一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的 方法。
【背景技术】
[0002] 慢病毒（Lentiviral vector)是以人类免疫缺陷I型病毒（HIV-I)为基础发展起 来的基因治疗载体。慢病毒介导的转基因技术是当代基因治疗与转基因技术研究的热点。 慢病毒可利用其基因组两端具有自主整合功能的长末端重复序列（LTR)将携带的目的基 因稳定整合在宿主细胞染色体上，从而实现外源基因的持续转录或表达。慢病毒具有转染 细胞类型多、携带的外源性目的基因片段大（~l〇Kb)、免疫反应小等优点。并且慢病毒剔 除了毒力基因，且被拆分为三个或四个质粒系统，分别为转移质粒（Transfer plasmid)、包 装质粒（Packaging plasmid)与外膜蛋白质粒（Envelop plasmid)，极大地增强了病毒载体 的安全性。
[0003] 利用慢病毒进行哺乳动物细胞、禽类动物细胞的基因修饰已经得到较为深入的研 究。但迄今为止，慢病毒转染鱼类细胞系及两栖类动物细胞系的相关研究尚未见报道。
[0004] 因此，建立慢病毒转染鱼类和两栖类细胞系的方法具有重要的意义，为鱼类和两 栖类基因功能研究提供更有力的工具。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述不足，提供一种慢病毒转染鱼类细胞系或两栖类细胞系 的方法，方法简单，易行，转染效率高。
[0006] 本发明还有一个目的在于提供一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法在研 究鱼类或两栖类细胞基因功能中的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0008] -种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法，包括在慢病毒感染目的细胞中使 用Lipofectamine 2000 ;目的细胞系感染慢病毒后，培养温度呈梯度变化，具体为30~ 32°C 2h，26 ~28°C 2h，20 ~25°C 持续培养。
[0009] 以上所述方案中，优选的，所述的鱼类细胞系包括：匙吻舞鳍条细胞系、草鱼肾脏 细胞系，草鱼卵巢细胞系，鲤鱼上皮瘤细胞系、锦鲤鳍条细胞系、鲫鱼脑组织细胞系、虹鳟鱼 性腺细胞系、胖头鱲肌肉细胞系、大鳞大马哈鱼胚胎系等。
[0010] 所述的两栖类细胞系包括：大鲵肌肉细胞系等。
[0011] 以上所述方案，具体包括以下步骤：
[0012] 无血清基础培养基与Lipofectamine 2000按体积比25:1混合后静置5min，再加 入稀释好的慢病毒悬液共孵育IOmin后感染细胞，感染复数MOI = 100 ;放置30~32°C培 养箱中培养2h后，转至26~28°C培养箱中培养2h，再根据所培养细胞的最适生长温度转 至20~25°C培养箱中培养2h，吸弃培养基，加入新鲜的含有10%胎牛血清的基础培养基继 续培养。
[0013] 以上所述方案中，具体的，慢病毒滴度为IX 10sPFU/mL ;细胞浓度为：1 X IO5个/ 孔。
[0014] 所述的基础培养基因不同细胞而异，如常规的MEM，L-15, DMEM，M199等。
[0015] 用于感染的慢病毒可以携带有外源基因，例如通常作为载体的慢病毒带有标记基 因，如绿色荧光蛋白基因 GFP，在研究或应用中还进一步整合其他外源基因，从而通过转染 获得稳定地表达外源基因的鱼类细胞或两栖类细胞，为其他体外基因工程试验提供基础。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0017] 1.利用本发明的方法可以成功使慢病毒转染鱼类细胞或两栖类细胞细胞系；
[0018] 2.本发明可应用于利用慢病毒构建稳定表达外源基因的鱼类细胞或两栖类细胞 细胞系；
[0019] 3.本发明提供的方法操作简单、重复性强、效率高，转染72h后转染率达到85%以 上。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1中不同转染方法下的转染效率示意图。
[0021 ] 在转导后72h，荧光显微镜下观察到的带有绿色荧光蛋白的细胞，放大倍数为80 倍。
【具体实施方式】
[0022] 在以下实施例来进一步说明本
【发明内容】
，这些实施例仅是范例性的，并不对本发 明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均应涵盖在本发明的保护范围之内，本发明实 施例所用试剂，如未特别说明，均购自生化商店；所用实验技术，如未特别说明，均为常规技 术。
[0023] 实施例1 :
[0024] -种慢病毒转导鱼类细胞系的方法，包括以下步骤：
[0025] 本实施例通过慢病毒的包装、Lipofectamine 2000促进慢病毒感染草鱼肾脏细胞 系（CIK)，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP表达情况检测慢病毒的转导效率。
[0026] 1.慢病毒的包装及病毒悬液的制备
[0027] 采用三质粒系统制备慢病毒，包装质粒pCMV Δ R8. 2 Δ vpr，转移质粒DHIV-CTE 插入了绿色荧光蛋白（GFP)报告基因，外膜蛋白质粒pCMV-VSV-G，三质粒均由美国 夏威夷大学 Dr. Yuanan Lu 惠赠 （Zeng L, Planelles V，Sui Z，et al.HIV-1-based defective lentiviral vectors efficiently transduce human monocytes-derived macrophages and suppress replication of wild-type HIV-1. Journal of Gene Medicine, 2006, 8 (I) : 18 - 28.)。利用磷酸钙共沉淀的方法将三质粒共转染到293T包装细 胞中，进行慢病毒包装。分别在转染后的第2、3、4天收集细胞培养液，采用高速离心（4°C， 80, 000g，2. 5小时）进行病毒浓缩，用不含血清和抗生素的MEM培养基悬浮，获得滴度为 I X 10sPFU/mL的慢病毒悬液。
[0028] 2.慢病毒载体在草鱼肾脏细胞上的转染
[0029] 新鲜培养的草鱼肾脏细胞（培养温度25°C )在6孔板内培养18h后，细胞单层至 70%，细胞量为I X IO5个/孔，吸弃原培养液，用不含血清和抗生素的MEM培养基轻柔地洗 2遍，每孔加入不含血清和抗生素的MHM培养基lmL。
[0030] 采用三种不同的方法转染考察其转染效率，每组的感染复数（MOI)均为100。
[0031] 1)取无菌EP管加入250 μ L无血清MEM培养基，加入IOyL Lipofectamine 2000 静置5min，再加入稀释好的慢病毒悬液（Μ0Ι = 100)共孵育IOmin后加入细胞培养孔内，放 置30 °C培养箱中培养2h后，转至28 °C培养箱中培养2h，再转至25 °C培养箱中培养2h，吸弃 培养基，加入新鲜的含有10%胎牛血清的MEM培养基2mL继续培养；
[0032] 2)对照1 :采用传统的慢病毒转染哺乳动物细胞的方法，即每孔加入稀释好的慢 病毒悬液（Μ0Ι = 100)，同时加入终浓度为8 μ g/mL的Polybrene，放置25°C培养箱中培养 6h后，吸弃培养基，加入新鲜的含有10%胎牛血清的MEM培养基2mL继续培养；
[0033] 3)对照2 :取无菌EP管加入250 μ L无血清MEM培养基，加入10 μ L Lipofectamine 2000静置5min，再加入稀释好的慢病毒悬液（Μ0Ι = 100)共孵育IOmin后加入细胞培养孔 内，放置25°C培养箱中培养6h后，吸弃培养基，加入新鲜的含有10%胎牛血清的MEM培养 基2mL继续培养。
[0034] 以上三组分别于转染后24h、48h、72h、96h在倒置荧光显微镜下观察各组细胞慢 病毒转染效果，计数不同方法转染细胞表达绿色荧光蛋白的细胞百分率。
[0035] 3.结果
[0036] 本实施例我们比较了三种不同的慢病毒转染草鱼肾脏细胞的方法，分别于转染后 24h、48h、72h、96h在倒置荧光显微镜下观察各组细胞转染效果，差异显著（p < 0. 05)，如表 1及图1。
[0037] 表1不同方法慢病毒转染草鱼肾脏细胞的效率
[0038]
[0039] 利用本发明提供的方法，慢病毒转染效率最高，转染24h后即可观察到绿色荧光， 72h达到平台期，最高可达到86. 5%，且细胞状态良好，具体结果参见表1及图1 ;在对照1 中，慢病毒转染96h后仍未观察到绿色荧光；在对照2中，整个细胞培养温度均为25°C，病 毒转染效率低，最高只能达到22. 8%。
[0040] 由上述实验结果可以看出，通过本发明的方法可以高效地进行草鱼肾脏细胞的慢 病毒转染，以便于在硬骨鱼类细胞系中进行慢病毒介导的转基因研究。
[0041] 实施例2:
[0042] 慢病毒转染匙吻舞鳍条组织细胞系
[0043] 与实施例1相同
[0044] 表2不同方法慢病毒转染匙吻舞鳍条组织细胞的效率
[0045]
[0046] 实施例3 :
[0047] 慢病毒转染大鲵肌肉组织细胞系，其步骤包括：
[0048] 除了实施例1的步骤2,第1)步的步骤为：
[0049] 1)取无菌EP管加入250 μ L无血清M199培养基，加入10 μ L Lipofectamine 2000 静置5min，再加入稀释好的慢病毒悬液（Μ0Ι = 100)共孵育IOmin后加入细胞培养孔内，放 置30 °C培养箱中培养2h后，转至26 °C培养箱中培养2h，再转至20 °C培养箱中培养2h，吸弃 培养基，加入新鲜的含有10%胎牛血清的M199培养基2mL继续培养；
[0050] 其余步骤与实施例1相同。
[0051] 表3不同方法慢病毒转染大鲵肌肉组织细胞的效率
[0052]
【主权项】
1. 一种慢病毒转染鱼类细胞系或两栖类细胞系的方法，包括：在慢病毒感染目的细胞 中使用Lipofectamine 2000 ;目的细胞系感染后，培养温度呈梯度变化，具体为30~32°C 2h，26~28°C 2h，20~25°C持续培养。2. 根据权利要求1所述的方法，所述的鱼类细胞系为：匙吻舞鳍条细胞系、草鱼肾脏细 胞系，草鱼卵巢细胞系，鲤鱼上皮瘤细胞系、锦鲤鳍条细胞系、鲫鱼脑组织细胞系、虹鳟鱼性 腺细胞系、胖头鐵肌肉细胞系、大鱗大马哈鱼胚胎系。3. 根据权利要求1所述的方法，所述的两栖类细胞系为：大鲵肌肉细胞系。4. 根据权利要求1所述的方法，包括： 无血清基础培养基与Lipofectamine 2000按体积比25:1混合后静置5min，再加入稀 释好的慢病毒悬液共孵育IOmin后感染细胞，感染复数MOI=IOO ;放置30~32°C培养箱中培 养2h后，转至26~28°C培养箱中培养2h，再根据所培养细胞的最适生长温度转至20~25°C 培养箱中培养2h，吸弃培养基，加入新鲜的含有10%胎牛血清的基础培养基继续培养； 以上所述方案中，慢病毒滴度为I X 10sPFU/mL;细胞浓度为：I X IO5个/孔。5. 权利要求1所述的方法在研究鱼类细胞系基因功能中的应用。6. 权利要求1所述的方法在研究两栖类细胞系基因功能中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法，通过在慢病毒感染目的细胞中使用Lipofectamine？2000；目的细胞系被感染后，培养温度呈梯度变化，具体为30~32℃？2h，26~28℃？2h，？20~25℃持续培养的方法，表明该方法可使慢病毒成功转染鱼类或两栖类细胞，72h后的转染效率在85%以上。本发明方法重复性强、效率高、成本低，适合在实验研究以及鱼类细胞或两栖类细胞基因工程中广泛推广使用。
【IPC分类】C12N15/867, C12N5/10
【公开号】CN105018527
【申请号】CN201510459345
【发明人】马杰, 曾令兵, 范玉顶, 周勇
【申请人】中国水产科学研究院长江水产研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月30日