转基因人源化小鼠模型构建方 法。实施例基于前述技术方案，是对技术方案的详细说明，不应理解为对其的限制。实施例 中使用了具体的目的基因、出发载体及各种实验材料以达到具体公开的目的，与其类似功 能的材料可以做等同替换，也属于本发明公开内容。
[0035] 下述实施例中所用方法如无特殊说明均未常规方法。实施例中PCR法扩增目的基 因所需引物见表1，RT-PCR法测定转基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表达所需引物见 表2。
[0036] 表1:PCR法扩增目的基因所需引物
[0038] 表2: RT-PCR法测定转基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表达所需引物
[0039]
[0040] 实施例1、慢病毒水动力基因转染方法的建立
[0041] 该实施例以具有表达指示作用的报告基因萤火虫荧光素酶基因作为外源基因的 代表，说明慢病毒水动力基因转染方法的成功建立。
[0042] 一、重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-Luc的构建
[0043] 重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-Luc是将AlbEhAATP-Luc序列（序列表中 序列1)插入慢病毒载体pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro (购自SBI公司）的SpeI和NotI位点间 得到的载体。
[0044] 具体制备如下：
[0045] 以慢病毒质粒pGL3(Pr〇mega公司）为模板，加入扩增目的基因的引物（见表 1)，PCR方法扩增萤火虫荧光素酶（Luc)基因，经XbaI和Not I双酶切后插入慢病毒骨 架载体P⑶H-EFI-MCS-T2A-Puro的酶切位点之间，构建为重组慢病毒表达载体，命名为 pCDH-AlbEhAATP-Luc (见图 1)。
[0046] 二、重组慢病毒的包装和浓缩
[0047] 将质粒p⑶H-AlbEhAATP-Luc利用脂质体介导的方法转入包装细胞293FT，进行慢 病毒的包装。收集转染3天的细胞培养上清，33500rpm，4°C，离心2h超速离心，得到浓缩的 重组慢病毒。
[0048] 三、慢病毒水动力基因转染方法的建立
[0049] 将步骤二中浓缩的重组慢病毒，选择6~8周的雄性Balb-C小鼠5只（购自军事 医学科学院实验动物中心），将IO 5IFU的病毒溶解于小鼠体重10%的生理盐水中，以4秒 的速度注入小鼠尾静脉中，分别在转染后的3天，7天，15天和30天，按照150mg/Kg的用量 小鼠腹腔注射Fluc的作用底物D-Luciferin(购自Promega公司），5min后麻醉小鼠，置于 IVIS活体荧光成像仪进行监测。通过活体成像技术可以观测到小鼠腹部肝脏位置有强烈的 信号，结果如图2A所示，萤火虫荧光素酶表达量见图2B。在转染后的第2天和第4天分别 对小鼠进行尾静脉取血，进行转氨酶ALT和AST的测定，结果如图3A和图3B所示，表明在 转染后的第四天小鼠肝功恢复到正常水平。
[0050] 如前所述，本实施例慢病毒水动力基因转染，是将大于IO5IFU的重组慢病毒溶解 于相当于小鼠体重8-10%的生理盐水中，以小于5秒的速度注射于小鼠尾静脉中，3天后即 能检测到目的基因在小鼠肝脏处获得了表达。
[0051] 实施例2、慢病毒水动力基因转染方法构建h⑶81和hOCLN的转基因人源化小鼠模 型
[0052] 将实施例1建立的转基因方法实际应用到生物医学相关实践当中，本实施例通过 该方法构建HCV感染的动物模型。
[0053] 一、重组慢病毒载体 PCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 的构建
[0054] 重组慢病毒表达载体 PCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 为分别将 AlbEhAATP-hCD81(序列表中序列2)和AlbEhAATP-hOCLN(序列表中序列3)插入慢病毒载 体pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro (购自SBI公司）的SpeI和NotI位点间得到的载体。
[0055] 具体制备如下：
[0056] 分别以小鼠肝癌细胞H印al_6(吕丽萍，贾帅争，王海平，詹林盛，王全立.人 LDLR基因的克隆及在H印al-6细胞中的表达.军事医学科学院院刊，2004 ;28:212-214) 和人肝癌细胞（Huh7. 5. 1)的DNA为模板，设计扩增目的基因的引物（表1)，使用PCR方 法扩增小鼠肝脏特异性白蛋白增强子序列（AlbE)和人肝脏特异性α-抗胰蛋白启动子序 列（AATP)，平端连接后构建为嵌合肝脏特异性增强子序列和启动子序列（In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters)，经 SpeI 和 XbaI 双酶切后插入处理好的慢病毒骨架载体pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro (购自SBI公司）的酶 切位点之间，构建为嵌合肝脏特异性增强子和启动子序列调控的慢病毒表达载体，命名为 pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro。
[0057] 设计扩增目的基因的引物（表1)，利用TRIzol (Promega)从QSG 7701细胞 (肝内皮细胞系，吕刚萍等，Hepatocytes transduced with human TERT gene acquire a prolonged lifespan in culture and retain permissiveness to hepatitis B virus.Acta virologica，2013 ;57:305-311)进行总 RNA 的提取，以提取的 RNA 为模板， Oligod⑴15为引物，进行反转录PCR，以合成的cDNA为模板，分别加入扩增目的基因（hCD81 或hOCLN)的特异性引物进行PCR扩增。扩增h⑶81的反应程序为94°C 2min预变性后， 94°C 30sec, 58°C 30sec, 72°C 30sec, 35 个循环后，72°C 7min。扩增 hOCLN 的反应程序为 94°C 2min 预变性后，94°C 30sec, 58°C 30sec, 72°C I. 5min, 35 个循环后，72°C 7min。1%琼 脂糖凝胶电泳后回收目的片断，与T-Vector的连接后转化，挑取阳性克隆进行序列测定。 测定结果显示扩增的序列正确。挑取测序正确的克隆进行摇菌扩增，提取质粒，利用限制性 内切酶XbaI和NotI将目的片断切下，插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro中，分别构建了 重组慢病毒表达载体 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 (图 4)和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN (图 5)。
[0058] 二、重组慢病毒的包装和浓缩
[0059] 将质粒 PCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 利用脂质体介导的方法 分别转入包装细胞293FT，进行慢病毒的包装。收集转染3天的细胞培养上清，33500rpm， 4°C，离心2h超速离心，得到浓缩的慢病毒。
[0060] 三、慢病毒水动力基因转染方法建立肝脏中特异性表达h⑶81和hOCLN分子的转 基因人源化小鼠模型
[0061] 收集并浓缩带有h⑶81和hOCLN基因的慢病毒各IO5IFU,溶解于相当于BALB/c小 鼠（6~8周，购自军事医学科学院实验动物中心）体重10%的生理盐水中，以4秒的速度 通过尾静脉将两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，24小时后目的基因在小鼠肝脏 中获得表达，即能得到肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型，该 模型可持续到转染后的第14天仍保持稳定。
[0062] 通过以下实验确证肝脏中特异性表达h⑶81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模 型的构建成功：
[0063] (1)转染14天后，将小鼠