实施例1达氏鋳脾脏组织细胞直径。
【具体实施方式】
[0023]本发明的技术方案具体实施例如下。
[0024]对于像达氏鋳这种濒危物种通常是很难获得成对的成熟野生亲本，甚至很难得到存活的个体。为了尽力挽救这些濒危物种资源，该专利通过构建达氏鋳脾脏细胞系，在细胞水平上更加完整的保持生物体的遗传信息，为未来濒危物种的复活提供了可能，为更好的保护达氏鋳种质资源提供技术支撑。从长远来讲，这对达氏鋳资源的恢复和保护具有十分重要的意义。
[0025]实施例1
[0026]实施对象:
[0027]I龄人工养殖达氏鋳幼鱼脾脏组织，实验鱼全长48cm，体长37.5cm，体重0.4kg。
[0028]达氏鋳脾脏细胞专用培养液的制备:
[0029]选取健康的达氏鋳，尾静脉取血2ml，将分离出的血清用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌备用，取Minimum Essential Medium(MEM)基础培养液31.55ml，向其中添加经过滤除菌的达氏鋳鱼血清250 μ 1、胎牛血清15ml、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子，使达氏鋳鱼血清体积浓度占专用培养液体积的5%，胎牛血清体积浓度占专用培养液体积的30 %，青霉素和链霉素的质量浓度均为200IU/ml、两性霉素B质量浓度为0.5 μ g/ml、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子质量浓度均为20ng/ml，制备成达氏鋳脾脏细胞专用培养液，置于4°C保存备用；
[0030]细胞原代培养:
[0031]选取健康的达氏鋳，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70%乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用含浓度均为500IU/ml的青霉素和链霉素，浓度为1.25 μ g/ml的两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏组织剪成Imm3的小块，将浓度为0.125%的胰蛋白酶和0.1%胶原酶II按体积为1:1配比混合后，25°C对脾脏组织消化6分钟，用步骤(I)制备的专用培养液充分悬浮，收集组织块均匀接种于多个25cm2培养瓶中，25°C下倒置干贴6小时后加5ml步骤(I)制备的专用培养液启动原代培养，培养2d后，显微镜下可见大量细胞从组织块中迀移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样(图1-A)。
[0032]细胞传代培养:
[0033]待细胞从组织块周围迀出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70%以上时，开始第I次传代。先吸出所有组织块和培养液，用3ml的无菌磷酸缓冲液洗涤两次，加入质量浓度0.25%胰酶溶液2ml，25°C培箱中消化2分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，迅速加入3ml的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1200r/min离心4分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25°C培养箱中进行传代培养。培养4d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样，为长条形或梭形(图1-B)。之后，按照(3)中传代培养的步骤，每隔4d传代一次。
[0034]细胞的冷冻保存和复苏:
[0035]在MEM基础培养液中添加体积浓度为10% 二甲基亚砜，体积浓度为30%胎牛血清，200IU/ml青霉素和链霉素、0.5 μ g/ml两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取对数期生长的细胞，加入质量浓度0.25%胰酶溶液消化2分钟，之后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞悬液，取少许的细胞悬液，用scepter 2.0细胞计数器测定得到细胞的密度和直径(图2)，然后调节细胞密度约为5X106/ml，离心去上清，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，转入2ml冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，先在4°C冰箱中平衡10分钟，之后在-80°C超低温冰箱中置6小时，再将冻存管放入液氮面平衡5分钟，最后将冻存管转入液氮中，长期保存。细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，迅速投入37°C水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，转移至培养瓶中培养观察，为了去除DMSO对细胞的毒害，在25°C培养箱培养20小时后，更换新鲜脾脏细胞专用培养液，得到复苏后贴壁快速，形态均一的达氏鋳脾脏组织细胞。
[0036]实施例2
[0037]实施对象:
[0038]I龄人工养殖达氏鋳幼鱼脾脏组织，实验鱼全长43.5cm，体长34.5cm，体重0.4kg。
[0039]达氏鋳脾脏细胞专用培养液的制备:
[0040]选取健康的达氏鋳，抽取尾静脉血1.5ml，将分离出的血清过滤除菌备用，取Minimum Essential Medium(MEM)基础培养液31.4ml，向其中添加经过滤除菌的达氏鋳鱼血清500 μ 1、胎牛血清15ml、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子，使达氏鋳鱼血清体积浓度占专用培养液体积的10%，胎牛血清体积浓度占专用培养液体积的30%，青霉素和链霉素的质量浓度均为200IU/ml、两性霉素B质量浓度为0.5 μ g/ml、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子质量浓度均为10ng/ml，制备成达氏鋳脾脏细胞专用培养液，置于4°C保存备用；
[0041]细胞原代培养:
[0042]选取健康的达氏鋳，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴20分钟，再用75%乙醇擦拭鱼体表面I分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用含浓度均为500IU/ml的青霉素和链霉素，浓度为1.25 μ g/ml的两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将浓度为0.0625%的胰蛋白酶和0.08%胶原酶II按体积为1:1配比混合后，22°C对脾脏组织消化10分钟，用步骤(I)制备的专用培养液中和过量的胰蛋白酶消化液和胶原酶II的混合消化液，后将脾脏组织剪成Imm3的小块，收集组织块均匀接种于多个25cm 2培养瓶中，22°C下倒置干贴4小时后加5ml步骤(I)制备的专用培养液启动原代培养，培养2d后，显微镜下可见部分细胞从组织块中迀移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样。
[0043]细胞传代培养:
[0044]待细胞从组织块周围迀出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70%以上时，开始第I次传代。先吸出所有组织块和培养液，用3ml的无菌磷酸缓冲液洗涤两次，加入质量浓度0.25%胰酶溶液2ml，22°C培箱中消化I分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，迅速加入3ml的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1000r/min离心5分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，22°C培养箱中进行传代培养。培养3d后，可见脾脏组织细胞的形态多呈成纤维样，为长条形或梭形之后，按照
(3)中传代培养的步骤，每隔5d传代一次。
[0045]细胞的冷冻保存和复苏:
[0046]在MEM基础培养液中添加体积浓度为10% 二甲基亚砜，体积浓度为20%胎牛血清，200IU/ml青霉素和链霉素、0.5 μ g/ml两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取对数期生长的细胞，加入质量浓度0.25%胰酶溶液消化I分钟，之后按照(3)中传代培养的步骤操作得到细胞悬液，取少许的细胞悬液，测定细胞的密度和直径，调节细胞密度至5X 106/ml，离心去上清，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，转入2ml冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，先在4°C冰箱中平衡30分钟，然后在_80°C超低温冰箱中置4小时，最后将冻存管转入液氮中，长期保存，细胞在液氮中保存一个月后，将细胞冻存管从液氮中取出，迅速投入37°C水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，转移至培养瓶中培养观察，24小时后更换新鲜达氏鋳脾脏细胞专用培养液，直到得到达氏鋳脾脏组织细胞，即可完成达氏鋳脾脏组织细胞系的构建。
[0047]实施例3
[0048]实施对象:
[0049]I龄人工养殖达氏鋳幼鱼脾脏组织，实验鱼全长40cm，体长31.5cm，体重0.36kg。
[0050]达氏鋳脾脏细胞专用培养液的制备:
[0051]选取健康的达氏鋳，尾静脉取血2.5ml，将分离出的血清过滤除菌备用，取MinimumEssential Medium(MEM)基础培养液31.45ml，向其中添加经过滤除菌的达氏鋳鱼血清400 μ 1、胎牛血清15ml、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子，使达氏鋳鱼血清体积浓度占专用培养液体积的8%，胎牛血清体积浓度占专用培养液体积的30%，青霉素和链霉素的质量浓度均为200IU/ml、两性霉素B质量浓度为0.5 μ g/ml、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子质量浓度均为15ng/ml，制备成达氏鋳脾脏细胞专用培养液，置于4°C保存备用；
[0052]细胞原代培养:
[0053]选取健康的达氏鋳，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用75%乙醇擦拭鱼体表面I分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用含浓度均为500IU/ml的青霉素和链霉素，浓度为1.25 μ g/ml的两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏组织剪成Imm3的小