专利名称：一组高分化早期肝癌的分子标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组高分化早期肝癌的分子标志物及其应用。
背景技术：
肝炎是严重影响中国乃至世界人类健康的社会卫生问题，肝炎患者大部分为乙型肝炎或丙型肝炎而我国以乙型肝炎为主。虽然，我国的乙肝发病率仍居高不下，约25%左右的慢性HBV感染者最终发展为肝细胞癌(HCC)。全球3 4亿人为HBV慢性感染，中国就有 9300万以上HBV慢性感染患者。目前，已证明与肝癌有关的肝炎病毒主要为HBV及HCV。通过对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者进行的长期前瞻性研究发现，HBsAg阳性者发生肝癌的相对危险性(RR)为非携带者的13. 69倍，说明HBV与肝癌的因果关系强烈，并且这种关系有特异性。HBV致癌作用的分子机理尚不十分清楚。最近研究表明整合入宿主基因组的HBV基因能引起染色体不稳定，使其在很多位点发生杂合性缺失；激活原癌基因；肿瘤抑制基因和原癌基因甲基化状态的改变。肝癌形成也是一个多因素，多步骤，多基因参加的复杂过程，一般经历肝炎，肝硬化，不典型增生结节，肝癌的进展过程。我国80%左右的肝癌患者HBV检测阳性，其发病常伴有“肝炎一肝硬化一肝癌”的慢性过程。近年来，肝癌癌前病变DN (dysplastic nodule，不典型增生结节)日益受到重视。这些病灶在HBV，HCV感染的肝脏中发现且发展成为早期肝癌继而进入进展性肝癌阶段。另外，癌前期的早期治疗有效率可达90%，而进展期肿瘤的总体治愈率仅为5%。肝癌的5年生存率，亚临床期(I期)为 53.2%，中期(11期)为观.2%，而晚期(111)几乎是0%。因而，肝癌的早期诊断，早期治疗非常重要。硬化肝中的DN广泛被公认为是HCC癌前病变。DN可分为低度DN (LGDN)和高度 DN (HGDN)，HGDN 更趋于 HCC。Kobayashi M (Cancer，106 636-647，2006)等报道 HGDN 的累积癌变率分别为 1 年3. 5-46. 2%, 2 年:15. 5-61. 5%, 3 年:31-61. 5%, 5 年:48. 5-80. 8%, 远高于一般肝硬化的每年HCC的发生率2. 5-3. 7%。而HGDN和分化程度高的早期肝癌的鉴别诊断非常困难。目前临床上其鉴别诊断主要依靠影像学诊断或有丰富经验的病理学者的 HE染色切片镜下诊断。影响学诊断方法主要有超声波(US)，CT扫描，MRI等。杨文德(临床消化病杂志，第17卷，第5期，222-223，2005年)等探讨3种非创伤性影像检查方法US，CT 和MRI在肝癌诊断中的敏感性和准确性。他们回顾性地分析比较了 79例肝癌的US、CT及 MRI优缺点。其结果，肝癌确诊率为US: 73. 08%,CT: 87. 34%,MRI 87. 76%。US对早期肝癌的检出率较高，但确诊率较低。CT和MRI对中晚期肝癌确诊率较高。但任何一种单独的方法不足以满足临床的需要，需合理及综合利用，提高早期肝癌诊断。另外，关于分子标志物， 区别HGDN和高分化早期肝癌的分子标志物主要有⑶34和GPC3。而，⑶34在HGDN和肝癌中的表达水平差异小，而不能有效地区别它们(ifepatology，30:1174-1178，1999)。后来， 一些病理学家虽然利用典型的肝癌⑶34染色类型来区别HGDN，但其特异度还是比较低，且其肝癌CD34染色类型的判断比较繁琐(Am J Surg Pathol，33:874-885，2009)。GPC是广泛被应用的肝癌分子标志物。Coston丽等在2008年总结了 GPC的有效性(Am J SurgI^athol，32:433-44，2008)。结果，GPC3诊断高分化早期肝癌的准确度为80%，而在23%的高度不典型增生中也呈阳性，说明GPC3的特异度仅为77%，有待提高。另外GPC3不与肝癌的分化程度相关，所以不足以提示肝癌的进程。综上所述，现有技术中无论是分子标志物还是影像学方法其灵敏度和特异度均有限，且尚缺乏，高效区别高分化早期肝癌和高度不典型增生的免疫组织学诊断标志物。因此，发现高度不典型增生(HGDN)和高分化早期HCC的标志物将为临床提供强有力的鉴别诊断工具。另外，DN与HCC差异性表达的分子可以预测HCC的发生，也可以为阻断其发展成为 HCC提供线索和方案。因此，DN特异性标志物的发现及应用预计将给临床提供区分DN和肝癌的有效分子标志物。磷酸葡萄糖变位酶-1 (PGMl)是一种α -D-葡萄糖磷酸盐和α -D-葡萄糖-6-磷酸盐的变位酶。PGMl基因的缺失引起PGMl蛋白的缺损，导致糖原糖原累积病14 型。而从没有人报道PGMl与肝癌的相关性。死骨片-1 (SQSTMl)是可与泛素结合并通过TNF-α，肿瘤生长因子(NGF)和白介素-1调控NFKBl的活性。也可能与细胞的分化，凋亡，免疫反应等有关。也曾经有报道在乳腺癌和肝癌中增高的报道，但现有技术中并没有SQSTMl在高分化早期肝癌和高度不典型增生中表达差异的报道。
发明内容
本发明的目的是提出一组新的高分化早期肝癌的分子标志物，并提供该高分化早期肝癌的分子标志物在制备早期肝癌诊断试剂中的应用。为了达到上述目的，本发明提供了一组新的高分化早期肝癌的分子标志物， 包含磷酸葡萄糖变位酶-1 (PGMl)和死骨片-1 (SQSTM1)。葡萄糖变位酶_1在肝癌中低表达，而死骨片-1在肝癌中高表达。具体地，磷酸葡萄糖变位酶-1在LGDN，HGDN,高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中呈降低趋势。死骨片-1在LGDN，HGDN，高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中呈升高趋势。如图3所示，为磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1在LGDN， HGDN,高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中的表达水平的变化趋势图。本发明还提供了磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1作为早期肝癌的分子标志物组合在制备肝癌临床诊断试剂中的应用。磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1的组合可应用于临床肝癌病理切片的检查和鉴别诊断。鉴于已有的分子标志物CD34和GPC3的不足，本发明提供的2种蛋白是一组非常好的早期肝癌分子标志物。在临床的实验室应用中，可按照常规方法制备抗磷酸葡萄糖变位酶-1抗体和抗死骨片-1抗体，建立检测磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1的定性或定量方法以及配套试剂盒，以用于判断肝癌的进程和发病机制的研究。本发明还提供了一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含磷酸葡萄糖变位酶-1抗体和死骨片-1抗体。本发明发现了新的早期肝癌分子标志物，具有较高的检测灵敏度和特异度。
图1为免疫印迹方法证明磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1在不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。图2为免疫组织化学法证明磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1在不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。图3为磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1在LGDN，HGDN，高分化早期肝癌，中度分化早期肝癌中的表达水平的变化趋势图。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1 样本的收集及蛋白提取
1、取人的不典型增生结节病灶和早期肝癌病灶经2位病理科专家的HE切片的镜下诊断后，将对应的蜡块切成厚度为7 μ m的白片。在温度为60°C的条件下烘干直至切片组织与载玻片之间无气泡(大概30-60分)。2、甲醛固定/石蜡包埋(FFPE)组织蛋白的提取和蛋白浓度测定
2.1、将上述的肝组织切片置于二甲苯中进行脱蜡2次，每次10 min0风烘干后精确画出其病灶范围。用手术刀片(11号刀片)对病灶部分进行精确切割，并放入低吸附管。2. 2、在每个低吸附管中加入适量石蜡包埋组织蛋白提取缓冲液(Tris-HCl缓冲液)，该缓冲液含有质量浓度为1的十二烷基磺酸钠(SDS)和20mM三羟甲基氨基甲烷 (Tris), pH=9，每 50-400 mm2 组织加入 100-400 μ 1 缓冲液。2. 3、将上述低吸附管在100°C、转速为750rpm的条件下震荡20 min，再在80°C、转速为750 rpm的条件下震荡120 min，置于4°C条件下静置5 min后，加入罗氏(Roche)蛋白酶抑制剂(不含EDTA ) 2-8 μ L·2. 4、将样本转移至 Ultrafree-MC 离心超滤管(MiIlipore，Durapore PVDF 0. 45 μ m，0.5 ml)，在4°C、离心力为12000 g的条件下离心3 min (时间适当延长直至离心结束)得到蛋白样本。采用常规方法用BCA蛋白定量试剂(碧云天)进行蛋白定量。实施例2 免疫印迹法证明磷酸葡萄糖变位酶-1以及死骨片-1的表达差异
1、将实施例1提取得到的蛋白样本(每组各18例样本混合)，采用常规方法进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至PVDF膜(Millipore)上。2、将脱脂奶粉溶解在 pH=7. 4 的 TBS-T 缓冲液(0. 05% (v/v) Tween 20/Tris-缓冲液)中得到无脂肪牛奶溶液，脱脂奶粉的浓度为5% (w/v)，将上述无脂肪牛奶溶液加入到上述蛋白样本中，Ih后，加入一抗，4°C孵育过夜，用TBS-T洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标志的二抗，常温孵育lh。其中，一抗的公司和稀释倍率如下小鼠抗-PGMl (ab55616, Abeam, 1 300),兔抗-SQSTMl (P0067, Sigma-Aldrich, 1 1000),兔抗-α-Tubulin (abl5246, Abeam, 1 200)o 二抗的公司和稀释倍率如下山羊抗兔IgG抗体-HRP 标记(Goat Anti-Rabbit IgG-HRP，货号170-6515，Bio-Rad，1 20000)，山羊抗鼠 IgG 抗体-HRP 标记(Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP，货号170-6516，Bio-Rad， 1:20000)。3、采用常规方法显色，条带用ECL 蛋白印迹检测试剂(Pierce Chemical公司生产)发光5min后，曝光到χ-光胶片(Kodak公司生产)。最后用QUANTITY ONE软件(Bio-Rad 公司提供)进行定量。如图1所示，为免疫印迹方法证明磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-ι在不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。以α-微管蛋白(Tubulin)作为内参。实施例3 免疫组织化学法证明PGMl以及SQSTMl的表达差异
1、取人的不典型增生结节病灶和早期肝癌病灶经2位病理科专家的HE切片的镜下诊断后，将对应的蜡块用常规方法制成组织芯片，切成4μπι厚度切片，放到3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)涂抹的载玻片上。2、将载有组织切片的载玻片按照常规方法进行二甲苯脱蜡，水化(100%乙醇，95% 乙醇，85%乙醇各处理5min)，将载有组织切片的载玻片置于0. OlM柠檬酸盐缓冲液(pH6. 0) 中在100°C进行抗原修复处理3min，取出放置冷却，置于含有质量浓度为3%的H2A的磷酸盐(PBS)缓冲液中进行内源性过氧化物酶封闭处理30min，取出后，置于山羊血清中60min， 取出，加入一抗，4°C孵育过夜，用磷酸盐缓冲液冲洗后，用EnVision检测试剂盒显色。其中，抗体的生产公司和稀释倍数为小鼠抗-PGMl (ab55616, Abeam, 1:2000),兔抗-SQSTMl (P0067, Sigma-Aldrich，1:500)。3、采用常规方法进行蛋白表达水平定量连接Leica CCD相机的DFC420 Leica DM IRE2 显微镜(Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd, Cambridge, United Kingdom)上在X200视野拍代表性的区域。应用软件为Leica Qffin Plus v3软件。积分光密度值(Integrated Optical Density, I0D)利用 Image-Pro Plus v6. 0 软件(Media Cybernetics Inc，Bethesda，MD)计算得出。统计学软件为SPSS13. 0，制图软件主要为 GraphPad Prism 5。如图2所示，为免疫组织化学法证明磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1在不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。最上一行A为HE染色。由图可知PGMl在肝癌中低表达(B)，而SQSTMl在肝癌中高表达(C)。各个蛋白的表达水平用IOD表示，并绘制成箱须图(Box-whisker Plot)。图中 DN 组为 46 例，eHCC 组为 51 例。Mann-Whitney U 检验结果PGMl 为 p<0. 0001，SQSTMl 为 p<0. 0002。实施例4 肝癌诊断试剂盒及其应用 1、一种肝癌诊断试剂盒，由以下试剂组成 抗原修复液(O. OlM柠檬酸盐缓冲液，pH=6. 0)；
含有质量浓度为3%的H2A的磷酸盐(PBS)缓冲液，pH=7. 4 ； 山羊血清；
小鼠抗-PGMl (ab55616，Abcam公司提供，稀释倍数1:2000)； 兔抗-SQSTMl (P0067, Sigma-Aldrich 公司提供，稀释倍数 1 500)； EnVision检测试剂盒(兔/鼠通用)(DAK0公司提供)。2、应用上述肝癌诊断试剂盒进行肝癌诊断的方法如下
2.1、采用常规方法对免疫组化结果进行蛋白表达水平定量连接Leica CXD相 1/1W DFC420 Leica DM IRE2 MitH (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd, Cambridge, United Kingdom)上在X 200视野拍代表性的区域。应用软件为Leica Qffin Plus v3 软件。禾只分光密度值(Integrated Optical Density，I0D)禾Ij用 Image-Pro Plus v6. 0 软件(Media Cybernetics Inc，Bethesda，MD)计算得出。统计学软件为 SPSS13. 0， 制图软件主要为GraphPad Prism 5。2. 1、另外，病理科医生或者研究人员可通过显微镜下的观察对免疫组织化学的结果进行评估。其方法为，综合考虑染色强度和阳性细胞数的比率。染色强度无黄色为0， 阳性强度淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞数阳性细胞数<15%为0 分，15%-25%为1分，25%-50%为2分，>50为3分。将每种蛋白的染色强度分数和阳性细胞数分数相乘，得出该蛋白的阴性或阳性结果，既0分为阴性(-)，1-2分为弱阳性(-)，3-4分为中等阳性(++)，6-9分为强阳性(+++)。至少1种蛋白为阴性可判断为早期肝癌。
权利要求
1.磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1作为早期肝癌的分子标志物组合在制备肝癌临床诊断试剂中的应用。
2.一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含磷酸葡萄糖变位酶-1抗体和死骨片-1抗体。
全文摘要
本发明提供了一组高分化早期肝癌的分子标志物及其应用。所述的一组高分化早期肝癌的分子标志物，包含磷酸葡萄糖变位酶-1(PGM1)和死骨片-1(SQSTM1)。本发明还提供了磷酸葡萄糖变位酶-1和死骨片-1作为早期肝癌的分子标志物组合在制备肝癌临床诊断试剂中的应用。本发明还提供了一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含磷酸葡萄糖变位酶-1抗体和死骨片-1抗体。本发明的优点是具有较高的检测灵敏度和特异度。
文档编号G01N33/50GK102175843SQ20111002257
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者刘银坤, 康晓楠, 李岩, 郭坤, 金光植 申请人:复旦大学附属中山医院