一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法

专利名称：一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法
专利说明一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法 本发明涉及一类可用以抗癌治疗的基因重组的新型超抗原融合蛋白质，描述了编码此类融合蛋白质的多核苷酸和氨基酸的序列，以及它们在大肠杆菌的表达和分离纯化。目前对于癌症疾病的药物治疗主要是以化学药物为主，副作用大，化学药物在杀伤癌细胞的同时也伤害了正常细胞，化学药物缺乏针对癌细胞的特异性作用。
为了解决药物的特异性问题，抗体是一类很有效的工具，是一种常用的癌细胞特异性定位导向载体，它可以特异地作用于癌细胞。抗体本身可以封闭癌细胞，它的Fc片段能引起细胞毒作用。抗体也可以接上一个毒素蛋白质，引导毒素蛋白质杀死癌细胞。
超抗原(Superantigen)也能引起细胞毒作用，它是一类特殊的抗原分子，主要是一些细菌的毒素和逆转录病毒基因的产物，不需要抗原提呈细胞的加工处理，而以完整的蛋白质形式直接与细胞膜上的MHC II类分子结合形成复合物，识别TCR的Vb片段，激活比普通抗原多得多的T细胞(包括CD4+，CD8+)，并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用。
超抗原与人类多种急、慢性疾病的发生有关，但在抗肿瘤研究中也发挥了独特的作用，尝试用它激活的T细胞来杀伤肿瘤，并取得了一定的成果，目前较有研究基础的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素A、B等。因为超抗原无抗肿瘤的特异性，它也会作用于表达MHC II类分子的正常细胞上，直接用于抗肿瘤会产生副作用，临床使用有很多的限制。
为了解决超抗原的无抗肿瘤特异性问题，人们将超抗原连接到抗体上，由抗癌抗体将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal-enterotoxin A，SEA)定位到癌细胞上(M.Dohlsten，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8945-8949，1994；J.Ihle，et al，Cancer Res.，55，623-628，1995)。
要使抗体成为药物，就必须对于鼠源抗体进行人源化的基因工程改造。由于抗体药物的使用剂量很大，常常需要数十毫克/人/次，这就要求提高基因工程抗体的动物细胞的表达水平以及发展大规模发酵技术。所以抗体药物的研究开发的周期和投资成本是非常巨大的。
除了抗体外，与癌细胞生长有关的细胞因子也被用于癌细胞的定位。例如表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)被连接到RNA水解酶(H.Jinno，et al，Cancer Chemother.Pharmacol.，38，303-308，1996)和毒素(A.Schmidt，et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，277，499-506，2000)，碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelial cell growth factor，VEGF)和转化生长因子(Transforming growthfactor-α，TGF-α)也分别与毒素形成融合蛋白质(Biochem.Biophys.Res.Commun.，277，499-506，2000；L.M.Veenendaal，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，7866-7871，2002；A.Kihara and I.Pastan，Cancer Res.，54，5154-5159，1994)。而其它的细胞因子也有报告，例如白细胞介素-4(Interleukin-4)和白细胞介素-2(Interleukin-2)则分别被连接到毒素上(S.R.Husain，et al，Cancer Res.，58，3649-3653，1998；J.M.Dore，et al，FEBS Lett.，402，50-52，1997)。
以上的工作都使用细胞因子与蛋白质毒素或RNA水解酶所组成的融合蛋白质的形式，思想方法是出于同样的战略模式(E.B.Sweeney and J.R.Murphy，Essays Biochem.，30，119-131，1995)。在这些细胞因子的癌细胞定位的作用下，蛋白质毒素和RNA水解酶才特异地杀伤癌细胞或者治疗其它疾病。但是这个作用机制是不同于抗体的Fc片段以及超抗原，后两者是动员机体的免疫系统来激发抗癌的细胞毒作用。
癌细胞是由正常细胞转变而来的，癌细胞的抗原是自身抗原，所以癌细胞能够逃避免疫系统的监视。人们一直在寻找新的抗癌方法来提高癌症病人的免疫力，特别是针对癌细胞的特异性免疫力。为了有效地开发针对癌症的特异性药物，本发明利用超抗原和细胞因子的各自特性，构建一种新型细胞因子-超抗原融合蛋白质，促进癌细胞生长的细胞因子可以将融合蛋白质定位到癌细胞上，而超抗原则在癌细胞周围引起抗癌的免疫反应，即超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigen-dependent-cellular-cytotoxicity，SDCC)。利用此方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到癌细胞并在癌细胞周围引起抗癌的细胞毒免疫反应。
超抗原的种类可以是金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal-enterotoxin，SE)家族的SEA，SEB，SEC，SED，SEE；链球菌毒素(Streptococcal pyrogenicexotoxin，SPE)的SPE-A，SPE-B，SPE-C；以及其它包括病毒蛋白质在内的各种来源的超抗原以及它们的自然和人为的变异体。这些蛋白质同样可以说明本发明的思想。
细胞因子可以是表皮生长因子EGF，血管内皮细胞生长因子VEGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF，转化生长因子TGF-α，白细胞介素IL-4以及白细胞介素IL-2；以及其它包括人和鼠等在内的各种物种来源的与癌或其它疾病有关联的细胞因子以及它们的自然变异体和人为的变异体。这些蛋白质同样可以说明本发明的思想。
本发明选择了一个崭新的战略，将超抗原连接到细胞因子上，这样产生了新型的细胞因子-超抗原融合蛋白质，作为一个模型，本发明使用表皮生长因子EGF和血管内皮细胞生长因子VEGF分别与超抗原SEA来构建这种新型的融合蛋白质。
在此虽然只选择超抗原SEA，当然超抗原SEB和SEC以及其它超抗原也能够说明本发明的思想。抗原SEA或其它超抗原的作用是激发机体内的免疫反应。
同样，作为实验材料的表皮生长因子EGF和血管内皮细胞生长因子VEGF只是利用它们癌细胞的定位作用，采用与癌细胞紧密相关的其它细胞因子也能够说明本发明的思想。
考虑到本发明的融合蛋白质可以由各种类型的细胞因子与超抗原构建，所以采用了一个通用的蛋白质纯化方法，即按照同样的方法来纯化各种融合蛋白质。此方法是利用一个Cellulose binding domain(CBD)作为纯化用的Tag，质粒pET-34b(Novagen公司)含有这个CBD-Tag。
采用与癌紧密有关的细胞因子作为癌细胞定向的载体，是因为癌细胞通常大量表达这些细胞因子的受体。以EGF为例，癌细胞膜上通常异常地大量表达EGF受体，EGF通过与EGF受体相互作用来促进癌细胞的生长。同样癌组织也通过异常高表达VEGF受体来接受VEGF的信号，促进癌组织血管异常生长，从而使得整个癌组织不断扩大。
而正常细胞膜上的这些受体的表达量没有或很少，所以细胞因子也可以起着癌细胞的特异性定位作用。利用EGF和VEGF能认识癌细胞的特性，把超抗原SEA分别连接到EGF和VEGF上，就能使得SEA集中在癌细胞的周围，特异地激发免疫反应，产生极其强大的针对癌细胞的细胞毒作用。单独使用超抗原SEA会产生全身用药的副作用，而采用融合蛋白质就会使得只在癌组织周围集中由SEA所诱导的大量T杀伤细胞。
超抗原SEA与T细胞激活产生增殖和产生细胞毒作用呈剂量依赖关系，其范围在每只小鼠0.1μg～100μg，最大效应出现在注射后24小时，96小时内消失，SDCC最大效应浓度为每只小鼠1μg，效应高峰在第48小时，96小时内消失(G.Hedlund，et al，Cancer Immunol.Immunother.，36，89-93，1993)。
所以融合蛋白质可以发挥类似于抗体-SEA的作用，而采用这个方法能够节约药物开发成本，例如小鼠抗体人源化和大规模动物细胞表达生产。所以超抗原SEA的药物就能大大地降低药物生产和病人医疗成本，同样含有超抗原SEA的本发明的融合蛋白质也可以大大地降低使用剂量。
SEA基因早在80年代就报道了(I.Y.Huang，et al，J.Biol.Chem.，262，7006-7013，1987；M.J.Betley and J.J.Mekalanos，J.Bacteriol.，170，34-41，1988)。
EGF基因也在80年代早期被发现了(J.Smith，et al，Nucleic Acids Res.，10，4467-4482，1982；A.Gray，et al，Nature，303，722-725，1983)，它的成熟形式是53氨基酸的多肽。
VEGF基因是在80年代后期被发现(D.W.Leung，et al，Science，246，1306-1309，1989；P.J.Keck，et al，Science，246，1309-1312，1989)，由于mRNA的不同剪切，它的成熟形式有多种形式，长度可以是189、165以及121氨基酸的多肽(E.Tischer，et al，J.Biol.Chem.，266，11947-11954，1991)。
EGF-SEA和VEGF-SEA仅仅是用来说明本发明的材料，而本发明的思想范围可以拓展，例如可以采用各种类型的细胞因子和超抗原以及它们的变异体，对融合蛋白质的结构进行改造，这些变异体可以完善其生物学功能以及减少其可能产生的副作用。
融合蛋白质可以是EGF-SEA和VEGF-SEA形式，也可以是SEA-EGF和SEA-VEGF形式，在空间上两种蛋白质是独立的，所以两种形式都可以使得细胞因子和超抗原独立地发挥作用。
连接这两种蛋白质的Linker的氨基酸组分和长度则可以是各种形式，过短的Linker会造成细胞因子和超抗原因过分接近而产生空间阻碍，合适的Linker对于充分发挥细胞因子和超抗原的作用是至关重要的。
以上的各种融合蛋白质基因可以转入动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、细菌等生物体在内的重组工程化宿主细胞，表达方式可以是分泌和不分泌等各种形式。无细胞体外翻译系统也可以用来进行融合蛋白质的生产。
融合蛋白质也可以通过化学交联反应等化学反应手段分别将细胞因子和超抗原的多肽片段进行连接，例如共价键连接，从而构建成融合蛋白质。
对于融合蛋白质可以进行化学修饰、缺损融合蛋白质的一部分多肽片段以及将其它多肽连接在这些蛋白质上等一系列的改造。
纯化后的融合蛋白质可以通过一系列蛋白质的变性和复性过程来完善其包括二硫键在内的空间结构，从而提高它的生物活性。
本发明阐述的是一种新的抗癌方法，即把细胞因子和超抗原构建成融合蛋白质，由细胞因子将超抗原定位到癌细胞上，从而在癌细胞周围发生抗癌的细胞毒免疫反应。
融合蛋白质不但可以起着和抗体相似的特异性抗癌作用，而且由超抗原所激发的T细胞杀伤效果要大于抗体，使用剂量却远远低于抗体药物的用量，这样就可以大大地降低生产成本。
作为药物形式应用的融合蛋白质可应用于抗癌和免疫疾病等医学的临床方面，它们和防腐剂、乳化剂、脂质体、分散剂、安定化剂等一起制成各种注射、口服、敷贴以及手术处理等药物的给药形式。
除了融合蛋白质本身可以作为药物外，编码融合蛋白质的核苷酸片段或载体还可以作为基因治疗形式来应用。例如将这些核苷酸片段注射动物体内并被转入细胞，从而表达融合蛋白质。

图1是表示用PCR方法构建EGF-SEA融合蛋白质基因的构建图。
图2是表示用PCR方法构建VEGF-SEA融合蛋白质基因的构建图。
图3表示了EGF-SEA融合蛋白质纯化后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
图4表示了VEGF-SEA融合蛋白质纯化后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
图1中的实验过程是首先经过第一次PCR反应分别取得EGF和SEA基因的DNA多核苷酸片段，然后利用Overlap extension PCR方法将这两个片段连接在一起，这样就将形成的EGF-SEA融合蛋白质的基因片段插入一个大肠杆菌表达用的载体并进行融合蛋白质的生产。
图2中的实验过程是首先经过第一次PCR反应分别取得VEGF和SEA基因的DNA多核苷酸片段，然后利用Overlap extension PCR方法将这两个片段连接在一起，这样就将形成的VEGF-SEA融合蛋白质的基因片段插入一个大肠杆菌表达用的载体并进行融合蛋白质的生产。本发明采用的是EGF-Linker-SEA和VEGF-Linker-SEA的形式，Linker是一个短的多肽，它将EGF和VEGF分别与SEA连接在一起。
根据已知的SEA、EGF和VEGF基因序列，设计一系列的引物，通过多聚酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)分离这些基因，再用PCR方法将EGF和VEGF分别与Linker和SEA形成一个融合蛋白质的DNA片段。然后将这个基因片段插入一个大肠杆菌表达质粒，在T7启动子的控制下，融合蛋白质大量表达，最后将表达的融合蛋白质进行分离纯化。
本发明实验中所使用的编码蛋白质和多肽的形式(1)成熟形式的SEA；(2)53氨基酸的EGF；(3)121氨基酸的VEGF；(4)用于连接细胞因子和超抗原的Linker，它的多核苷酸组成是GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG，编码了15氨基酸的GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer多肽。
使用的大肠杆菌质粒是pET-34b(Novagen公司)，长度约为6kb，它含有启始密码子ATG以及终止信号TAA，在这两者之间有多个限制酶位点以及用于分离纯化的CBD-Tag，在此采用的是SrfI和NotI限制酶位点，另外作为选择用的抗生素是卡那霉素，T7启动子控制基因表达。
实施例1、分离超抗原SEA基因按照常规的分子生物学实验方法(T.Maniatis，et al，Molecular cloning，Alaboratory manual，Second edition，Cold spring harbor laboratory，1989)，用酚/氯仿抽提法从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus FRI337)的DNA，根据文献上的超抗原SEA基因的序列(M.J.Betley and J.J.Mekalanos，J.Bacteriol.，170，34-41，1988)设计引物(1)含有SrfI限制酶切点的正向引物，5’-GAGCCCGGGCAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAAT-3’；(2)含有NotI限制酶切点的反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。用此引物将SEA基因进行PCR扩增反应。模板的量为0.1微升，PCR反应的循环条件95℃30秒→55℃30秒→72℃120秒，一共是30个循环反应，最后是72℃10分钟。DNA片段的长度大约是700bp。
将这个DNA产物进行低融点胶的电泳，回收DNA片段，再对这个片段进行SrfI和NotI限制酶处理后，得到的基因片段插入pET-34b质粒，DNA连接酶的反应是16℃12小时。最后进行DNA测序。
实施例2、分离表皮生长因子EGF基因根据已报告的表皮生长因子EGF基因序列设计引物(J.Smith，et al，NucleicAcids Res.，10，4467-4482，1982)(1)含有SrfI限制酶切点的正向引物，5’-GAGCCCGGGCAATTCCGATAGCGAGTGT-3’；(2)含有NotI限制酶切点的反向引物，5’-GTGCGGCCGCTCTAAGTTCCCACCATTT-3’。利用PCR方法从Human breast carcinoma cDNA基因文库(Clontech公司)中分离EGF基因，它编码一个53氨基酸的多肽。模板的量为0.1微升，PCR反应的循环条件95℃30秒→55℃30秒→72℃30秒，一共是30个循环反应，最后是72℃10分钟。DNA片段的长度大约是170bp。
将这个DNA产物进行低融点胶的电泳，回收DNA片段，再对这个片段进行SrfI和NotI限制酶处理后，然后将基因片段插入pET-34b质粒，DNA连接酶的反应是16℃12小时。最后进行DNA测序。
实施例3、分离血管内皮细胞生长因子VEGF从报告的血管内皮细胞生长因子VEGF基因序列(P.J.Keck，et al，Science，246，1309-1312，1989；E.Tischer，et al，J.Biol.Chem.，266，11947-11954，1991)中设计VEGF-121的引物(1)含有SrfI限制酶切点的正向引物，5’-GAGCCCGGGCGCACCCATGGCAGAAGGAGGA-3’；(2)含有NotI限制酶切点的反向引物，5’-GTGCGGCCGCCCGCCTCGGCTTGTCACATTTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTT-3’。利用PCR方法从Human breast carcinoma cDNA基因文库(Clontech公司)中分离VEGF-121基因，它编码一个121氨基酸的多肽。模板的量为0.1微升，PCR反应的循环条件95℃30秒→55℃30秒→72℃50秒，一共是30个循环反应，最后是72℃10分钟。DNA片段的长度大约是370bp。
将这个DNA产物进行低融点胶的电泳，回收DNA片段，再对这个片段进行SrfI和NotI限制酶处理后，然后将基因片段插入pET-34b质粒，DNA连接酶的反应是16℃12小时。最后进行DNA测序。
实施例4、用含有Linker的引物构建EGF和SEA的融合蛋白质的基因通过Overlap extension PCR方法(R.M.Horton，et al，Methods Enzymol.，217，270-279，1993)，采用编码一个15氨基酸多肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)的多核苷酸片段来连接EGF和SEA。
第一组引物1、含有SrfI限制酶切点的EGF基因正向引物，5’-GAGCCCGGGCAATTCCGATAGCGAGTGTCCT-3’；2、含有一部分Linker的EGF基因反向引物，5’-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-TCTAAGTTCCCACCATTTCAG-3’，下线表注的是Linker的一部分序列。
第二组引物1、一部分Linker的成熟SEA基因正向引物，5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-AGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAA-3’，下线表注的是Linker的一部分序列；2、含有NotI限制酶切点的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。
首先用第一组和第二组的引物分别合成EGF基因和SEA基因的DNA片段，模板是实施2和实施1的经过DNA测序的基因，这是第一步PCR反应。然后进行电泳，切割含有DNA片段的凝胶，这样就去除了PCR反应的引物。
取出以上微量的两种基因片段的DNA回收液并将这两者混合，加入DNA多聚酶，将两个DNA片段连在一起，这个片段就是新一轮PCR反应的模板，再加入第一组引物(1)和第二组引物(2)，反应条件是95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是3个循环反应。
再加入引物(1)含有SrfI限制酶切点的EGF基因正向引物，5’-GAGCCCGGGCAATTCCGATAGCGAGTGTCCT-3’；(2)含有NotI限制酶切点的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。最后进行PCR反应，PCR反应的循环条件95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是30个循环反应，最后是72℃10分钟。
这样就构建成了EGF和SEA的融合蛋白质的基因片段。
实施例5、用含有Linker的引物构建VEGF和SEA的融合蛋白质的基因与实施例4类似，采用Overlap extension PCR方法。
第一组引物1、含有SrfI限制酶切点的正向引物，5’-GAGCCCGGGCGCACCCATGGCAGAAGGAGGA-3’；2、含有一部分Linker的VEGF基因反向引物，5’-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-CCGCCTCGGCTTGTCACATTTTTC-3’，下线表注的是Linker的一部分序列。
第二组引物1、一部分Linker的成熟SEA基因正向引物，5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-AGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAA-3’，下线表注的是Linker的一部分序列；2、含有NotI限制酶切点的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。
首先用第一组和第二组的引物分别合成VEGF基因和SEA基因的DNA片段，模板是实施3和实施1的经过DNA测序的基因，这是第一步PCR反应。然后进行电泳，切割含有DNA片段的凝胶，这样就去除了PCR反应的引物。
取出以上微量的两种基因片段的DNA回收液并将这两者混合，加入DNA多聚酶，将两个DNA片段连在一起，这个片段就是新一轮PCR反应的模板，再加入第一组引物(1)和第二组引物(2)，反应条件是95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是3个循环反应。
再加入引物(1)含有SrfI限制酶切点的VEGF基因正向引物，5’-GAGCCCGGGC GCACCCATGGCAGAAGGAGGA-3’；(2)含有NotI限制酶切点的SEA基因反向引物，5’-GTGCGGCCGCACTTGTATATAAATATATATCAATATGCAT-3’。最后进行PCR反应，PCR反应的循环条件95℃30秒→55℃30秒→72℃150秒，一共是30个循环反应，最后是72℃10分钟。
这样就构建成了VEGF和SEA的融合蛋白质的基因片段。
实施例6、在大肠杆菌中分别表达EGF-SEA和VEGF-SEA的融合蛋白质的基因(A)构建表达质粒并进行DNA序列测定将实施例4和实施例5的融合蛋白质基因的DNA片段用SrfI和NotI限制酶处理，同时pET-34b质粒也用SrfI和NotI限制酶处理，再用DNA连接酶分别把这两个DNA片段连接到pET-34b质粒上，DNA连接酶的反应是16℃12小时。这样就得到了含有两种融合蛋白质基因的质粒。
用氯化钙制备成感受态大肠杆菌BL21，通过Heat shock方法把这两种质粒分别转入大肠杆菌BL21，在含有卡那霉素的LB培养基中过夜培养，卡那霉素的浓度为5mg/L。然后筛选有卡那霉素抗性的单菌落。用常规方法(T.Maniatis，et al，Molecular cloning，A laboratory manual，Second edition，Cold spring harborlaboratory，1989)制备和纯化质粒，并鉴定大肠杆菌中的质粒的限制酶图谱，以确定融合蛋白质基因转入大肠杆菌。
这样就分别得到了含有EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白质基因的两种大肠杆菌的菌株，菌株用含有15％甘油的培养基保存于-70℃。
最后将两种质粒中的EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白质基因的DNA序列进行测定。
序列表中的序列1是表皮生长因子(EGF)-Linker-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列从第1位氨基酸到第53位氨基酸的多肽是EGF，从第54位氨基酸到第68位氨基酸的多肽是Linker，从第69位氨基酸到第301位氨基酸的多肽是SEA。序列2是序列1的氨基酸序列。
序列表中的序列3是血管内皮细胞生长因子(VEGF)-Linker-超抗原-(SEA)融合蛋白质基因的序列从第1位氨基酸到第121位氨基酸的多肽是VEGF，从第122位氨基酸到第136位氨基酸的多肽是Linker，从第137位氨基酸到第369位氨基酸的多肽是SEA。序列4是序列3的氨基酸序列。
(B)融合蛋白质基因的表达在37℃下分别含有两种质粒的大肠杆菌在含有卡那霉素的培养基中培养，由于这两种融合蛋白质基因是在T7启动子的控制下，再在培养液中加入1mMIPTG，进行过夜培养，它们就可以大量表达。
附图1和附图2分别表示了构建和表达EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白质基因的实验过程。
实施例7、分离和纯化EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白质将实施例6中的两种大量表达EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白质的大肠杆菌培养液进行离心(5000rpm，30min)，收集菌体并用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤，然后用超声波方法破碎大肠杆菌。再进行离心(10000rpm，30min)，收集上清液，这样就得到了含有融合蛋白质的粗抽提液。
pET-34b质粒含有一个CBD序列片段，它可以作为分离纯化用的Tag，利用这个CBD的特性，可以使用纤维素树脂来直接分离纯化被表达的外源蛋白质，这个方法具有通用性，用于分离纯化的材料是CBIND ReadyRun Column(Novagen公司)。将粗抽提液上样于纤维素树脂的层析柱，当含有CBD的融合蛋白质被吸附到纤维素层析柱后，先用20mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗去杂蛋白质，然后用含有1％纤维二糖的磷酸缓冲液洗脱融合蛋白质，收集含有融合蛋白质的洗脱液。
在洗脱液里加入Enterokinase以切除CBD部分，然后进行透析，透析在4℃低温以及20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中进行，这样就去除了纤维二糖。将透析后的溶液再进行纤维素处理，游离的CBD部分被吸附到纤维素上，而不含CBD的融合蛋白质则不会被吸附，从而就得到了没有CBD部分的高纯度融合蛋白质。附图3和附图4是两种融合蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，附图3表示了精制后的EGF-SEA，而附图4则表示了精制后的VEGF-SEA。
测定了这两种蛋白质的N末端的氨基酸序列，它们分别与EGF和VEGF的N末端氨基酸相同。
核苷酸和/或氨基酸序列表<110>孙嘉琳<120>一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法<160>4<210>1<211>903<212>DNA<213>Human and Staphylococcus aureus<400>1aat tcc gat agc gag tgt cct ctg agt cac gat ggt tac tgt cta 45Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15cat gac ggc gtc tgt atg tat att gag gct cta gac aag tac gcg 90His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala20 25 30tgt aat tgc gtt gtt ggc tac atc ggt gag cgc tgt cag tat cga 135Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg35 40 45gat ctg aaa tgg tgg gaa ctt aga ggt gga ggc ggt tca ggc gga 180Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg agc gag aaa agc gaa gaa ata 225Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile65 70 75aat gaa aaa gat ttg cga aaa aag tct gaa ttg cag gga aca gct 270Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala80 85 90tta ggc aat ctt aaa caa atc tat tat tac aat gaa aaa gct aaa 315Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys95 100 105
act gaa aat aaa gag agt cac gat caa ttt tta cag cat act ata 360Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile110 115 120ttg ttt aaa ggc ttt ttt aca gat cat tcg tgg tat aac gat tta 405Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu125 130 135tta gta gat ttt gat tca aag gat att gtt gat aaa tat aaa ggg 450Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly140 145 150aaa aaa gta gac ttg tat ggt gct tat tat ggt tat caa tgt gcg 495Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala155 160 165ggt ggt aca cca aac aaa aca gct tgt atg tat ggt ggt gta acg 540Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr170 175 180tta cat gat aat aat cga ttg acc gaa gag aaa aaa gtg ccg atc 585Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile185 190 195aat tta tgg cta gac ggt aaa caa aat aca gta cct ttg gaa acg 630Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr200 205 210gtt aaa acg aat aag aaa aat gta act gtt cag gag ttg gat ctt 675Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu215 220 225caa gca aga cgt tat tta cag gaa aaa tat aat tta tat aac tct 720Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser230 235 240gat gtt ttt gat ggg aag gtt cag agg gga tta atc gtg ttt cat 765Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His245 250 255act tct aca gaa cct tcg gtt aat tac gat tta ttt ggt gct caa 810Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln260 265 270gga cag tat tca aat aca cta tta aga ata tat aga gat aat aaa 855Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys275 280 285acg att aac tct gaa aac atg cat att gat ata tat tta tat aca 900Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr290 295 300agtSer
<210>2<211>301<212>PRT<400>2Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala20 25 30Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg35 40 45Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile65 70 75Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala80 85 90Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys95 100 105Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile110 115 120Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu125 130 135Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly140 145 150Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala155 160 165Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr170 175 180Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile185 190 195Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr200 205 210Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu215 220 225Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser
230 235 240Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His245 250 255Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln260 265 270Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys275 280 285Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr290 295 300Ser<210>3<211>1107<212>DNA<213>Human and Staphylococcus aureus<400>3gca ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg 45Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val1 5 10 15aag ttc atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc cat cca atc gag 90Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu20 25 30acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac 135Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr35 40 45atc ttc aag cca tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc 180Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys50 55 60tgc aat gac gag ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac 225Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn65 70 75atc acc atg cag att atg cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac 270Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His80 85 90ata gga gag atg agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga 315
Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg95 100 105cca aag aaa gat aga gca aga caa gaa aaa tgt gac aag ccg agg 360Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg110 115 120cgg ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga 405Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly125 130 135tcg agc gag aaa agc gaa gaa ata aat gaa aaa gat ttg cga aaa 450Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys140 145 150aag tct gaa ttg cag gga aca gct tta ggc aat ctt aaa caa atc 495Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile155 160 165tat tat tac aat gaa aaa gct aaa act gaa aat aaa gag agt cac 540Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His170 175 180gat caa ttt tta cag cat act ata ttg ttt aaa ggc ttt ttt aca 585Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr185 190 195gat cat tcg tgg tat aac gat tta tta gta gat ttt gat tca aag 630Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys200 205 210gat att gtt gat aaa tat aaa ggg aaa aaa gta gac ttg tat ggt 675Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly215 220 225gct tat tat ggt tat caa tgt gcg ggt ggt aca cca aac aaa aca 720Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr230 235 240gct tgt atg tat ggt ggt gta acg tta cat gat aat aat cga ttg 765Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu245 250 255acc gaa gag aaa aaa gtg ccg atc aat tta tgg cta gac ggt aaa 810Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys260 265 270caa aat aca gta cct ttg gaa acg gtt aaa acg aat aag aaa aat 855Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn275 280 285gta act gtt cag gag ttg gat ctt caa gca aga cgt tat tta cag 900Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln290 295 300gaa aaa tat aat tta tat aac tct gat gtt ttt gat ggg aag gtt 945Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val305 310 315
cag agg gga tta atc gtg ttt cat act tct aca gaa cct tcg gtt 990Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val320 325 330aat tac gat tta ttt ggt gct caa gga cag tat tca aat aca cta 1035Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu335 340 345tta aga ata tat aga gat aat aaa acg att aac tct gaa aac atg 1080Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met350 355 360cat att gat ata tat tta tat aca agtHis Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser<210>4<211>369<212>PRT<400>4Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val1 5 10 15Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu20 25 30Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr35 40 45Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys50 55 60Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn65 70 75Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His80 85 90Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg95 100 105Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg110 115 120Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly125 130 135Ser Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys140 145 150
Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile155 160 165Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His170 175 180Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr185 190 195Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys200 205 210Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly215 220 225Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr230 235 240Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu245 250 255Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys260 265 270Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn275 280 285Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln290 295 300Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val305 310 315Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val320 325 330Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu335 340 345Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met350 355 360His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于同时含有促进癌细胞生长的细胞因子和能起抗癌的免疫反应的超抗原。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的促进癌细胞生长的细胞因子为下述物质之一细胞因子可以是表皮生长因子EGF、血管内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子TGF-α、白细胞介素-4和白细胞介素-2以及其它包括人和鼠等在内的各种物种来源的与癌或其它疾病有关联的细胞因子以及它们的自然变异体和人为的变异体，氨基酸序列有70％以上的相同性。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的能起抗癌的免疫反应的超抗原为下述物质之一金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEA、SEB、SEC、SED、SEE，链球菌毒素的SPE-A、SPE-B、SPE-C，以及其它包括病毒蛋白质在内的各种来源的超抗原以及它们的自然和人为的变异体，氨基酸序列有70％以上的相同性。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的促进癌细胞生长的细胞因子为表皮生长因子EGF和血管内皮细胞生长因子VEGF之一。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的能起抗癌的免疫反应的超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEA。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于由能起抗癌的免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素家族的SEA跟促进癌细胞生长的细胞因子表皮生长因子EGF和血管内皮细胞生长因子VEGF之一融合而成。
7.一种重组载体，其特征在于含有编码权利要求1、权利要求2、权利要求3、权利要求4、权利要求5或者权利要求6所述的融合蛋白的氨基酸序列。
8.一种转化体，其特征在于宿主细胞被权利要求7所述的重组载体转化。
9.一种生产融合蛋白的生产方法，其特征在于培养权利要求8所述的转化体，收集目标物质。
10.一种生产融合蛋白的纯化方法，其特征在于权利要求8所述的转化体经过培养后，利用Tag技术手段纯化融合蛋白。
11.融合蛋白在癌症以及免疫疾病等方面的治疗药物的应用。
全文摘要
一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法，本发明提出了一种构建细胞因子和超抗原的融合蛋白质的方法以及这种融合蛋白质在大肠杆菌中表达和纯化的方法。作为一种方法论，使用的材料是表皮生长因子EGF和血管内皮细胞生长因子VEGF以及金黄色葡萄球菌肠毒素SEA，所构建的是EGF－SEA和VEGF－SEA两种融合蛋白质形式。以上融合蛋白质可应用于癌症治疗，这个战略就是利用与癌细胞紧密关连的细胞因子将超抗原定位到癌细胞上，从而在癌细胞周围特异地激发抗癌的免疫反应。
文档编号C07K14/485GK1629194SQ200310109829
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月21日 优先权日2003年12月21日
发明者孙嘉琳 申请人:孙嘉琳