获得高产稳定表达细胞克隆的方法及由此获得的抗体分子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种有效的获得高产稳定表达细胞克隆的 方法，该方法用于在灌流发酵工艺中生产治疗性抗体。
【背景技术】
[0002] 治疗性抗体构成了生物技术药物市场的主要类别（Walsh G，2014，Nature Biotechnology 2014，32: 992 - 1000)。一些治疗性抗体已经获得注册批准用于治疗 癌症、自身免疫性疾病和其他慢性病，几十种重组抗体也正处于不同的临床阶段（Biologic Medicines in Development, Phrma Report 2013，www.phrma.org)。通常，病人接受治疗 性抗体，每一个剂量下要几百毫克，因此，目前全世界范围内对抗体产能的需求是巨大的。
[0003] 几种方法已经被用于提高工业细胞系的产能，例如，基因扩增系统，细胞培养基的 优化和选择高产稳定表达的细胞克隆。基因修饰和重组骨髓瘤细胞系的表观遗传适应来生 产治疗性抗体是目前非常有竞争性的研宄领域（Barnes et al.，2000，Cytotechnology 32:109-123; Barnes et al. , 2007, Biotechnol Bioeng 96:337-349)〇
[0004] 基于灌流发酵的生产工艺允许在发酵收获液中有高密度的细胞培养和潜在的高 抗体浓度，然而，长期的高密度细胞培养需要高产稳定表达的细胞克隆来真正优化抗体的 生产。无蛋白培养基已经被开发出来用于生物药的生产，例如，PFHMII细胞培养基(购自美 国Hyclone公司）。
[0005] 重组抗体生产的NS0细胞系已经被成功适应于无蛋白培养基（W0 2004/038010 A1)，然而，适应于无血清培养基和下一步的无血清培养基中的长时间发酵工艺通常伴随着 细胞系产能的损失（Barnes et al.，2003，Biotechnol Bioeng 81: 631-639; Barnes et al.，2004，Biotechnol Bioeng 85: 115-121)。适应于无蛋白培养基的高产稳定表达细 胞克隆能从不稳定的重组骨髓瘤细胞系中重新获得（CN104152415A)。
[0006] 但是实践中，一些重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白培养基的适应过程 是不可能的或者需要很长的时间，同时由于非生产细胞群的出现而导致抗体产能的损失。 具有工业潜能的细胞系的选择工艺必须不断改进。
[0007] 生物药品，尤其治疗性抗体是很复杂的糖蛋白分子。生产工艺中的任何变化 都可能会导致产品特性的变化。可比较性的概念因此出现用于评估产品特性上的这些 变（Demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), Center for DrugEvaluation and Research (CDER) April 1996. www. fda. gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatory Information/Guidances/ ucml22879.htm; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003). www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/320700en.pdf; ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adopted by CMPM, December 1, 2004, CPMP/ ICH/5721/03, date for coming into operation: June 2005; MHLff: Adopted 26 April 2005, PFSB/ELD Notification No. 0426001; FDA: Published in the Federal Register, Vol. 70, No. 125, June 30, 2005; 37861-2www.ich.org/fileadmin/Public Web Site/ICH Products / Guidelines/ Quality/Q5E/Step4 /Q5E Guideline, pdf)。细 胞系的改变被认为是生产工艺的重要修饰，因此，尽管具有工业潜能的细胞系的选择在生 产工艺的开发中是绝对必要的，但是任何选择的具有稳定性和高表达量特性的细胞系是否 适合是不确定的，因为分泌的免疫球蛋白的一些变化可能会影响它的生物学性质，对于生 产工艺改造而言，如生产规模或生产场所，每一个特异性抗体的属性特征的确认都是下一 步可比性研宄的先决条件。
[0008] 14F7是一种特异性结合肿瘤相关抗原N-羟乙酰基-GM3神经节苷脂
[GM3(Neu5Gc)] (ZL 99800261.5; Carr et al.，2000，Hybridoma 19，241-247)的一 种单克隆抗体。GM3(Neu5Gc)抗原已经在乳腺癌（Marquina et al.，1996，Cancer Res 56， 5165-5171; Oliva et al.， 2006， Breast Cancer Res Treat 96， 115-121)、黑 色素瘤（Osorio et al.，2008，Cancer BiolTher 7，488-495)、非小细胞肺癌（van Cruijsen et al. , 2009, BMC Cancer 9, 180; Hayashi et al. , 2013, Cancer Sci 104, 43-47)、Wilms 瘤（Scursoni et al., 2010, Pediatr Dev Pathol 13, 18-23)、神经外胚 瘤（Scursoni et al. , 2011, Clin Dev Immunol 245181)、肉瘤和甲状腺癌（Blanco et al., 2013, Journal of Biomarkers, 602417)和消化系统（Blanco et al., 2011, ISRN Gastroenterol 645641)以及泌尿生殖系统（Blanco et al., 2011, ISRN Pathology, 953803)的肿瘤中被检测出来。
[0009] 14F7单抗能够杀死补体依赖方式表达神经节苷脂的肿瘤细胞（Carr et al., 2002, Hybrid Hybridomics 21, 463-468; Roque-Navarro et al. , 2008, Mol Cancer Ther 7，2033-2041)。通过潜在的人T细胞表位的修饰获得的人源化抗体（CN1809592A; Mateo et al.，2000，Hybridoma 19，463-471)，命名为 14F7h，保留了鼠和嵌合抗体的 性质（Fernandez-Marrero et al.，2011，Immunobiology 216，1239-1247)。人源化的 14F7h单抗具有潜在的治疗GM3(NeuGc)表达的肿瘤的价值。
[0010] 然而，能表达14F7h抗体的重组NS0骨髓瘤细胞系在高密度细胞培养基中丧失生 存能力，因为这些细胞表达抗原GM3(Neu5Gc)，然后被分泌的细胞毒抗体所杀死。因此，重组 人源化的14F7h抗体被N-羟乙酰基化-糖复合物缺陷的鼠NS0骨髓瘤细胞系表达，因为 CMP-N-乙酰神经氨酸酶的作用（Fernandez-Marrero et al.，2011，Immunobiology 216， 1239-1247 )。这样的