol/L)lμL，ExTaqDNA聚合酶 1U，基因组DNA约60ng，加入ddH 20至25 μ L。
[0032] 扩增程序为：94°C，5min ;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，I. 5min，35 个循环；72°C 延伸lOmin。
[0033] 4. DNA片段的回收、连接和克隆
[0034] 使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4 DNA Iigase进行DNA片段 连接。回收的片段与PUCm-T (上海生工）载体建立如下连接体系：IOX T4 DNA连接缓冲液 1 μ L，载体DNA片段1 μ L，外源连接产物DNA片段1 μ L，T4 DNA连接酶1 μ L，用双蒸水补足 体积至10 μ L。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1 : 3,16°C连接12h。之 后将连接产物转化大肠杆菌DH5 α。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取 试剂盒提取质粒，酶切验证后，在Invitrogen公司测序。
[0035] 5.⑶S组织化学染色
[0036] 由于实验室采用的表达载体具有⑶S报告基因，一般用⑶S组织化学染色检测 跟踪转基因。具体方法：取少量转基因棉花叶片（有伤口）置于96孔板中，加入GUS染 液[O.lmol/L K3Fe(CN)6,0.1mol/L K4Fe(CN)6,0.01mol/L Na2EDTA，500mg/L X-Gluc，l % Triton X-100 (v/v)，0. 14mol/L磷酸钠缓冲液（pH7. 0)]，在37°C恒温条件下放置2h左右， 充分染液后再用75%乙醇脱色。植株叶片可被⑶S染液染成特异蓝色的植株为转基因阳 性。
[0037] 实施例1调控棉花DELLA基因的RNAi元件GAIsRNAi的获得
[0038] DELLA蛋白属于一个大的GARS蛋白家族，除在C端含有家族共有的GARS结构域 外，在N端具有DELLA蛋白特有约100个氨基酸的DELLA和VHYNP结构域。如前所述，陆地 棉含有4对DELLA蛋白的直系同源基因，成对共生同源基因的核苷酸序列相似性很高（相 同核苷酸>95 % )，而非直系同源基因的核苷酸序列相似性较低。为全面调控棉花DELLA蛋 白基因的表达，我们根据4对直系同源的DELLA蛋白基因，选取了编码4种DELLA蛋白的 DELLA和VHYNP结构域的D基因组序列（SEQ ID No. 1~4)。通过PCR方法将4个序列串 联，并最终扩增成含间隔序列的反向重复序列，即GAIsRNAi元件（SEQ ID No. No. 5)。该序 列在棉花中转录后，可以形成靶定4对DELLA蛋白基因的双链RNA序列，从而通过RNAi机 制下调这些基因的表达水平。同时，DELLA和VHYNP结构域的编码序列是DELLA蛋白基因 特有的，GAIsR