一种培养Marc-145细胞用的培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种培养基及其制备方法，具体设及一种培养Marc-145细胞用的培 养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪藍耳病又称"猪繁殖与呼吸障碍综合征"，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒引 起，W成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，W及仔猪呼吸异常为特征的传染病，是一种免疫 抑制病，常常继发其他病原感染。我国高致病性藍耳病的预防采用弱毒疫苗或者灭活疫苗 进行预防。在高致病性藍耳病病毒的灭活疫苗或者活疫苗生产过程需要培养Marc-145细 胞。
[0003] 现有的Marc-145细胞培养过程中，通常需要加入8-10%的牛血清进行培养，加入 的牛血清较少，则会使得Marc-145细胞的生长繁殖速度过慢。如公开号为CN102002482A的 发明专利申请文件，公开了一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其中公开了细 胞生长液的配方：体积百分含量为90-92 %的DMEM溶液、8-10%的牛血清、1 %的双抗、1 % 的谷氨酷胺；公开号为CN101748101A的发明专利申请文件，公开了一种猪繁殖与呼吸综合 征病毒的生产方法，其中公开了生长液为添加10%新生牛血清的DMEM培养液。胎牛血清价 格较贵，在Marc-145细胞培养基中须要加入较多的量，使得疫苗生产成本变高，给生产企 业和消费者增加了负担。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种牛血清用量少、Marc-145细胞生长繁殖速度快的培养 Marc-145细胞用的培养基及其制备方法。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成；DMEM、酶解明胶溶液、氨 基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积 比为；酶解明胶溶液；氨基酸DMEM溶液；胎牛血清；DMEM = 1-2:1-5:2-5:100 ;
[0007] 所述酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为20-80mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为 ros溶液；
[000引所述氨基酸DMHM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计（此处的质量体 积比是指溶质的组分质量与氨基酸DMEM溶液体积之比）的如下组分组成；丙氨酸5-35mg/ L、精氨酸10-60mg/L、天口冬酷胺5-25mg/L、天冬氨酸15-80mg/L、脱氨酸5-30mg/L、谷氨酸 50-100mg/L、谷氨酷胺 40-80mg/L、甘氨酸 5-20mg/L、组氨酸 5-lOmg/L、异亮氨酸 5-15mg/ L、亮氨酸10-20mg/L、赖氨酸10-25mg/L、甲硫氨酸10-30mg/L、苯丙氨酸5-20mg/L、脯氨酸 10-40mg/L、丝氨酸 10-30mg/L、苏氨酸 10-40mg/L、色氨酸 5-80mg/L、酪氨酸 10-50mg/L、鄉 氨酸10-20mg/L、哲基脯氨酸5-lOmg/L、高半脱氨酸2-lOmg/L和牛横酸5-15mg/L。
[0009] 本发明中，优选的方案为所述酶解明胶溶液为膜酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液 用超纯水配制而成。
[0010] 本发明中，优选的方案为所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清 的体积比为；酶解明胶溶液；氨基酸DMEM溶液；胎牛血清；DMEM = 1-2:1-5:2-3:100。
[0011] 本发明中，优选的方案为所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清 的体积比为；酶解明胶溶液；氨基酸DMEM溶液；胎牛血清；DMEM = 1:2:2-5:100 ;
[0012] 所述氨基酸DMEM溶液中的溶质由按照质量体积比计的如下组分；丙氨酸5mg/L、 精氨酸lOmg/L、天口冬酷胺5mg/L、天冬氨酸15mg/L、脱氨酸5mg/L、谷氨酸50mg/L、谷氨酷 胺40mg/L、甘氨酸5mg/L、组氨酸5mg/L、异亮氨酸5mg/L、亮氨酸lOmg/L、赖氨酸lOmg/L、 甲硫氨酸lOmg/L、苯丙氨酸5mg/L、脯氨酸lOmg/L、丝氨酸lOmg/L、苏氨酸lOmg/L、色氨酸 5mg/L、酪氨酸lOmg/L、鄉氨酸lOmg/L、哲基脯氨酸5mg/L、高半脱氨酸2mg/L和牛横酸5mg/ L。
[0013] 本发明中，优选的方案为所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清 的体积比为；酶解明胶溶液；氨基酸DMEM溶液；胎牛血清；DMEM = 1:2:2-5:100 ;
[0014] 所述氨基酸DMEM溶液中的溶质由按照质量体积比计的如下组分；丙氨酸8mg/L、 精氨酸12mg/L、天口冬酷胺9mg/L、天冬氨酸20mg/L、脱氨酸7mg/L、谷氨酸60mg/L、谷氨酷 胺50mg/L、甘氨酸lOmg/L、组氨酸8mg/L、异亮氨酸8mg/L、亮氨酸12mg/L、赖氨酸12mg/L、 甲硫氨酸15mg/L、苯丙氨酸6mg/L、脯氨酸lOmg/L、丝氨酸lOmg/L、苏氨酸lOmg/L、色氨酸 5mg/L、酪氨酸13mg/L、鄉氨酸lOmg/L、哲基脯氨酸6mg/L、高半脱氨酸5mg/L和牛横酸6mg/ L。
[0015] 本发明还提供该培养Marc-145细胞用的培养基的制备方法：根据配方的体积比 分别量取DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清，混合，得到培养基。
[0016] 本发明中，优选的方案为所述氨基酸DMEM溶液由如下方法制成：取配方量的丙氨 酸、精氨酸、天口冬酷胺、天冬氨酸、脱氨酸、谷氨酸、谷氨酷胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、鄉氨酸、哲 基脯氨酸、高半脱氨酸、牛横酸，然后溶解在配方量的DMEM溶液中，得到氨基酸DMEM溶液。
[0017] 本发明中，优选的方案为所述酶解明胶溶液由如下步骤制备：
[001引 a ;将明胶溶解在PBS溶液中，得到明胶PBS溶液，所述明胶PBS溶液的质量体积浓 度为 25-600mg/ml ;
[0019] b ;将a步骤得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理 的温度为12TC、压力为103. 4KPa、时间为20min ;
[0020] C ;将经过b步骤处理的明胶PBS溶液冷却至常温，加入质量百分浓度为0. 25%的 膜酶溶液（本发明中的膜酶溶液，是指膜酶加入无Ca"、Mg2+的D-Hanks'平衡盐溶液中配 制而成的溶液），在37°C温度下酶解8-2化，重复该操作1-3次；
[0021] d ;将经过C步骤处理明胶PBS溶液冷却至2-8°C，如出现凝固现象，则重复C步骤， 直至在2-8°C时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。
[0022] 本发明中，优选的方案为所述C步骤中每次加入的膜酶溶液与明胶PBS溶液的体 积比为1:9-10。
[0023] 本发明中，优选的方案为所述C步骤中酶解的时间为2化，所述C步骤中重复操作 的次数为2-3次。
[0024] 与现有技术相比，本发明的优点在于；本发明的培养Marc-145细胞用的DMEM中 通过加入酶解明胶溶液和氨基酸DMEM溶液，使得培养Marc-145细胞用的牛血清用量降至 2-5%，大幅减少了牛血清的用量，降低了生产成本；牛血清用量的减少，降低了后续病毒的 纯化带来分离难度；此外，本发明的制备方法简单、易操作，便于实现大规模生产的需要。
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
【具体实施方式】 [0026] 实施例1
[0027] 一种培养Marc-145细胞用的培养基，其由如下成分组成；DMEM、酶解明胶溶液、氨 基酸DMEM溶液和胎牛血清；所述DMEM、酶解明胶溶液、氨基酸DMEM溶液和胎牛血清的体积 比为；酶解明胶溶液；氨基酸DMEM溶液；胎牛血清；DMEM = 1:2:X:100 ;
[002引所述酶解明胶溶液为膜酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成；所述 酶解明胶溶液中的蛋白质浓度为50mg/ml，所述酶解明胶溶液中的溶剂为PBS溶液；
[0029] 所述氨基酸DMEM溶液中的溶剂为DMEM，溶质由按照质量体积比计的如下组分组 成；丙氨酸5mg/L、精氨酸lOmg/L、天口冬酷胺5mg/L、天冬氨酸15mg/L、脱氨酸5mg/L、谷氨 酸50mg/L、谷氨酷胺40mg/L、甘氨酸5mg/L、组氨酸5mg/L、异亮氨酸5mg/L、亮氨酸lOmg/L、 赖氨酸lOmg/L、甲硫氨酸lOmg/L、苯丙氨酸5mg/L、脯氨酸lOmg/L、丝氨酸lOmg/L、苏氨酸 lOmg/L、色氨酸5mg/L、酪氨酸lOmg/L、