一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种达氏鋳脾脏组织细胞系的构建方法，属于细胞培养技术领域。
【背景技术】
[0002]达氏鋳(Acipenser dabryanus)又名长江鋳，主要分布在长江中上游干流及金沙江下游，为我国特有鱼类，具有重要的物种价值，被列为国家I级保护的水生野生动物。由于过度捕捞、水体污染、水利工程兴建等原因，长江流域中达氏鋳的资源已极为稀少，随着长江上游及金沙江水电工程的建设，其天然资源将受到更加严峻的威胁，如能冷冻保存其卵子或者胚胎，无疑对保护濒危达氏鋳物种是很有意义的。但通常由于野生达氏鋳很难获得成对的成熟亲本，甚至很难得到存活的个体，且卵子或者胚胎的冷冻保存技术难以攻克，迫切需要其它技术来弥补现有技术的不足。对于鱼类来说，保存的细胞既可以长期传代，又可以通过冻存来减少保藏带来的物资消耗。在细胞水平保存物种为未来濒危物种的复活提供了可能。因此，构建濒危鱼类细胞系显得十分必要，既是解决鱼类种质资源保存、可持续繁衍和挽救濒危物种的有效途径之一，也对探索珍稀濒危水生物种种质资源保存具有重要的指导意义，目前，有关脾脏细胞系的构建仅在花鲈、石斑鱼、高首鋳等少数鱼类中有过相关报道，而本发明针对像达氏鋳这种濒危鋳鱼类物种，以达氏鋳脾脏组织为材料，提供了一种适用于达氏鋳脾脏组织细胞系的构建方法，此法也可供中华鋳、白鋳等鋳鱼类细胞培养提供参照。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是利用达氏鋳脾脏组织，提供一种达氏鋳脾脏细胞系的构建方法，以满足对达氏鋳及其它濒危鱼类物种保护研宄的需要。
[0004]本发明的构建方法，包括以下步骤:制备专用培养液，细胞的原代培养，细胞的传代培养以及细胞的冷冻保存和复苏，
[0005](I)专用培养液制备的具体步骤为:选取健康的达氏鋳，尾静脉取血，分离出的血清过滤除菌后将该达氏鋳鱼血清、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子添加到Minimum Essential Medium的基础培养液中，制备成达氏鋳脾脏细胞完全培养液，置于4°C保存备用；所述的达氏鋳鱼血清的体积浓度为0.5%，胎牛血清的体积浓度为30%、青霉素的浓度为200IU/ml、链霉素的浓度为200IU/ml、两性霉素B浓度为0.5 μ g/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml。步骤I)中，所述的达氏鋳鱼血清的体积浓度为0.5%，胎牛血清的体积浓度为30%、青霉素的浓度为200IU/ml、链霉素的浓度为200IU/ml、两性霉素B浓度为0.5 μ g/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml ο
[0006]按体积分数计体积浓度为0.5%的达氏鋳鱼血清200-300 μ 1、体积浓度为30%的胎牛血清 10-18ml、10000IU/ml 的青霉素 0.6-1.4ml、10000IU/ml 的链霉素 0.6-1.4ml、12.5 μ g/ml 的两性霉素 B 0.6-1.4ml、10 μ g/ml 的人表皮生长因子 80-120 μ 1、10 μ g/ml 人喊性成纤维样细胞生长因子80-120 μ KMinimum Essential Medium基础培养液30_33ml。进一步优选为:体积浓度为0.5%的达氏鋳鱼血清250 μ 1、体积浓度为30%的胎牛血清15ml、10000IU/ml 的青霉素 lml、10000IU/ml 的链霉素 lml、12.5 μ g/ml 的两性霉素 B 1ml、10 μ g/ml的人表皮生长因子100yl、10yg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子100 μ 1、Minimum Essential Medium 基石出培养液 31.55ml。
[0007](2)细胞原代培养的具体步骤为:选取健康的达氏鋳，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70%乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用过量的的青霉素和链霉素，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏组织剪成Imm3的小块，在25°C下，采用胰蛋白酶和胶原酶的混合物对脾脏组织消化5_8分钟，再将脾脏组织置于步骤(I)的专用培养液中进行悬浮，收集脾脏组织块均匀接种于培养瓶中，25°C下倒置干贴6小时后加步骤(I)制备的专用培养液启动脾脏组织原代培养，培养2-3d后，显微镜镜下可见大量细胞从组织块中迀移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样(图1-A)，及得到原代培养的脾脏组织细胞。
[0008]该步骤中，所述的青霉素和链霉素的浓度均为500IU/m，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸的浓度为1.25 μ g/ml O所述的胰蛋白酶和胶原酶的混合物为质量浓度为0.0625% -0.25%胰蛋白酶与质量浓度为0.08% -0.1 %胶原酶II按体积为1:1的混合物。
[0009](3)细胞传代培养的具体步骤为:待脾脏组织细胞从组织块周围迀出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70%以上时，开始第I次传代，先吸出所有组织块和培养液，用无菌磷酸缓冲液洗涤两次，再加入质量浓度0.25%胰酶溶液，25°C培箱中消化1-3分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，加入步骤(I)中的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1200r/min离心3-6分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25°C培养箱中进行传代培养，培养3-4d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样，为长条形或梭形(图1-B)。之后，每隔3-4d，重复一次按照(3)中传代培养的步骤，得到传代培养的细胞。
[0010](4)细胞的冷冻保存和复苏具体步骤为:在MEM基础培养液中二甲基亚砜，胎牛血清，I青霉素、链霉素、两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取传代培养的细胞，加入胰酶溶液消化2分钟后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞沉淀，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，再转入冻存管中，将冻存管放入冻存盒中先在40C冰箱中平衡10分钟，然后在-80°C超低温冰箱中置4小时以上，再将冻存管放入液氮面平衡5分钟，最后将冻存管转入液氮中，长期保存。细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，直接投入37°C水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，将该细胞沉淀转移至培养瓶中，加入步骤
(I)中的专用培养液，且每12-24小时后更换新鲜达氏鋳脾脏细胞专用培养液，直到得到达氏鋳脾脏组织细胞，即可完成达氏鋳脾脏组织细胞系的构建。
[0011]该步骤中，所述的二甲基亚砜的体积浓度为10%，胎牛血清的体积浓度为30%，青霉素的浓度为200IU/ml，链霉素的浓度为200IU/ml，两性霉素B的浓度为0.5yg/ml，胰酶的质量浓度为0.25%，所述的二甲基亚砜的体积浓度为10%，胎牛血清的体积浓度为30%，青霉素的浓度为200IU/ml，链霉素的浓度为200IU/ml，两性霉素B的浓度为0.5 μ g/ml，胰酶的质量浓度为0.25%。
[0012]按体积比计，体积浓度为10%的二甲基亚砜80-120 yl、10000IU/ml的青霉素15-23yl、10000IU/ml 的链霉素 15-25 μ 1、12.5 μ g/ml 的两性霉素 B 15-23 μ 1、质量浓度为0.25%胰酶1.8-2.5ml。进一步优选为体积浓度为10%的二甲基亚砜100 μ 1U0000IU/ml的青霉素20yl、10000IU/ml的链霉素20 μ 1、12.5 μ g/ml的两性霉素B 20 μ 1、质量浓度为0.25%胰酶2ml。
[0013]技术原理:该培养方法是指从达氏鋳体内组织取出细胞，模拟体内出现的环境，在无菌，适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。不同物种，即便同一种物种不同组织的细胞及原代细胞和传代细胞之间在培养基及培养的环境条件都有所差异。
[0014]本发明与已有技术对比，其优点在于:
[0015](I)目前除本发明外，国内外尚无达氏鋳脾脏细胞培养的报道，本发明建立的达氏鋳脾脏细胞培养方法也适用于中华鋳、白鋳等其它鋳鱼。
[0016](2)本发明方法，其所述的制备的培养液中添加了 20ng/ml人表皮生长因子和20ng/ml人碱性成纤维样细胞生长因子以及5%的达氏鋳鱼血清。
[0017](3)本发明构建的方法，其所述的原代培养步骤中需对组织块用浓度为0.0625% -0.25%的胰蛋白酶和0.08% -0.1 %胶原酶II联合消化5-8分钟。
[0018](4)本发明构建的达氏鋳脾脏细胞系增殖速度快，可以连续传代，并可超低温冻存和复苏，既可为鋳鱼类种质资源保存的相关研宄奠定技术基础，又可作为鋳鱼病毒病体外研宄的理想材料。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1脾脏组织细胞，其中，图1-A为达氏鋳脾脏组织细胞原代培养的细胞形态；
[0020]图1-B为第I次传代后脾脏细胞的形态。
[0021]图2为实施例1达氏鋳脾脏组织细胞密度。
[0022]图3为