细胞系显示出很难适应在无血清培养基中生长。
[0011] 在本发明中我们建立了一套新的方法用于开发高产稳定表达的细胞克隆用于灌 流发酵生产工艺。采用这种方法，细胞克隆从生产抗-GM3 (NeuGc)的单抗的重组NS0骨髓 瘤细胞系中重新获得。这种治疗性抗体的属性特征也在本发明中被公开，这种属性特征能 够确定生物药的分子表型。
【发明内容】
[0012] 本方法包含重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白培养基的适应过程，因为 非生产细胞群的出现，该过程是不可能发生的或需要很长的时间，并且伴随着抗体产量的 损失。本发明关键的创新步骤在于无蛋白培养基中以高细胞密度（8 - 10)x 106cells/ml 生长的适应过程，这个过程能够增加高产稳定表达细胞克隆的频率。
[0013] 本发明的方法由三个步骤组成： 1、 适应无蛋白培养基：以低密度静止细胞培养，逐步减少富含脂质的补充物到化学培 养基中； 2、 适应无蛋白培养基：以高密度细胞培养，在实验室规模采用灌流发酵系统； 3、 发酵结束后，从收获液细胞中挑选高产稳定表达的细胞克隆。
[0014] 第一步，在无蛋白培养基（PFHMII)中补充（3-4)g/L的细胞促剂(富含胆固醇、月旨 质和其他营养物)，解冻细胞。最大细胞浓度（Xv)的变动范围是（0.9 - 1.2 )x 106 cell/ ml。连续传代，直到Xv达到一个恒定值。一次传代后起始的细胞浓度被调整到（0.4_ 0. 5) x 106 cell/ml。7次传代后，细胞促剂补充物减少至（1- 2)g/L，再经4次传代后，细 胞促剂补充物被完全转移走。然后，细胞被允许在无任何补充物的无蛋白培养基中生长超 过60天。Xv值达到（1.5 - 1.8 )x 106cell/ml，细胞活力值在95%左右。
[0015] 第二步，在PFHMII细胞培养基中生长超过60天的细胞被接种到5L的生物反应器 中。应用灌流外部装置，细胞浓度从0. 5 x 106 cells/ml生长到10xl06 cells/ml，灌流过 程持续24天。从第0天到第16天，细胞活力维持在90%以上，但是第16天之后，细胞活力 降到80%以下。细胞收获液中平均的抗体浓度在（30 - 40) mg / ml。发酵结束后，细胞 (在无蛋白培养基中生长超过500小时）被冻存到液氮中（最终生产细胞库，EPCB)。
[0016] 在本发明的又一个实施例中，发酵结束后高产稳定表达的细胞克隆被收集，从 EPCB中解冻的细胞经有限稀释法进行细胞克隆（Freshney R.，2010，Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications (6th ed.). Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell. pp. 208 - 211)。细胞培养上清中的分泌抗体通过 ELISA方法来检测，采用抗-14F7h抗独特型抗体4G9作为捕获抗原。细胞培养上清稀释 到1/500。吸光值超过中值的克隆被选择出来用于下一步的流式细胞仪方法进行的结构确 证。细胞内免疫印染用抗人IgG抗体偶联FITC进行，流式细胞仪检测（Pluschke et al.， 2011，BMC Proceedings 5, Suppl 8:P97)。每一个分离的克隆都检测了平均荧光强度 (MFI)和阳性细胞百分比，令人吃惊的是，超过80%的被评价的克隆都显示出其为占主导的 抗体一一生产亚群。
[0017] 细胞活力超过95%的抗体--生产亚群和更高MFI的克隆被挑选出来在转瓶和5L 的生物反应器中进行动力学研宄来评价细胞培养上清中的细胞浓度（Xv)、细胞活力（％)、 比生长速率（iO和IgG浓度。细胞浓度为（4 - 5)X106cells/ml，对数生长期的细胞活力 为大约85%。比生长速率变动范围是（0.015 - 0.025) h' IgG浓度是（70 - 120)mg/ L〇
[0018] 本发明的又一个实施例中，进行了高产稳定表达细胞克隆的长期稳定性研宄，通 过在持续细胞培养的30、60、90天的动力学研宄来进行。比生长速率（y )和比生产速率 (qp )被检测。
[0019] 仍旧在本发明的又一个实施例中，高产稳定表达的细胞克隆分泌的免疫球蛋白的 特征属性被鉴别。这种特征属性的公开从操作层面上定义了这种治疗性抗体14F7h的分子 表型。
【主权项】
1. 一种在无蛋白培养基中从骨髓瘤细胞系获得高产稳定表达细胞克隆的方法，所述方 法用于工业上生产重组抗体，其特征在于，所述的方法包含三个阶段：
1. 适应无蛋白培养基，低密度静止细胞培养，逐步减少富含脂质的补充物到化学培养 基中； II. 适应无蛋白培养基：以高密度细胞培养，在实验室规模采用灌流发酵系统； III. 发酵结束时从细胞中筛选高产稳定表达的细胞克隆。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段I包含以下步骤： I. 适应生长在补充3.5 g/L Cell Boost 5的PFHMII细胞培养基，传代培养，直到活 细胞的最大浓度（Xv)达到一个恒定值； II. 适应生长在补充I g/L Cell Boost 5的PFHMII细胞培养基，传代培养，直到活细 胞的最大浓度（Xv)达到一个恒定值； III. 适应生长在PFHMII细胞培养基中，细胞允许在无任何补充剂的无蛋白培养基中 生长60天。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段II包含以下步骤： I. 适应生长在无蛋白质PFHMII细胞培养基中，以高细胞密度，在5L生物反应器中使 用灌流发酵系统生长超过21天，所述高细胞密度为（5-10) XlO6ceIVml ; II. 发酵结束后，细胞被冻存在液氮中，即最终生产细胞库EPBC。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段III包含以下步骤： I. 从最终生产细胞库中解冻的细胞采用有限稀释法进行细胞克隆； II. 分泌抗体的克隆采用高灵敏度和特异性ELISA方法检测，使用抗独特型抗体作为 捕获抗原； III. 在选择的克隆中使用细胞内免疫印染FACS进行抗体生产细胞亚群的定量检测； IV. 选择比生长速率（μ )和比生产速率（qp)高的克隆进行动力学研宄。
5. 根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述的骨髓瘤细胞系是NSO细胞系。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的骨髓瘤细胞系包含编码人源化重 组抗-NeuGcGM3的抗体14F7h的序列。
7. 根据权利要求6的方法获得的细胞系分泌的人源化重组抗-NeuGcGM3的抗体 14F7h〇
8. 根据权利要求7所述的细胞分泌的人源化重组抗-NeuGcGM3的抗体14F7h，其特征 在于，所述的细胞系是克隆B58-31E7。
9. 根据权利要求8所述的人源化重组抗-NeuGcGM3的抗体14F7h，其特征在于，所述的 抗体具有如下的分子表型：
10.根据权利要求9所述的人源化重组抗-NeuGcGM3的抗体14F7h具有体内和体外抗 肿瘤活性。
【专利摘要】本发明涉及在无蛋白培养基中获得重组骨髓瘤细胞克隆的方法。这个过程包含重组骨髓瘤细胞系，在这个过程中，从无血清培养基到无蛋白培养基几乎是不可能的或者需要很长的时间，并且由于非生长细胞群的存在而伴随着抗体产量的降低。这个过程包含在无蛋白培养基中由低浓度到高浓度逐渐适应的过程。在无蛋白培养基中以高细胞密度培养的表型适应伴随着重组抗体分子分泌率和高产稳定表达细胞克隆百分比的提高。在本发明中公开的细胞克隆能够生产人源化的抗NeuGcGM3 14F7h重组抗体。更进一步的，这个人源化的抗-NeuGcGM3重组抗体14F7hare的属性特征也在本发明中被公开。
【IPC分类】C12N5-09, A61P35-00, C07K16-44
【公开号】CN104651314
【申请号】CN201510080631
【发明人】美林, 胡里奥, 米盖尔, 路明, 塔摩拉, 罗兰多, 白帜, 刘月茂, 肖凯珩, 陈晓, 和振花, 蔡杨柳, 杨振华, 白先宏
【申请人】百泰生物药业有限公司, 分子免疫中心
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月14日