专利名称：：肝组织特异性表达rtTA的载体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肝组织特异性表达rtTA的载体及其应用，特别涉及该载体及其在创建肝组织特异性表达rtTA小鼠模型中的应用。
背景技术：
：肝组织特异性表达的rtTA，能被强力霉素(Dox)所诱导和激活，并与Tet反应性元件(TRE)的操纵基因序列TetO结合，发挥转录活性，实现外源基因肝组织特异性表达，以肝组织特异性表达rtTA的载体制备的转基因小鼠，可与TRE效应载体转基因小鼠杂交获得双转基因小鼠，通过强力霉素(Dox)诱导实现目的基因在小鼠肝脏特异性表达，可用于特定基因在个体发育中的功能及基因治疗研究、肝炎病毒基因表达及致病机制研究、uPA人鼠嵌合肝模型及肝炎病毒感染研究等。基因的组织特异性表达在生物体的个体发育过程中起重要作用，此过程受组织特异性启动子控制。组织特异性启动子在外源基因的组织细胞特异性表达、基因治疗等方面有重要的应用前景。组织特异性表达可降低机体免疫反应，并且避免对其他器官的副作用。目前已发现许多肝细胞特异性启动子，如甲胎蛋白(AFP)启动子、白蛋白(Albumin)启动子、al-抗胰蛋白酶(al-AT)启动子等，已被用于目的基因在肝组织特异性表达，如He等将白细胞介素-2(IL-2)构建在AFP增强子及白蛋白启动子驱动下，使得IL-2只在肝癌细胞系中表达(HeP，TangZY，YcSL，etal.Thetargetedexpressionofinterleukin_2inhumanhepatocellularcarcinomacells.JExpClinCancerRes，2000，19(2):183-187)。增强子等反应元件对这些启动子的转录活性也有影响，如Kramer等将白蛋白、al-AT、植物血凝素蛋白、乙肝病毒增强子II等各种肝特异性启动子和增强子随机串联组合，筛选出了能在肝细胞中长期稳定高水平表达的最佳组合(KramerMG，BarajasM，RazquinN，etal.Invitroandinvivocomparativestudyofchimericliver—specificpromoters.MolTher，2003，7(3):375-385)。血清白蛋白是由哺乳动物肝脏细胞合成的具有重要生理功能的蛋白质，其合成受到肝脏的生长发育调控，在发育过程中合成量逐渐升高，血清白蛋白只能由分化成熟的肝脏细胞合成，其他组织细胞中的白蛋白基因处于关闭状态(VorachetWR，St印panCM，LimaM，etal.Distantenhancersstimulatethealbuminpromoterthroughcomplexproximalbindingsites[J].JBiologicalChemistry,2000，275(37):29-31)。白蛋白基因主要在转录水平上受到白蛋白启动子(Albuminpromoter)调控，白蛋白启动子的克隆及真核表达载体构建对于外源基因的肝组织特异性表达具有重要意义。利用血清白蛋白启动子进行外源基因的表达具有较好的肝组织特异性，并且由于血清白蛋白在体内含量高，启动子在体内较高的转录活性。由于白蛋白的表达水平与白蛋白启动子活性密切相关，而肝癌细胞系中白蛋白的表达水平仅为肝脏细胞的5%10%，因此白蛋白启动子在肝癌细胞中的转录活性与体内肝脏细胞中的活性并不完全相同，在体内该启动子的转录活性可能远高于肝癌细胞系中的活性(ClaytonDF，WeissM，DarnellJE.Liver-specificRNAmetabolisminhepatomacells-variationsintranscriptionratesandmRNAlevels[J].MolecularCellularBiology,1985，5:2633;ZaretKS，DiPersioCM，JacksonSA，etal.Conditionalenhancementofliver-specificgenetranscription[J].ProcNatlAcadSciUSA，1988，85:9076)。利用该启动子建立肝组织特异性可调控表达的转基因动物模型是可行的。Tet-On系统是比较成熟的真核生物外源基因诱导表达系统之一，它利用大肠杆菌Tnl0转座子中四环素操纵子原理来实施调控外源基因在真核细胞中定量并特异地表达，具有高效、无毒、开/关较严密等特点，已被成功地应用于细胞和转基因小鼠诱导表达外源基因的研究。四环素操纵子(tetoperon)诱导表达系统利用细菌四环素操纵子的阻遏与去阻遏作用，实现外源基因在真核细胞中的表达，由于该系统调控元件来自原核生物，对真核细胞的基因表达不会有影响，具有高效和操作方便等优点。Tet-0n系统由两部分组成①Tet反应性元件(tetracyclineresponsiveelement,TRE)，由7拷贝的细菌四环素耐药操纵子的操纵基因序列(Tet0)和人类巨噬细胞的立早启动子(PminCMV)组成；②融合的转录活化因子rtTA(reversetet-controlledtranscriptionalactivator)，是由细菌的四环素阻遏物TetR和人类单纯疱疹病毒(HSV)的毒粒蛋白VP16转录激活蛋白融合而成的一个融合蛋白，能被强力霉素(Dox)所诱导和激活，并与Tet0结合，通过VP16发挥转录活性。此系统既有四环素阻遏物-操纵子相互作用的特异性，又具有VP16转录活化因子的激活潜能，它们在体外培养细胞和转基因小鼠中能使目的基因的表达提高约105倍(UrlingerS，BaronU，Thellma皿M，etal.Exploringthesequencespacefortetracycline—d印endenttranscriptionalactivators:novelmutationsyieldexpandedrangeandsensitivity[J].ProNatlAcadSciUSA，2000，97:7963-7968)。
发明内容本发明的目的是提供一种肝组织特异性表达rtTA的载体及其应用。本发明所提供的肝组织特异性表达rtTA的载体，其核苷酸序列包括依次串连的小鼠血清白蛋白增强子序列、小鼠血清白蛋白启动子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白蛋白增强子的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession.Version)为AC140220.4的5'端第104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白启动子的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession.Version)为AC140220.4的5'端第115631-115832位核苷酸序列;所述rtTA基因的核苷酸序列为自GENBANK号(Accession.Version)为U89930.1的5'端第774-1781位核苷酸序列。所述肝组织特异性表达rtTA的载体的出发质粒为pTet-on质粒。所述肝组织特异性表达rtTA的载体的核苷酸序列优选为序列表中序列1。本发明还提供上述的肝组织特异性表达rtTA的载体在构建肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠模型中的应用。所述培育肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠模型的方法，是将权利要求1-3中任意一项所述的肝组织特异性表达rtTA的载体酶切线性化后，显微注射到小鼠受精卵内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，对出生的小鼠筛选是否转入所述肝组织特异性表达rtTA的载体，筛选结果阳性的即为肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠模型。所述酶切线性化所用的内切酶为Xhol。本发明利用小鼠血清白蛋白基因增强子和启动子与Tet-On系统的有效结合，构建了成功创建转基因小鼠模型的载体，该载体创建肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠(Albumin:rtTA小鼠)模型的效率高(阳性率高)，并且其杂交一代也具有较高的阳性率，创建的小鼠模型均能稳定肝组织特异性高效表达rtTA。本发明通过上述载体创建Albumin:rtTA小鼠模型，为进一步构建肝组织特异可调控表达的转基因动物模型，用于特定基因在肝组织中功能研究以及实现肝组织特异的基因治疗奠定了坚实基础。图1为pTet-on-1ink酶切鉴定结果图2为pTet-on-albumin酶切鉴定结果图3为小鼠白蛋白增强子及启动子接头处测序鉴定结果图4为pTRE2_EGFP酶切鉴定结果图5为Tet-on系统中白蛋白启动子转录活性的体外鉴定结果图6为Albumin:rtTA转基因首建鼠鉴定引物设计示意图图7为Albumin:rtTA转基因首建鼠PCR鉴定结果图8为234号转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDHmRNART-PCR检测图9为232号转基因阴性鼠不同组织rtTA和GAPDHmRNART-PCR检测图10为222号转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDHmRNART-PCR检测图11为223号转基因阴性鼠不同组织rtTA和GAPDHmRNART-PCR检测图12为234号转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDH蛋白Westernblot检测图13为222号转基因阳性鼠不同组织rtTA和GAPDH蛋白Westernblot检测图14为232号和223号转基因阴性鼠不同组织rtTA和GAPDH蛋白Westernblot检测具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。下述实施例中所用的实验材料如下所示pGEM-7ZF购自Promega公司、pEGFP-Nl购自Clontech公司，Huh7细胞系购自武汉博士德生物工程有限公司，胎牛血清(FCS)购自Gibco公司，H印es、双抗，谷氨酰胺等均购自Clontech公司。DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Promega公司;RNeasyMiniKit购自Qiagen公司；脂质体转染试剂盒、Trizol试剂为Invitrogen产品。E.coliDH5acompetentcells禾口DNAstandardMarker购自北京t専迈H发展有限公司；QIApr印SpinMinipr印Kit禾口GelExtractionMiniKit购自Qiagen公司；T4DNApolymerase、PyrobestDNAPolymerase、T4D亂igase、TakaraRNALAPCRKit(AMV)Verl.1、DNAMarker购自Takara公司。蛋白酶抑制齐[jAprotinin、P印statinA、Leup印tin、PMSF均购自Amresco公司；限制性内切酶购自NEB公司和Takara公司；引物由上海生工合5成。TetRmonoclonalantibody(Cat.No.631108)购自Clontech公司；Anti-GAPDHpolyclonalantibody(Cat.No.G9545)购自Sigma公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG及HRP标记山羊抗兔IgG均购自中杉金桥公司；SuperSignalWestDuraTrialKit(Code#37071，Lot#KE132546)购自ThermoSCIENTIFIC公司。野生型C57BL/6J小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。四环素诱导性真核表达载体pTet-on和pTRE2质粒购自Clontech公司。转基因动物载体DNA显微注射由上海模式生物有限公司完成。实施例1、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin的构建及鉴定—、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin的构建[OO36]1、pTet-on质粒的改构为了将小鼠血清白蛋白基因启动子及增强子序列插入pTet-on启动子位置，以代替pTet-on载体中的CMV启动子，合成link以引入合适的酶切位点，依次为Spel、EcoRV、Spe工、Kpn工、Apa工、Not1、EcoRI;具体方法如下所述合成link弓l物，序列为tet_on_linkerF:5'-ctaggatatcactagtggtaccgggcccgcggccgcg-3'，tet_on_linkerR:5'_aattcgcggccgcgggcccggtaccactagtgatatc_3'，将tet-on-linkerF和tet-on-linkerR在PCR仪中95。C退火10min，获得PCR产物。将上述获得的PCR产物同样用EcoRI和SpeI双酶切，回收纯化后，插入到pTet-on的EcoRI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体，将获得的重组载体用EcoRV/SalI双酶切、EcoRV/BamHI双酶切鉴定(图1)，然后测序鉴定，结果表明linker已插入pTet-on载体中；将鉴定表明正确的含有上述PCR获得的link序列的重组载体命名为pTet-on-link。pTet-on-link的酶切鉴定结果如图l所示，图1中，泳道1为分子量marker，泳道2为EcoRV/SalI双酶切鉴定结果，泳道3为EcoRV/BamHI双酶切鉴定结果。2、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin质粒的构建将克隆并鉴定正确的增强子序列及启动子序列插入改构以后的pTet-on载体中，构建pTet-on-albumin载体，具体方法如下所述按照分子克隆的方法提取C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)肝组织基因组DNA，以此为模板PCR扩增小鼠血清白蛋白增强子序列(自GENBANK号(Accession.Version)为AC140220.4的5'端第104540-106528位核苷酸序列)，上游弓I物F5'-gccgagctcctgccggctagcttccttagcatg-3'(弓l入SacI位点)，下游弓l物R5'-gggttaaggatcccaagctggag-3'(存在BamHI位点)，PCR扩增获得1993bp的片段，经测序表明该片段具有自GENBANK号(Accession.Version)为AC140220.4的5'端第104540-106528位核苷酸序列，即为小鼠血清白蛋白增强子序列；将PCR获得的片段用SacI和BamHI双酶切，克隆至pGEM_7ZF载体SacI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将验证正确的含有小鼠血清白蛋白增强子序列的载体命名为p7ZF_Up_promoter。以小鼠C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)基因组DNA为模板PCR扩增小鼠血清白蛋白启动子序列(自GENBANK号(Accession.Version)为AC140220.4的5'端第115631-115832位核苷酸序列)，上游引物F5'-cgggatccacagctccagatggcaaacatac-3，(弓|入BamHI位点)，下游弓l物R5，-tttgccagaggctagtggggttg-3，，6扩增产物用BamHI酶切，经PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化获得小鼠血清白蛋白启动子。将p7ZF-up-promoter用BamHI和SmaI双酶切，切胶回收作为载体，将纯化后的小鼠血清白蛋白启动子连接入载体中，获得重组载体，将获得的重组载体用BamHI酶切鉴定并测序，将酶切鉴定和测序表明正确的重组载体命名为p7ZF-up-albumin。将p7ZF-up-albumin用SacI酶切，T4DNAPolymerase消平，KpnI酶切，切胶回收2233bp的片段，将回收的片段连接入EcoRV和KpnI双酶切后的pTet-on-link载体中，获得重组载体，将重组载体用BamHI酶切可见5022bp、1284bp、2689bp的条带出现(图2)，与预测结果相符；对重组载体的增强子和启动子接头处进行测序，结果与预期相符(图3)。将该载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的载体命名为pTet-on-alb咖in。pTet-on-albumin的序列中小鼠血清白蛋白增强子、小鼠血清白蛋白启动子和rtTA基因(自GENBANK号(Accession.Version)为U89930.1的5'端第774-1781位核苷酸序列)依次串连，该pTet-on-albumin的序列见序列表中序列1。其中小鼠血清白蛋白增强子、小鼠血清白蛋白启动子和rtTA基因分别是序列1中第115-2103位、第2109-2310位、第2370-3377位核苷酸序列。图2中泳道1为M2KplusMarker,泳道2为pTet-on-alb咖in的BamHI酶切鉴定结果，泳道3为15KMarker。二、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin的白蛋白启动子转录活性的体外鉴定1、pTRE2_EGFP载体的构建及鉴定为鉴定血清白蛋白启动子对rtTA的转录起始功能，我们构建了Tet-on系统中表达报告基因EGFP的效应载体pTRE2-EGFP，用于与pTet-on-albumin共转染，通过DOX的诱导表达检测血清白蛋白启动子在此系统中的功能。具体方法如下所述以BamHI和NotI双酶切pEGFP-Nl，回收720bp的EGFP基因序列，以相同的内切酶双酶切pTRE2载体，并将EGFP插入pTRE2载体的BamHI和NotI酶切位点之间得到重组载体，将重组载体用BamHI和NotI双酶切鉴定和测序鉴定，将鉴定表明正确的载体命名为pTRE2-EGFP。pTRE2-EGFP的酶切鉴定结果如图4所示，图4中，泳道1为分子量maker,泳道2为pTRE2-EGFP的BamHI和NotI双酶切鉴定结果。2、pTet-on-albumin的白蛋白启动子转录活性的体外鉴定将人肝癌细胞系Huh7培养于DMEM完全培养基中(10%(v/v)胎牛血清FCS(Gibco公司)，10mmol/L羟乙基呱嗪乙硫磺酸H印es，100u/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2mmol/LL_谷氨酰胺)37°C，5%C02条件下培养。转染前一天，将细胞分至六孔板，用不含双抗的培养基培养过夜，第二日按Invitrogen转染试剂盒说明书的要求将载体质粒pTet-on-albumin和pTRE2-EGFP分别以质量比为1:1的比例共转染人肝癌细胞系Huh7，转染8h后换液并加入四环素类似物Dox(lug/ml)，继续培养48h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达；分别以未转染(正常对照组)及转染但未加Dox(未诱导组)及pTet-on与pTRE2-EGFP共转染的Huh7细胞作为对照。上述实验原理加入强力霉素(Dox)诱导时，rtTA表现为活性形式，与pTRE2_EGFP中操纵基因序列Tet0结合，发挥转录活性，EGFP就会表达，可以观察到绿色荧光；不加入Dox时，rtTA表现为无活性形式，不与pTRE2-EGFP中操纵基因序列TetO结合，不发挥转录活性，EGFP不表达，观察不到绿色荧光。结果如图5所示，图5中A显示载体质粒pTet-on-albumin和pTRE2-EGFP共转染人肝癌细胞系Huh7在加入Dox诱导时可见少量绿色荧光，表明albumin启动子启动rtTA转录因子的表达，并在Dox诱导下发挥调节效应载体pTRE2-EGFP中报告基因的表达的功能；而未加Dox诱导的细胞(未诱导组)几乎未观察到绿色荧光蛋白表达(图未显示)。pTet-on与pTRE2-EGFP共转染的细胞可见强绿色荧光蛋白表达(图5中B)。图5中，A为pTet-on-albumin和pTRE2_EGFP共转染后经Dox诱导后结果；B为pTet-on和pTRE2_EGFP共转染后经Dox诱导后结果。三、肝组织特异性表达rtTA的载体pTet-on-albumin的白蛋白启动子转录活性的活体鉴定1、Albumin:rtTA转基因首建鼠制备及PCR鉴定pTet-on-albumin质粒用Xhol酶切，琼脂糖凝胶回收6034bp片段，进行C57XCBAFl小鼠受精卵(母本为CBA小鼠，父本为C57小鼠，均购自北京华阜生物科技股份有限公司)细胞原核DNA显微注射，注射卵分别移植到假孕母鼠输卵管中，转基因小鼠出生后第2周剪取约O.5cm鼠尾，提取基因组DNA，在转基因载体上下游各设计一对引物进行PCR鉴定，引物设计示意图及序列如图6所示，引物序列如下所述上游序列引物1-up-F:GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC;1-up-R:GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。下游序列引物1-down-F:GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG;1-down-R:ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC。PCR反应体系如下2.5ii110XBuffer(含MgCl2)，2ii1d證，0.2ii1Taq，0.5ii1(10iimol/L)引物(1-up-F和l-卯-R，或者l-down-F和1-down-R)，1.5ii1上述提取的基因组DNA，17.8illddH20。PCR反应条件如下先5°C5min;再4。C30S，54。C30S，72。C30S，进行34个循环；最后72°C7min。PCR阳性小鼠即为Albumin:rtTA转基因首建小鼠。结果表明，显微注射出生49只小鼠于2-3周龄剪尾抽提基因组DNA，经PCR筛选发现9只转基因阳性小鼠(部分PCR鉴定结果见图7)，耳号标记如下yc-063(早)，yc_051(早)，yc_071(早)，yc—073(早)，yc—065(早)，yc—068($)，yc_064($)，yc-056($)，yc-059($)。图7中A为上游序列引物鉴定结果，B为下游序列引物鉴定结果。图7中A和B中，泳道1-9为不同首建鼠，泳道10为分子量marker,泳道11为正常鼠，泳道12为阳性对照。2、Albumin:rtTA转基因Fl代鼠的获得与鉴定取步骤1获得的9只首建鼠，培养至8周龄性成熟首建鼠，将其与8周龄的野生型小鼠C57BL/6J交配，2周龄仔鼠进行耳号标记，其中4只首建鼠共产仔8窝，yc-063和yc-065分别产3窝，yc-064和yc-056分别产1窝，3周龄时剪尾按分子克隆提取基因组DNA，PCR检测阳性F1代小鼠，PCR体系及反应条件同步骤1。进行阳性鼠统计，统计结果如表1所示表1.Fl代转基因阳性鼠统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、转基因小鼠Fl代rtTA转录水平鉴定取不同首建小鼠所生F1代转基因阳性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代转基因阳性小鼠234和222)及阴性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代转基因阴性小鼠232和223)，断颈处死后剪取脑、胸腺、心、肺、肾、肠、脾、肝等不同组织少许(不超过30mg)，于1.5mlEP管中剪碎，总RNA提取使用RNeasyMiniKit(Qiagen，Cat.No.74106)，提取的总RNA经Nanodrop1000分光光度仪测定浓度及纯度，各种组织总RNA取400ng，使用TakaraRNALAPCRKit(AMV)Verl.l进行反转录反应，体系为2iilMgCl2(25,1/L)，1ii110XRNAPCRBuffer,lii1d證Mixture,0.25ii1RNaseInhibitor，0.5ii1AMVReverseTranscriptase,0.5li1Random9mers，0.5ulOligodT-AdaptorPrimer,400ngRNA，用RNaseFreedH20补足至10ii1体系，反应条件为30。C10min，42。C30min，99。C5min，5°C5min，在RT反应结束后加入以下PCR体系3ii1MgCl2(25,1/L)，4ii110XLAPCRBuffer11,31.75illdH20，0.25iiITakaraLATaq，O.5ii1引物(10iimol/L，分别用引物对rtTA-F和rtTA-R，或者GAPDH-F和GAPDH-R进行扩增)反应条件如下94。C2min，(94°C30S，56。C30S，72。C30S)X32，72。C10min，RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。总RNA提取过程中匀浆操作使用T10basicULTRA-TURRAX匀浆机5档匀浆40S即可(购自IKA公司)。引物序列如下rtTA-F:5—-GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG-3—rtTA-R:5—-ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC-3—GAPDH-F:5—-ACCACCATGGAGAAGGCTGC-3—GAPDH-R:5—-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3—Albumin:rtTA转基因Fl代阳性小鼠rtTAmRNA表达鉴定结果如图8-图11所示，结果表明234号阳性小鼠rtTAmRNA在肝组织特异性表达，222号阳性小鼠除在肝组织表达外，在肺和肾也有少量表达，232号和223号阴性小鼠各种组织均不表达。图8-图11中左图均为转基因鼠不同组织rtTART-PCR检测，右图均为转基因鼠不同组织GAPDHmRNART-PCR检测。图8-图11中左图的PC表示瞬时转染pTet-on质粒48h后Huh7细胞提取总RNART-PCR结果。4、Albumin:rtTA转基因阳性鼠Fl代rtTA蛋白表达鉴定Fl代转基因阳性小鼠(yc-063及yC_065所生Fl代转基因阳性鼠234和222)及阴性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代转基因阴性鼠232和223)不同组织总蛋白的提取，使用以下配方的组织蛋白裂解液10mM1MTris-HCl，l%(V/V)TritonX-lOO，1%(V/V)去氧胆酸钠，O.1%(V/V)10%(g/ml)SDS，0.4%(V/V)NP_40，150mMNaCl，5mMEDTA，0.2mM原钒酸钠，蒸馏水定容。提取前分别在组织蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂Aprotinin、P印statinA、Leup印tin、PMSF，使其终浓度分另U为2ug/ml，0.7ug/ml，0.5ug/ml，lmM。组织蛋白提取的具体方法为取不超过30mg各种组织，加入上述组织蛋白裂解液及4种蛋白酶抑制剂，TIObasicULTRA-TURRAX分散机5档匀桨40S后，冰浴30min，每5min振匀1次，13000rpm4。C离心15min，上清即为总蛋白溶液。总蛋白定量使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司，P0006)，各取50yg总蛋白溶液，加入5XSDS上样缓冲液及1/20体积|3-巯基乙醇，煮沸10min，10000rpm离心5min，上清用于rtTA蛋白的Western检测，其余置于_80°〇保存。rtTA蛋白检测一抗使用TetRmonoclonalantibody(Clontech，Cat.No.631108)，稀释度1:1000，GAPDH蛋白一抗使用Anti-GAPDHpolyclonalantibody(Sigma，Cat.No.G9545)，二抗分别使用HRP标记山羊抗小鼠IgG及HRP标记山羊抗兔IgG(中杉金桥公司，Lot.No.80259)，稀释度1:5000，显影液使用SuperSignalWestDuraTrialKit(ThermoSCIENTIFIC,Code#37071，Lot#KE132546)。Albumin:rtTA转基因Fl代阳性鼠rtTA蛋白表达鉴定结果如图12-图14所示，结果表明，234号和222号阳性鼠rtTA蛋白在肝组织特异性表达，而232号和223号阴性鼠则在各组织均不表达。图12-13中左图分别为转基因阳性鼠234和222不同组织rtTAWesternblot检测结果，右图均为左图中相应组织GAPDH蛋白Westernblot检测结果。图14为转基因阴性鼠232(左图)和223(右图)不同组织rtTAWesternblot检测结果，图12-14中PC均表示瞬时转染pTet-on质粒48h后Huh7细胞提取总蛋白Westernblot结果。取已鉴定rtTA蛋白在肝组织特异性表达的同窝Fl代转基因阳性鼠雌雄自交，所生F2代转基因阳性小鼠用于保种繁育。序列表〈160>1〈210>1〈211>8987〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉1ctcgaggagcttggcccattgcatecgttgtetccatetcateatetgtecatttetett60ggctcatgtccaacatteccgccatgttgacattgattettgacteggatatcactegct120tccttegcatgacgttccacttttttcteaggtggagcttacttctttgatttgatcttt180tgtgaaacttcccatcttccteagcttctgcttctctcagttttctgctt240gctcattccacttttccagctgaccctgccccctecc皿cattgctccac300tcatccagagcteagttttetegttgtttggatcgcateggtegcte朋g360aggtggcgacCC3C3C3tCCtteggcatgagcttgattttttttgatttegaaccttccc420ctctctgttcctegactecactecacattctgc皿gcategC3C3g3gC3atgttctect■tteattectttcattttcttgtetcctcac3gcctega皿ateacctgcgttecagcatc540cactcagtetcccttgagcatg郷tg織ctectteacategggacgagatggtecttt600gtgtctcctgctctgtcagcacttgctgat3CC3ggg皿tgtttgttctt660attccggacgtgtttgccttggccagttttccatgtecat720gtttggactgatc^tecagtcctctgcctagg皿皿ggccaacttgtct780acgtttegtetgtggctgteg腿gggtet3tg3朋tggC840agtcttecacatttttggcagcttettteaagtcttggtgtteagtecgctggagctgtc■acagcteccatctggg皿tgagtecacggggaccateagttectgacatt960cgtttcccattccatttgaatecacacttttgtcatggtettgcttgctgaaattgtttt1020gc皿皿皿皿ccccttcaaattetttteatteatttetct1080caatgtteteteggtecttetetecccaat1140aatcatttttaaacatttgtttettgagcttettetggatgaatctetctctetetectc1200tetetectct皿皿皿g皿g皿3g3ccategacaatcatctetttgatetgtgte朋gtt1260tecatgtgagatgctccatttctcactgteateccatttetegttecttg1320tggaattcteggactte皿tatttteagttttegctgggtgactggttgg1380gteagtectga朋gtttteg1440^gtgatcatteccctcteaCC3朋gttg3gctecag朋31500tttcaacateagctgteac3atgteatttgttgtctettttcttttgaga1560tecagttttttctgtctegctttggctgtcctggaccttgctctgtegaccaggttggtc1620ttgaactcagagatctgcttgcctctgccttgc皿gtgct3ggatte皿3gcatgtgcra1680ccactgcctggctecaatctatgtttteteagagattete皿gctctggctttgtgacat1740teatctttcagateateagtcttttggattgtgtctggag皿catec3g3ctgtgagrag1800atgttcagaggtetetttgctteggggtgaattc朋tctgcagc^teattetgagc3ga1860attectgacacttccattttatecgttctecttgctgatctetg朋3cat3gate3gcat1920gcaggcattcatcategttttctttetctgg皿3朋catt3皿tetg皿3g皿gcacttt1980atteatecagtttegatgtgttttgccatctttteatttctteag朋atecteagctgat2040gC3g3gtg皿gagtgtgtgaaaagcagtggtgcagcttggcttgaactcgttctccagct2100tgggatccacagctccagatggc皿3C3tecgc皿gggatttegtcaaacaactttttgg2160atgattttgt朋tggggtegg皿cc皿tga皿tgcgaggt皿gtetggtt2220aatgatctecagttettggtte皿g朋gtetettegagcgagtctttctgc3C3C3gatc2280acctttcctetc皿ccccactagcctctggaatcccgcggccatggcggccgggagcatg2340cgacgtcgggcccgcggccgcgaattcatetgtctagatta^gtgatte2400acagcgcattagagctgctt朋tg郷tcgg皿tcg皿ggttteacaacccgteaactcg2460cccagaagcttggtgt卿gcagcctacactgtettggca皿gcgggctt2520tgctcgacgccttegccattg卿tgttegtectcacttttgccctttea2580朋gggg咖gctggc朋gattttttecgcaateacgcteatgtgctttac2640teagtcatcgC朋tgg3gC3朋agtecattcagateracggcctecag皿皿3cagtetg2700aaactctcgaaaatcttagcctttttetgcc皿c皿ggtttttcactegag朋cgcgt2760tetetgcactcagcgctgtggggcattttecttteggttgcgtettgg皿gatengage2820atcaagtcgc3ggg3朋C3Cctectactgategtatgccgccattettec2880gac朋gctetcgaattatttgatcacc^ggtgcagagccagccttcttattcggccttg2940aattgatcatatgcggatte皿gtgggtccgcgtacagcc3000gcgcgcgtectacgggtcteccatcgagggcctgctcgatctcccggacg3060acgacgcccccga卿ggcggggctggcggctccgcgcctgtcctttctccccgcgggac31203C3CgCgC3gactgtcgacggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccact3180tegacggcgaggacgtggcgatggcgratgccgacgcgctagacgatttcgatctggaca3240tgttggggg3cggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctecg3300gcgctctggatatggccgacttcgagtttgteccgatgcccttggaattg3360acgagtecggtgggtegggggcgcg郷atteagatecattgatgagttt3420gg3C3朋CC3gcagtg皿皿aaatgctttetttgtgaaatttgtgatgct3480attgctttetttgteaccattateagctgccaattgeatt3540cattttetgtttcaggttcaggggg郷tgtgggaggtttgteaaacctc3600teca朋tgtggtetggctgattetgatcctgcaagcctcgtcgtctggccggaccacgct3660atctgtgcaaggtccccggacgcgcgctcccgcccgccgccgaggc皿ga3720ctcgggcggcgccctgcccgtcccaccaggtc皿caggcggteaccggcctettcategg3780gaatgcgcgcgaccttcagcatcgccggcatgtcccctggcggacggg朋gtetcagctc3840gaccaagcttggcg卿ttttcaggagcteagg皿gctea3900gatataccaccgttgatetetcccaatggcatcgte皿g3acattttgaggcatttcagt3960cagttgctcaatgtecctet朋CC3g3CCgttcagctgcatteatgaatcggcc皿cgcg4020cgggg卿ggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc4080gctcggtcgttcggctgcggcgagcggtetcagctcactca皿ggcggteateeggttat4140ccacagaatcgC3gg朋3g3皿皿ggCC3gc皿朋ggcca4200gg朋ccgtea朋aggccgcgttgctggcgtttttccateggctccgcccccctgacgagc4260tcgacgctca賜tc卿ggtggcg朋acccgacaggactete皿gatecc4320aggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctteccg4380gatecctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgte4440ggtetctcagttcggtgteggtcgttcgctcc皿gctgggctgtgtgcacgaaccccccg4500ttcagcccgaccgctgcgccttetccggteactetcgtcttgagtccaacceggteagae4560acgacttatcgccactggcagcagccactggteacaggattegcagagcg郷tetgteg4620gcggtgctecagagttcttg朋gtggtggccteactecggctecactega3gg3cagtet468012ttggtetctgcgctctgctg朋gccagtteccttcggaaaa卿gttggtagctcttgat4740CCggC3朋C3aaccaccgctggtegcggtggtttttttgtttgc皿gcagcagattecgc4800gcag皿朋皿3ggatctc皿gaagatcctttgatcttttctecggggtctgacgctcagt4860gg皿cg朋皿ctcacgtteagggattttggtcatgagattatcttcacct4920agatcctttttgaagttttegagte皿ctt4980ggtctg織gtteccaatgctteatcagtgaggcacctetctcagcgatctgtctetttc5040gttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtegateactecgatecggg郷gcttec5100catctggccccagtgctgcaatgateccgcg3g3CCC3Cgctcaccggctccagatttet5160cagc皿te皿ccagccagccgg皿gggccg3gCgC3g皿gtggtcctgcaactttetccg5220cctccatccagtctetteattgttgccggg皿gctegagt皿gtegttcgccagtteate5280gtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggta5340tggcttcattcagctccggttcccaacgatc皿ggcgagttecatgatcccccatgttgt5400gc皿皿朋gcggttegctccttcggtcctccgatcgttgtcag朋gteagttggccgcag5460tgttetcactcatggttetggcagcactgcateattctcttectgtcatgccatccgtea5520gatgcttttctgtgactggtgagtectc皿ccaagtcattctgag皿tegtgtetgcggc5580g紅gagttgctcttgcccggcgtcaatecgggateateccgcgccacat5640catcattggaaaacgttcttcggggcg腿actctcaaggatctteccgc5700tgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatctttta5760ctttcaccagcgtttctgggC3gg朋ggC33皿tgCCgC3a皿朋ggg朋5820t朋gggcgactgaatectcatectcttcctttttcaatettettg皿gca5880tttetcagggttettgtctcacatetttgaatgtattteg5940咖teggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcteag皿3ccatte6000ttatcatgacatteacctet朋a皿teggcgtetcacgaggccctttcgtcttcactcga6060ggtcg郷gatccagacatgateagatecattgatgagtttgg3C皿3CCac皿cteg朋6120aaaatgcttttttgtgatgctettgctttatttgteacca6180ttateagctggtteac皿c3acaattgcattcattttetgtttcaggttc6240gtggg郷tttttteaagca3gte朋acctctecaaatgtggtetggctg6300attetgatctctegtc皿ggcactetacatcaaatattccttetteacccctttacaaat6360朋ggtecac3atttttgagc3tegc3gac3ctctatgcct6420gtgtgg賜tegtetgttetgattetaactgttetgcctec6480tecag皿tetttttccateattttcttgtetegcagtgc3gctttttcctttgtggtgte6540皿tegc朋agc皿gc朋gagttctettect6600ttctg皿ggaaagtccttggggtcttctecctttctcttcttttttggaggagt卿atg6660gcagtegcctcatcatcacttcttctgagc6720ttcctcatteaaggcattccaccactgctcccattcatcagttccataggttggaatcte6780tcagtegtttattttetett6840teccttegagcttteaatctctgteggtegtttgtccaattetgtcacaccac3g皿gte6900aggttccttcggg3CC皿3gcggccatcgtgcctccccactcctgcagtt6960cgggggratggatgcgcggatagccgctgctggtttcctggatgccgacggatttgcact7020gccggtegaactccgcgaggtcgtccagcctC3ggC3gC3gctg皿cc皿etcgegaggg7080gategageccggggtgggcg朋g皿ctccagcatgagatccccgcgctggaggatcatcc7140agccggcgtcccgg朋朋cgattccgaagcccaacctttcateg皿ggcggcggtggaat7200cgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcc7260cgctcag朋gaactegtcaag皿ggcgateg皿ggcgatgcgctgcgaatCgggElgCggC7320gatecegtea3gC3Cg3gg33gCggtC3gCccattcgccgccaagctcttcagcaatetc7380aegggtegeeaacgetatgtectgatageggtccgccacacccagccggccacagtcgat7440g朋tccag朋朋gcggccattttccaccatgatettcggc皿gC3ggC3tcgccatgggt7500C3Cg3Cg3g3tcctcgccgtegggcatgegcgccttgagcctggcg皿cagttcggctgg7560cgcgagcccctgatgetettcgtccagatcatcctgatcg3C皿g3CCggcttccatccg7620agtecgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcg皿tgggc郷tegceggate7680朋gcgtetgcagccgccgcattgeatcagecatgatggatactttcteggC3gg3gC朋g7740gtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaat3gC3gCC3gtcccttcccgc7800ttcagtgaca3CgtCg3gC3cagctgcgcaagg皿cgcccgtcgtggccagecacgateg7860ccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggteggtet7920aaccgggcgcccctgcgctg3C3gCCgg皿C3CggCggC3tC3g3gC3gCcgattgtctg7980ttgtgcccagteatagcegaategcctctccacccaagcggccggag皿cctgcgtgcaa8040tccatcttgtteaatcatgeg^acgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcc8100cctgcgccatcagatccttggcggc朋g皿agccatccagtttectttgcagggcttccc8160aacctteccagagggcgccccagctggc皿ttccggttcgcttgctgtccat朋朋ccgc8220ccagtctagctatcgecatgtaagcccactgcaagctecctgctttctctttgcgcttgc8280gttttcccttgtccagategcccagtagctgacattcatceggggtcageaccgtttctg8340eggactggetttctecgtgttccgcttcctttegcagcccttgcgccctgagtgcttgcg8400gcagcgtgttgctegctttttgc皿朋gccteggcctccaa皿朋gcctcctcactectt8460ctgg朋tegcteagaggecgaggcggcctcggcctctgca3朋ttegtca8520gecatggggegg卿Eltgggcgg雄tgggeggagtteggggCgggEltgggcggagtteg8580gggCggg3Ctatggttgctgacteattgagatgeatgetttgcatecttctgcctgctgg8640ggElgCCtggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgeatgetttgeatect8700tctgcctgctggggElgCCtggggactttcc3cacccteactgacacacattccacagctg8760cctcgcgcgtttcggtgatgcctctgacacatgcagctcccgg卿cggt8820cacagcttgtctgteagcgg3tgCCggg3gC3g3C皿gCCcgtcagggcgcgtcagcggg8880tgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagegategeggagtgtetec8940tggctteactatgeggcategtectgagagtgcacra89871权利要求肝组织特异性表达rtTA的载体，其核苷酸序列包括依次串连的小鼠血清白蛋白增强子序列、小鼠血清白蛋白启动子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白蛋白增强子的核苷酸序列为自GENBANK号为AC140220.4的5′端第104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为AC140220.4的5′端第115631-115832位核苷酸序列；所述rtTA基因的核苷酸序列为自GENBANK号为U89930.1的5′端第774-1781位核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述肝组织特异性表达rtTA的载体的出发质粒为pTet-on质粒。3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述肝组织特异性表达rtTA的载体的核苷酸序列为序列表中序列1。4.权利要求1-3中任意一项所述的肝组织特异性表达rtTA的载体在构建肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠模型中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述培育肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠模型的方法，是将权利要求l-3中任意一项所述的肝组织特异性表达rtTA的载体酶切线性化后，显微注射到小鼠受精卵内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，对出生的小鼠筛选是否转入所述肝组织特异性表达rtTA的载体，筛选结果阳性的即为肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠模型。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述酶切线性化所用的内切酶为Xhol。全文摘要本发明公开了一种肝组织特异性表达rtTA的载体及其应用。该载体，其核苷酸序列包括包括依次串连的小鼠血清白蛋白增强子、小鼠血清白蛋白启动子和rtTA基因。该载体创建肝组织特异性表达rtTA的转基因小鼠(AlbuminrtTA小鼠)模型的效率高(阳性率高)，并且其杂交一代也具有较高的阳性率，创建的小鼠模型均能稳定肝组织特异性高效表达rtTA。本发明通过上述载体创建AlbuminrtTA小鼠模型，为进一步构建肝组织特异可调控表达的转基因动物模型，用于特定基因在肝组织中功能研究以及实现肝组织特异的基因治疗奠定了坚实基础。文档编号A01K67/027GK101717787SQ20091023741公开日2010年6月2日申请日期2009年11月6日优先权日2009年11月6日发明者周小军,周育森,孙世惠申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所