一种牙鲆精巢细胞系的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆精巢细胞系的构建方法。
【背景技术】
[0002]构建与培养动物细胞系早已成为研宄内分泌学、毒理学、遗传学、病毒学、免疫学、肿瘤治疗的有力工具。截至目前已有近280余株不同的鱼类细胞系相继建立起来，而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系仅有约100株，远远不能满足其在生理学、病毒学、毒理学、肿瘤及基因工程等多个领域的应用需求。
[0003]牙鲜(Paralichthys olivaceus)，属硬骨鱼纲、福鳍亚纲、鱗形目、鱗亚目、牙鲜科、牙鲆属。其肉质鲜嫩，是重要的海水增养殖鱼类之一。与大多数鲆鲽鱼相似，雌性鱼个体比相应的雄性个体大的特性使得全雌养殖倍受重视。牙鲆的性染色体属于XX-XY型，至今未找到性染色体和性别决定基因(Fujiwara等，2007)，其性别表型的形成是由遗传和环境因子协同作用而致(GSD+TSD，Luckenbach等，2009)。有关牙鲜性别分化分子生物学的研宄，目前国内外学者研宄多注重于性别相关基因的克隆和表达谱分析，缺乏深入地探讨。其中，牙鲆性腺来源细胞系的缺乏，限制了其性别相关基因的功能研宄以及性别表达调控机制的揭示。同时，近年来，随着环境污染日益加剧和养殖业过度膨胀，病害问题造成严重的经济损失，极大影响了牙鲆养殖业的健康发展。因此，伴随着性别控制和病害防治研宄的深入，体外分离培养牙鲆细胞的应用意义日益凸显。但是，迄今为止，国内外仅有牙鲆鳍条细胞系(中国海洋大学，童裳亮，Aquaculture，1997，156:327-333)、胚胎细胞系(中国水产研宄院黄海水产研宄所，陈松林，Diseases of Aquatic Organisms, 2004，60:241-246)、肾脏细胞系(中国水产研宄院黄海水产研宄所，王娜，Journal of Fish Diseases, 2011，34:81-85)和申请人所在实验室建立的脑细胞系、肌卫星细胞系等5个细胞系，未见有该鱼种性腺组织细胞系建立的报道。因此，体外培养的精巢细胞将成为研宄牙鲆性别相关基因功能、性别分化及病害防治的重要研宄平台。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种培养操作简便的牙鲆精巢细胞系的构建方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0006]一种牙鲆精巢细胞系的构建方法:
[0007](I)原代培养:取健康雄鱼精巢于DF12培养基(含400U/mL青霉素，^Oyg/mL链霉素)中，PBS清洗后将精巢组织充分剪碎，并加入胰蛋白酶消化，而后用细胞培养液充分悬浮，离心收集沉淀，向沉淀中加入细胞培养液使其悬浮，25±0.2°C培养箱正置培养；次日，待组织块完成贴壁后小心补加细胞培养液；
[0008](2)传代培养:待原代培养组织块周围细胞迀出、增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25%胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行原瓶初次传代培养，待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1:1-1:2 (v/v)分瓶传代，以后7-10d传代一次；传至10代后将细胞培养液中的血清含量减为细胞培养液总体积的10%，目前，该细胞已经传至40余代(42-47代)，细胞系建立成功；
[0009]所述细胞培养液为在DF12培养液中加入占细胞培养液总体积20 %的胎牛血清，10ng/ml重组人喊性成纤维细胞生长因子(Recombinant Human FGFb，bFGF)，15ng/ml重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF，EGF)，pH 值为 7.2-7.4，100U/mL 青霉素，100 μ g/mL链霉素，4°C存放，备用。
[0010]步骤(I)中清洗后精巢组织剪成糜状。
[0011]在步骤(I)中精巢组织剪成糜状后，加入0.25(wt)%胰蛋白酶消化lOmin。
[0012]在步骤(I)培养中的精巢组织外植体小块经短暂消化和离心收集后，先用细胞培养液悬浮后在培养箱中正置过夜培养，待组织块贴壁，第二天再补加细胞培养液。
[0013]在步骤(2)中，细胞初次传代时将吸出的旧培养基转入一备用离心管内，待细胞消化完成后在新鲜培养液中加入备用离心管内的旧培养液制备l:l(v/v)比例细胞悬液进行传代。
[0014]本发明所具有的优点和积极效果如下:
[0015]采用本发明方法构建的牙鲆精巢细胞系可以进行连续传代，目前已传40余代，能提供大量的牙鲆精巢细胞，细胞生长温度为25°C，细胞形态为成纤维样，生长曲线正常，染色体众数为正常的48条，也检测到雄性相关基因dmrtl的表达，可以应用于性别分化和病理学研宄；而且，以PEGFP-N3进行基因转染实验，观察到较强的绿色荧光，证实牙鲆精巢细胞系可以直接应用于外源基因功能研宄。
【附图说明】
[0016]图1A、图1B为本发明实施例提供的相差显微镜下传代培养的牙鲆精巢细胞系图，其中A为牙鲆精巢细胞原代培养第13天图(100X) ;B为牙鲆精巢细胞第25代图(100X)。
[0017]图2为本发明实施例提供的牙鲆精巢细胞系第27代的生长曲线图。
[0018]图3为本发明实施例提供的牙鲆精巢细胞系的第31代染色体中期分裂相(200X) ο
[0019]图4为本发明实施例提供的dmrtl基因对牙鲜精巢细胞分子鉴定图。其中M为天根公司DS?2000Marker ；A为dmrtl ;B为以ddW代替cDNA作为模板的阴性对照。
[0020]图5为本发明实施例提供的牙鲆精巢细胞系转染PEGFP-N3后的荧光显微图片(100X) ο
【具体实施方式】
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[0021]本发明建立了鱼类精巢细胞的分离及离体培养体系，操作方法简单，重复性强，较之前报道的其他鱼类的精巢细胞的分离及培养方法更容易掌握和操作，应用价值极大，为进一步的实验研宄提供了材料和技术支持。
[0022]下面结合实施例详述本发明的构建、鉴定和应用方法。
[0023]实施例1
[0024]牙鲆精巢细胞系的建立方法，步骤如下:
[0025]I)配制细胞培养液:取Hyclone公司DF12培养液，向培养液中加入占细胞培养液总体积20%的胎牛血清，lOng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant HumanFGFb, bFGF)，15ng/ml 重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF, EGF)，100U/mL 青霉素，100 μ g/mL链霉素，pH值为7.2，4°C存放，备用。
[0026]2)原代培养:无菌条件下取体重为347.5g健康牙鲆的精巢组织，置于添加了400U/mL青霉素和400 μ g/mL链霉素的4mL Hyclone公司DF12培养液的无菌玻璃平皿中浸泡5min后，吸弃培养液，用2mL PBS (pH 7.2)冲洗精巢组织两次，吸出PBS，将精巢组织剪成糜状小块，加入ImL 0.25%胰蛋白酶消化lOmin，再加入3mL上述步骤I)细胞培养液充分悬浮，2200g快速离心2min，吸弃上清，向组织小块沉淀中加入ImL上述步骤I)细胞培养液用枪轻轻吸打悬浮后接种于25cm2培养瓶，于25±0.2°C培养箱正置培养。次日，待组织块完成贴壁后小心补加ImL细胞培养液，然后每隔4d半量更换培养瓶中细胞培养液一次。
[0027]3)传代培养:待步骤2)原代培养细胞不断从组织块周围迀出并快速增殖，当组织块周围细胞晕形成并停止生长后，将旧的培养液移入一备用无菌离心管内，用PBS(pH 7.2)冲洗细胞I次，吸弃PBSjpA ImL的0.25%胰蛋白酶液消化。显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞消化完全，在原瓶中加入新鲜培养液与旧的培养液按照1:1 (v/v)比例混合得到的培养液悬浮细胞后进行传代。在后续继代培养期间，当细胞长满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入2mL新鲜细胞培养液轻轻吸打使细胞悬浮，按1:l(v/v)的比例进行分瓶传代；根据细胞生长状态，约7-10d传代一次；传至10代后，进行1:1-1:2(v/v)分瓶传代，每3-5d传代一次，进而细胞系建立成功。目前，该细胞已经传至42代。细胞已能稳定增殖，细胞系命名为P0TC。该细胞系主要细胞类型为成纤维样细胞(如图认3所示)。
[0028]实施例2
[0029]牙鲆精巢细胞系的鉴定和应用
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