抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带人乳头瘤病毒16 型（Human Papillomavirus Type 16, HPV-16)突变型ETni9Jjt原基因的重组腺相关病毒载 体（rAAV)及其构建方法与其在制备抗HPV-16感染及其相关疾病治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 腺相关病毒（AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了 AAV 的末端重复片段（上游5'端片段，下游3'端片段）（Samulski RJ, Srivastava A, Berns KIjMuzyczka N. Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33:135-143.)〇 1984 年， Hermonat等人描述了 AAV的低感染颗粒（Lip)基因和包膜（Cap)基因 （Hermonat PL，Labow MAj Wright R，Berns KIj Muzyczka N. Genetics of adeno-associated virus:isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants. J Virol. 51:329-339. Hermonat,P. L. , and Muzyczkaj N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6466-6470.) 〇 1986年，Labow等人鉴定了位于上游5'端片段和复制蛋白（Rep)基因之间的p5启动子 (Labow MA, Hermonat PL, Berns ΚΙ. Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome. J Virol. 160:251-258. )〇
[0003] AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒（如腺病毒）的基因产物辅 助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对（bp)，两端为 重复末端片段（TR)，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒包 膜（Cap)基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因（治疗基因）长 度有限等方面的缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可 明显增加外源性基因的容量。此外，将具有治疗作用的外源性基因插入rAAV中，可制备成 具有感染性的rAAV病毒颗粒。
[0004] 1984年，美国Paul L. Hermonat率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗 (Hermonat, P. L. , and Muzyczka, N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6466-6470.)。目前，主要是欧美国家在进 行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有10 余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进彳丁，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入 患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕 金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿 瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使 用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型（AAV-I)携带外 源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病（LPLD)的基因药物。
[0005] 人乳头瘤病毒（HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属。目前至少 分离出130多种亚型。根据不同亚型，可分为高危型和低危型。其中对人类危害最大的是 高危型，包括HPV-16、18、30、31、33、35、39与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等恶性肿瘤 密切相关。其中99%以上的宫颈癌是由高危型HPV引起的，而半数以上的宫颈癌是HPV-16 所致。
[0006] HPV属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读 码框架（El-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，具有致 癌作用的E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的癌蛋白E6、E7蛋白分别与 抑癌基因 P53和Rb结合，引起细胞增殖失控，抑癌基因对DNA的损伤修复功能丧失，导致癌 前病变及癌症的发生。
[0007] 据2003-2004年来自美国的国家健康和营养研究课题的一个调查结果显示， 14-59岁女性的HPV总感染率为26. 8 %。中国的HPV感染的流行情况尚未有正式报道，每 年约有20万以上的宫颈癌新发现病例，发病率和死亡率有增加趋势，且宫颈癌发病年龄年 轻化，可以推测HPV感染率不乐观。但目前尚无确切治愈HPV感染的方法，而现阶段的HPV 疫苗有可能预防HPV-16和HPV-18感染，但对于已经感染的人群无效。为达到治愈目的， 最理想的治疗是彻底清除受感染的细胞。而受感染的细胞均存在HPV-16 E7抗原。因此， HPV-16 E7抗原是细胞免疫治疗非常理想的靶子。但是，HPV-16 E7抗原是一种致癌蛋白， 在宫颈癌等恶性肿瘤的发生中发挥最主要作用之一。因此，在体内和体外用野生型HPV-16 E7抗原刺激免疫反应的发生，在安全性方面存在一定风险。因此，必须除去野生HPV-16 E7 抗原的致瘤性，消除该风险。
[0008] 人树突状细胞（Dedritic Cells，DC)是人体最重要、也是最主要的抗原提呈细胞。 大量的研究已经证明无论在体内还是体外，DC细胞均可诱导或刺激产生具有抗感染和抗肿 瘤的细胞免疫反应。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种携带无致病性（即无致瘤性）的人乳头瘤病毒16型 (HPV-16)突变型E7抗原基因的重组腺相关病毒（rAAV)载体。
[0010] 本发明所提供的rAAV载体，是将剔除腺相关病毒（AAV)结构基因 Rep和Cap并带 有AAV的p5启动子、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子 和SV40病毒早期启动子中的任意一个启动子的AAV载体作为出发载体，将突变型HPV-16 ETni91抗原基因插入出发载体中，获得一种全新的rAAV载体，即携带HPV-16 E7 "91抗原基因 的重组腺相关病毒载体（简称aEYni91重组腺相关病毒载体"或AAV/HPV-16 E7 "91)。
[0011] 其中所述AAV载体由本专利申请的发明人成功构建，构建方法参见中国专利 ZL201110125683. X〇
[0012] 这里，突变型HPV-16 ETni91抗原基因是通过分子生物学技术，将野生型HPV-16 E7抗原基因进行突变，具体是将HPV-16(美国NCI基因库：KC935953)的E7抗原蛋白第 91位的半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，通过将HPV-16 E7基因开放读码框nt271 (序列 表中位置，对应图3中nt832)的胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的 tgc(nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，获得可以表达无致瘤性的突变型HPV-16 E7抗 原基因，命名为HPV-16 Ε7"91基因，所述HPV-16 Ε7"91基因的核苷酸序列如序列表中序列1 所示。
[0013] 由于HPV-16 Ε7η91免疫原性未受影响，可将其插入以上所述腺相关病毒载体中，该 AAV载体带有AAV的ρ5启动子、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动 蛋白启动子和SV40病毒早期启动子四种启动子的一种，将获得的全新携带HPV-16 ETni9JA 原基因的重组腺相关病毒载体统称为aETni91重组腺相关病毒载体"或AAV/HPV-16 E7 "91。
[0014] 利用以上设计，也可将野生型HPV-16 E7抗原基因插入上述腺相关病毒载体中，获 得携带野生型HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体，统称为"E7重组腺相关病毒载 体"或AAV/HPV-16 E7，HPV-16 E7基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。但由于野生 型HPV-16 E7抗原具有致瘤性，故本发明不推荐用于临床实践，仅用于研究。
[0015] 本发明的第二个目的是提供上述AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 Ε7"91重组腺相关 病毒载体的构建方法。
[0016] 本发明所提供的构建方法，包括以下步骤：
[0017] 1)使用常规的分子生物学技术方法，先获得HPV-16 Ε7抗原基因，再将其进行突 变，即将E7抗原蛋白的第91位半胱氨酸改变为甘氨酸，详细过程为将HPV-16 E7基因开放 读码框（nt271)的胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt271-273) 改变为编码甘氨酸的ggc，即获得无致瘤性的突变型HPV-16 ETni91基因；
[0018] 2)将HPV-16 Ε7"91抗原基因或野生型HPV-16 E7抗原基因插入已将腺相关病毒结 构基因 R印和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带HPV-16 E7"91抗原基因的重组腺相 关病毒载体（AAV/HPV-16 Ε7"91)或携带HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体（AAV/ HPV-16 E7)。
[0019] 上述载体中ET