阴道上皮细胞培养基及阴道上皮细胞培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种阴道上皮细胞培养基，以及阴道上皮细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]由于阴道自身的结构特点，直接与外环境接触，性交过程等因素很容易接触感染病原微生物，而阴道存在着自净作用，并且作为第一道防线的上皮细胞在阴道先天免疫过程中发挥一定作用。研宄人员较容易地在医院获得来自正常个体或阴道炎症患者的阴道上皮细胞。然而，现有技术中，阴道上皮细胞培养的培养基成分比较复杂，配置不方便；目前市面上的阴道上皮细胞分离培养试剂盒虽然操作简单，但价格昂贵，操作繁琐，不利于大批量的研宄实验。
【发明内容】
[0003]针对以上要解决的问题，本发明的一个目的是提供一种阴道上皮细胞培养基，增加上皮细胞数量，减少成纤维细胞数量，改善细胞融合状态。
[0004]本发明的另一个目的是提供一种阴道上皮细胞的培养方法，提高培养效率，降低阴道上皮细胞培养成本，简化操作。
[0005]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种阴道上皮细胞培养基。该阴道上皮细胞培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为无血清培养基；添加剂包括表皮生长因子、牛垂体提取物、胰岛素-转铁蛋白-砸、胎牛血清、青霉素-链霉素和霍乱菌素。
[0006]根据本发明的阴道上皮细胞培养基，其各组分的比例为:所述基础培养基为47.2mL无血清培养基；所述添加剂包括8 μ L表皮生长因子、300 μ L牛垂体提取物、500 μ L胰岛素-转铁蛋白-砸、1.5mL胎牛血清、500 μ L青霉素-链霉素和0.9 μ L霍乱菌素。
[0007]根据本发明的另一个方面，提供一种阴道上皮细胞培养方法。该培养方法采用本发明如上所述阴道上皮细胞培养基培养阴道上皮细胞。该培养方法是在培养的前三天禁止移动，第4天开始采用上述阴道上皮细胞培养基换液，第6-8天细胞开始融合，培养温度为37。。。
[0008]应用本发明的技术方案，本发明的阴道上皮细胞培养基成分明确，通过该培养基培养得到的上皮细胞数量多、成纤维细胞数量少、细胞融合状态好，这对提高阴道上皮细胞原代培养细胞数具有重要意义。
【附图说明】
[0009]图1示出了实验中实施例2的阴道上皮细胞培养基培养大鼠阴道上皮细胞第6天细胞开始融合的图像；
[0010]图2示出了上皮细胞特异的标志性角蛋白的广谱角蛋白免疫荧光染色图像。原代培养大鼠阴道上皮细胞的鉴定:a)光镜下原代培养大鼠阴道上皮细胞；b)绿色荧光显示原代培养的阴道上皮细胞特异性标记抗角蛋白的FITC免疫活性；c)未加一抗的阴性对照组光镜下细胞图；d)未加一抗的阴性对照组FITC荧光结果。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。以下实施例所使用的成分均为市售商品。如未特别指出，实验步骤中的部分操作为本领域技术人员可确定的常规操作，故不一一赘述。
[0012]实施例1
[0013]配制10mL储备液，其中包括:(1)94.4mL无血清培养基；(2) 16 μ L表皮生长因子、(3) 600 μ L牛垂体提取物、(4) 1000 μ L胰岛素-转铁蛋白-砸添加剂、(5)3mL胎牛血清、(6) 1000 μ L青霉素-链霉素(细胞培养用青霉素-链霉素)和(7) 1.8 μ L霍乱菌素。
[0014]以上各组分混合均匀即得。
[0015]实施例2
[0016]阴道上皮细胞培养:
[0017]实验材料:雌性大鼠阴道组织
[0018]培养基:实施例1中的阴道上皮细胞培养基
[0019]实验步骤:
[0020]S1:C02窒息处死处在动情间期的SD雌性大鼠，迅速取出阴道组织，立即浸泡在实施例I配制的含有1%青霉素-链霉素的阴道上皮细胞培养基中；修剪阴道组织，去除皮毛、脂肪、血管等；用含有1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液清洗修剪后的组织2-3次；将组织剪碎呈糜烂约30min ;胶原酶消化，移除上清液，再消化；225g离心；弃上清，加入阴道上皮细胞培养基完全培养液重悬细胞沉淀，接种在6孔板中。
[0021]S2:37°C,95% C02/5% O2恒温恒湿培养，3天内禁止移动孔板。
[0022]S3:3天后首次换液，此后每2天换一次培养基。
[0023]如图1所示，图像显示，实施例2的阴道上皮细胞培养基培养大鼠阴道上皮细胞在第6天细胞开始融合。
[0024]图2示出了上皮细胞特异的标志性角蛋白的广谱角蛋白免疫荧光染色图像。
[0025]由图1和图2可见，用此培养液培养第六天的阴道上皮细胞。图1显示细胞生长良好，数目多，细胞团完全散开贴壁，细胞之间可以形成上皮细胞特有的紧密连接。为了进一步证实得到的原代培养细胞是上皮细胞，用绿色荧光FITC对上皮细胞特异性标记蛋白角蛋白进行标记，利用免疫荧光的方法鉴定所得到上皮细胞的纯度。结果发现，绝大多数成片存在的细胞都有绿色荧光(图2a，b)，细胞群落中偶尔散布成纤维细胞，上皮细胞的比例在95%以上。而在没有加一抗，只加了二抗的阴性对照中(图2c，d)，绿色荧光不能检测到，说明图2b中的绿色荧光为角蛋白特异发出，此鉴定方法可靠。
[0026]由此可见，通过本发明的阴道上皮细胞培养基培养得到的上皮细胞数量多、成纤维细胞数量少、细胞融合状态好，有助于提高阴道上皮细胞原代培养细胞数。
【主权项】
1.一种阴道上皮细胞培养基，其特征在于包括基础培养基和添加剂；其中，所述基础培养基为无血清培养基；所述添加剂包括表皮生长因子、牛垂体提取物、胰岛素-转铁蛋白-砸、胎牛血清、青霉素-链霉素和霍乱菌素。
2.根据权利要求1所述的阴道上皮细胞培养基，其特征在于其各组分的比例为:所述基础培养基为47.2mL无血清培养基；所述添加剂包括8 μ L表皮生长因子、300 μ L牛垂体提取物、500 μ L胰岛素-转铁蛋白-砸、1.5mL胎牛血清、500 μ L青霉素-链霉素和0.9 μ L霍乱菌素。
3.一种阴道上皮细胞的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的阴道上皮细胞培养基培养。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤:培养的前三天禁止移动，第四天开始换液，然后采用权利要求1或2所述的阴道上皮细胞培养基进行培养，培养温度为37 °C。
【专利摘要】本发明提供了一种阴道上皮细胞培养基，其包括基础培养基和添加剂；其中，所述基础培养基为无血清培养基；所述添加剂包括表皮生长因子、牛垂体提取物、胰岛素-转铁蛋白-硒、胎牛血清、青霉素-链霉素和霍乱菌素。本发明还提供了一种阴道上皮细胞培养方法。本发明的阴道上皮细胞培养基成分明确，通过该培养基培养得到的上皮细胞数量多、成纤维细胞数量少、细胞融合状态好。
【IPC分类】C12N5-071
【公开号】CN104630134
【申请号】CN201510085157
【发明人】叶中华, 周文良, 朱蕴馨, 刘雯, 杨登亮, 黄洁虹
【申请人】叶中华, 周文良
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月15日