热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启 动子控制的多基因表达和沉默系统。
【背景技术】
[0002] 在研究一些特定基因如与细胞生长、发生、发展密切相关的基因时，由于不能精细 调控目的基因的表达程度可能同时会影响正常细胞的生长、增殖，因此可调控，可诱导系 统被认为是未来基因治疗的重要发展方向。诱导型表达载体可以通过诱导型启动子来调 苄基因表达，进而实现目的基因的定时定量诱导表达。目前应用的诱导体系有cre21 〇XP 系统，四环素诱导体系，蜕皮素诱导体系，热休克诱导体系和乳糖诱导体系。其中，四环 素调控表达系统（tetracycline expression system)包括 Tet-οη 和 Tet-off 系统。 Tet-off基因表达系统包含有2个调控元件：TRE启动子包含有四环素操纵基因 Tet0(tet operator，TetO)的42个碱基的7次正向重复序列；杂合的四环素调控的转录活化因子 (tetracycline-controlled transcriptional activator，tTA)，称四环素调节车专录因子 (tTA)，该因子可与反应转录的四环素反应元件（Tet-responsive element，TRE)结合，在没 有四环素（tetracycline)或其衍生物强力霉素（Doxycycline)存在的情况下，引起插入启 动子下游的目的基因或shRNA的高效表达。TRE启动子包含人巨细胞病毒的最低限度启动 子（minimal CMV promoter，PminCMV)，其特点是启动子缺少增强子，不能单独启动外源基 因表达，由于增强子的缺失，在无转录调控部分与它结合时，因而不会有外源基因的表达。 通过改变tTA的氨基酸顺序构建了受四环素正调节的基因表达系统，称为Tet-on基因表达 系统。该系统在没有四环素及其衍生物强力霉素（Doxycycline，Dox)的情况下目的基因 表达水平为零或者很低，而在加入四环素衍生物强力霉素（Doxycycline，Dox)后目的基因 高效表达。在该系统中，通过突变氨基酸残基就得到了四环素调控的反式激活子（reverse tet-controlled transactivator，rtTA)，当无 Dox存在时，它不能识别其特异的DNA革巴序 列（TetO)，故不能进行转录；当有Dox存在时，rtTA构象发生改变，接着与TetO反应元件结 合启动转录，由于加入四环素促进基因的表达，因此称之为"Tet-on" ；
[0003] 而热休克蛋白HSP70是热休克蛋白家族中的一员，是从细菌到哺乳动物广泛存在 的一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有 机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达， 显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。当将生物的 整体、组织、细胞等从其生活的温度范围内急剧地从低温移向高温时，可显著地降低一些蛋 白质的合成；与此相反，休克蛋白的合成却反而被促进。经研究发现，热休克蛋白启动子中 存在有一种热休克元件（HSE)，能够感受温度范围的变化，在高温环境下，HSE元件被激活， 进而激活热休克蛋白启动子，热休克蛋白得以表达。因此含有热休克元件（HSE)的Hsp70 启动子，可以实现温度诱导的基因表达。另外，过高热是通过微波无线电频率杀死肿瘤细胞 的有效方法，同时，过高热具有准确的定位和无副作用的优点。因此热休克系统可运用到肿 瘤的临床治疗中。
[0004] 目前诱导型表达载体已应用到肿瘤基因治疗相关研究中，如结肠癌、胃癌、乳腺 癌、前列腺癌等癌症的细胞体外研究和实验动物的体内研究已经卓有成效，为肿瘤的基 因治疗提供了新的思路。但是当前可调控系统存在以下主要缺陷：（1)漏表达（leaky expression)，即在调控抑制状态下存在不同程度目的基因的表达，形成背景噪音，由于哺 乳动物的基因系统是复杂的多级、多途径环路，基础表达不可避免；（2)在肿瘤治疗的基因 中，往往单个治疗起不到很好的治疗效果，而多靶点的基因治疗能获得更好的疗效，传统的 控制系统都是单个诱导控制系统，无法实现多基因靶点的可调控控制，传统多基因的表达 往往采用质粒共转染的方法，而共转染导致基因表达效率低，无法很好的满足实验要求； (3)传统的单个诱导控制系统在遇到两个基因都需要同时协调控制的情况时，无法满足实 验的需要。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动 子控制的多基因表达和沉默系统，在同一个质粒系统中热休克蛋白基因启动子与四环素基 因启动子之间既可以互不干扰，独立工作，也可以实现基因共表达。
[0006] 本发明采取的技术方案如下：
[0007] 1、一种基因表达系统，所述系统包括热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动 子，以及它们各自控制的下游基因或ShRNA。
[0008] 优选的，所述系统为慢病毒基因表达系统，经过转染包装后所述慢病毒基因表达 系统含有热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子，以及它们各自控制的下游基因或 shRNA的慢病毒颗粒。
[0009] 优选的，所述热休克蛋白基因启动子为HSP70基因启动子。
[0010] 2、一种重组载体，所述载体包括HSP70基因启动子、四环素基因启动子、由HSP70 基因启动子启动表达的绿色荧光蛋白基因和由四环素基因启动子启动表达的Turbo RFP基 因。
[0011] 优选的，所述重组载体为pTripZ重组质粒。
[0012] 5、重组载体的制备方法，包括如下步骤：用ClaI和XhoI酶37°C水浴酶切SEQ ID NO. 3所示HSP70基因启动子序列和PtripZ载体各5min，回收酶切后的HSP70基因启动子 片段以及载体骨架片段，并将回收后的HSP70基因启动子片段连接至酶切后的PTirpZ质粒 骨架片段，16°C连接lh，4°C孵育12h后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP +抗性平 板涂板，倒置培养14h，菌落PCR鉴定，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩 大培养14h，进行质粒提取，经测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P载体；
[0013] 用XhoI和MluI37°C水浴酶切SEQ ID NO. 6所示绿色荧光蛋白（EGFP)基因序列和 PTRIPZ-HSP70P载体各lOmin，回收酶切后的EGFP片段以及载体骨架片段，将回收后的EGFP 基因片段连接至酶切后的PTRIPZ-HSP70P质粒骨架片段，16°C连接lh，4°C孵育12h，然后将 连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP +抗性平板涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落 PCR鉴定，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培14h，提取质粒，经测 序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P-EGFP载体。
[0014] 6、基因表达系统或重组载体在调控下游基因或shRNA表达中的应用。
[0015] 本发明中，同一质粒系统中热休克基因启动子HSPP与四环素基因启动子TETp互 不影响，各自独立控制其下游的目的基因，如图1所示。因此，该质粒系统为特异性多基因 控制系统，具有多基因的开关机制。既可实现人为定时、选择性地控制单个基因或shRNA的 表达情况，也可人为控制两个基因或两个shRNA的共表达，以此来提高基因共表达的效率。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明通过热休克启动子和四环素 Turn-on系统分别控 制一种基因或shRNA的表达，在37°C条件下，热休克蛋白启动子控制的基因或shRNA处于静 默状态，在温度升高的条件下，热休克启动子下游基因或shRNA处于高表达状态；在没有四 环素类药物De 〇XyCyCline(D0X)的存在下，四环素启动子控制的基因或shRNA处于静默状 态，添加适量浓度的DOX后，四环素启动子下游基因或shRNA处于高表达状态；四种衍生模 型如图3所示。采取本发明所述的技术方案，既可以人为选择性严谨控制基因或shRNA的 表达，又能够在同一个质粒中高效率实现基因或shRNA的共表达，解决目前采用多质粒共 转染的方法来实现基因共表达带来的表达效率低的问题，另外，采取慢病毒搭载系统，可以 实现在难转染的细胞中选择性进行基因或shRNA的高效表达，以满足各种实验的需要，同 时提供多基因靶点控制平台，为基因治疗提供更多的可能性。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1携带EGFP基因的热诱导表达框和携带有Turbo RFP基因的四环素系统表达 框；
[0019] 图2四环素基因启动子作用元件rtTA3的表达框；
[0020] 图3本发明衍生的四种模型表达框图；
[0021] 图 4 pTripZ-HSP70P