将 PTRIPZ-HSP70P-EGFP 质粒（1 μ g)用转染试剂（QIANGEN)转染至 293T 细胞，转 染4h后更换DMEM完全培养基（DMEM+10 % FBS)，转染16h后开始热诱导和DOX诱导，热诱 导方法为：将相应实验组放置于43°C、5% 0)2条件下热激时间70min，热激结束后，将实验 组放回37°C、5% 0)2条件下恢复生长4h，重复三次热激过程；DOX诱导方法为：在相应的实 验组中添加终浓度为10 μ g/ml的DOX进行诱导，诱导时间与37°C Control培养时间相同。
[0056] 诱导过程结束后，荧光显微镜下观察对照组和3个实验组的细胞状态以及报告基 因表达情况，如图5所示。由图5可知，在37°C、5% 0)2条件下，HSP70启动子的启动能力 很低，EGFP表达量很低，在43°C、5% 0)2条件下诱导导致EGFP大量表达，说明HSP70启动 子在热诱导状态下具有极高的启动效率。另外，在无 DOX诱导的情况下四环素启动子不具 有启动能力，Turbo RFP不表达，而在加入适量浓度DOX诱导情况下，四环素启动子效率极 高，Turbo RFP大量表达。
[0057] 2、Western blot检测报告基因蛋白水平表达情况
[0058] 以上3组实验组和阴性对照组细胞，经相应的热激处理和DOX诱导后，用质量分数 0. 25%的胰酶消化后，在转速为3500rpm条件下离心3min，收集细胞。将收集的细胞用哺 乳动物蛋白抽提试剂盒（康为世纪）抽提全蛋白，根据BCA的结果，选择70 μ g的蛋白上样 量，然后用10 % SDS-PAGE胶电泳分离，然后转移到0. 45 μ m PVDF (Magna)膜上，以GAPDH作 为对照。EGFP和Turbo RFP转膜时间为45min，GAPDH转膜时间为60min，膜在室温下蛋白 封闭lh，一抗4°C孵育过夜，EGFP -抗为鼠源单克隆抗体（稀释比例1 :2000, Proteintech 公司），GAPDH -抗为兔源多克隆抗体（稀释比例为I :5000Proteintech公司），Turbo RFP 一抗为鼠源单克隆抗体（稀释比例I :2000 Wrigene公司），辣根根过氧化物酶标记的羊抗 兔IgG和羊抗鼠 IgG (Proteintech公司）作为二抗（稀释比例1:5000)，二抗室温孵育lh。 弃去二抗后，用I X TBST清洗PVDF膜3次，每次lOmin，然后进行ECL显影，结果如图6中a 图所示。western blot结果进行灰度值计算（Quantity One、ImageJ软件）后对结果进行 统计分析（GraphPad Prim5软件），统计结果如图6中b图所示。
[0059] 由图6可知，与图5结果一致，在37°C下，EGFP表达量很低，在43°C下EGFP大量 表达，说明HSP70启动子在热诱导状态下具有极高的启动效率。另外，在无 DOX诱导的情况 下Turbo RFP不表达，而在加入适量浓度DOX诱导情况下，Turbo RFP大量表达。此外，由 图6中b图可知，实验温度变化对四环素启动子没有造成影响，并且在有无 DOX药物诱导的 情况下，同一温度下的HSP70启动子的表达效率无变化，故DOX的加入也没有对HSP70启动 子的启动效率造成影响，即HSP70启动子不受DOX影响，四环素启动子也不受温度影响。综 上，TRE启动子和HSP70启动子能互不影响工作，并能分别可控、高效的启动基因的表达。
[0060] 五、载体模型衍生
[0061] 本发明的目的在于同一个质粒系统中提供一种可调控启动子控制的多基因表达 和沉默系统，实验过程中证明了同一质粒系统中热休克基因启动子HSPp与四环素基因启 动子TETp互不影响，各自独立控制其下游的目的基因，表达框如图1所示，因此图3中所示 的第三种模型得到证实。
[0062] 在载体中进行shRNA的表达，大量文献表明，HSP70启动子和四环素启动子在单 独情况下都可启动下游shRNA的表达，因此，在该系统中两种polll型启动子启动shRNA 表达的能力与启动报告基因一样。即图3所示的其他几种模型都可以像图中第三种模型 一样正常工作。在37°C条件下，热休克蛋白启动子控制的基因或shRNA处于静默状态， 在热诱导条件下，热休克启动子下游基因或shRNA处于高表达状态；在没有四环素类药物 Deoxycycline(DOX)的存在下，四环素启动子控制的基因或shRNA处于静默状态，添加适 量浓度的DOX后，四环素启动子下游基因或shRNA处于高表达状态，二者之间互不影响、互 不干扰。所以，该质粒系统为特异性多基因或shRNA控制系统，具有良好的多开关机制，既 可实现定时、选择性地控制单个基因或shRNA的表达情况，也可人为控制两个基因或两个 shRNA的共表达，以此来提高基因共表达的效率。
[0063] 本发明中热休克蛋白基因 HSP70启动子可以用其他的热休克蛋白基因启动子替 换，例如：HSP70家族中的HSPA2、HSPA1L、HSPA8基因启动子，HSP72基因启动子，HSP90家 族中的HSP90a、HSP90i3基因启动子等，由于此类启动子同样受温度调控，因此能够同样实 现发明目的。同理，本发明中采用的四环素启动子也可以由其他可调控启动子替换能够同 样实现本发明的目的。
[0064] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种基因表达系统，其特征在于，所述系统包括热休克蛋白基因启动子和四环素基 因启动子，以及它们各自控制的下游基因或shRNA。2. 根据权利要求1所述的基因表达系统，其特征在于，所述系统为慢病毒基因表达系 统，经过转染包装后所述慢病毒基因表达系统含有热休克蛋白基因启动子和四环素基因启 动子，以及它们各自控制的下游基因或shRNA的慢病毒颗粒。3. 如权利要求1或2所述的基因表达系统，其特征在于，所述热休克蛋白基因启动子为 HSP70基因启动子。4. 一种重组载体，其特征在于，所述载体包括HSP70基因启动子、四环素基因启动子、 由HSP70基因启动子启动表达的绿色荧光蛋白基因和由四环素基因启动子启动表达的 Turbo RFP 基因。5. 如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pTripZ重组质粒。6. 权利要求4或5所述重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：用ClaI和 XhoI酶37°C水浴酶切SEQ ID NO. 3所示HSP70基因启动子序列和PtripZ载体各5min，回 收酶切后的HSP70基因启动子片段以及载体骨架片段，并将回收后的HSP70基因启动子片 段连接至酶切后的PTirpZ质粒骨架片段，16°C连接lh，4°C孵育12h后将连接产物转化至 Stbl3感受态细胞，AMP +抗性平板涂板，倒置培养14h，菌落PCR鉴定，将PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培养14h，进行质粒提取，经测序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P 载体； 用XhoI和MluI37°C水浴酶切SEQ ID NO. 6所示绿色荧光蛋白（EGFP)基因序列和 PTRIPZ-HSP70P载体各lOmin，回收酶切后的EGFP片段以及载体骨架片段，将回收后的EGFP 基因片段连接至酶切后的PTRIPZ-HSP70P质粒骨架片段，16°C连接lh，4°C孵育12h，然后将 连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP +抗性平板涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落 PCR鉴定，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培14h，提取质粒，经测 序鉴定得到PTRIPZ-HSP70P-EGFP载体。7. 权利要求1~3任一项所述的基因表达系统，或权利要求4或5所述的重组载体在 调控下游基因或shRNA表达中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统，同一质粒系统中热休克基因启动子HSPP与四环素基因启动子TETp互不影响，各自独立控制其下游的目的基因或shRNA的表达，既可人为控制单独一个基因或shRNA的表达，也可人为控制两个基因或shRNA共同表达。本发明为多基因特异性协调控制提供了条件，解决了目前采用多质粒共转染方法实现基因共表达所带来的表达效率低的问题，并且采取慢病毒搭载系统可以在难转染的细胞中实现选择性基因或shRNA的高效表达，满足了各种实验的需要，同时提供多基因靶点控制平台，为基因治疗提供更多的可能性。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/867, C12N15/66
【公开号】CN105018528
【申请号】CN201510514331
【发明人】唐丽灵, 李顺, 廖意, 徐晓莉, 陈影, 徐锡超
【申请人】重庆大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月20日