人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞分选扩增领域，特别涉及一种人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性 T细胞的分选扩增方法。
【背景技术】
[0002] CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg)是一种具有免疫调节 功能的细胞群，可通过抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进 一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受中发挥重要 作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式。1995年，Sakaguchi等首 次报道了在自身免疫耐受中存在一类表达IL2受体a链（IL2Ra，⑶25)的T细胞亚群，并将 这类CD4+CD25+T细胞命名为调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg)。随后研宄发现， Treg是一种具有免疫调节功能的细胞群，它能分泌IL-10、TGF-B.表达Foxp3及CTLA-4分 子等，通过细胞间直接接触或细胞因子间接方式抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制 传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、诱 导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方 式，并与免疫调节、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植免疫耐受、母胎免疫耐受等诸多方面有 着密切的联系。因此，Treg细胞是目前国内外研宄的热点。但目前对Treg细胞的功能和 发挥抑制作用的免疫学机制尚未得到完全阐明，对Treg细胞的免疫学特性有必要进一步 深入研宄。而体外成功分离和培养该细胞，将是对其免疫学特性行进一步研宄的必要条件。
[0003] 随着对⑶4+⑶25+Foxp3+调节性Treg细胞的深入研宄，其临床应用潜能一直是目 前研宄的热点。然而，⑶4+⑶25+F 〇Xp3+调节性T细胞仅占正常人外周血⑶4+T淋巴细胞 的5% -10%，其数量极少，必须能够在体外大量扩增才能满足科研及临床应用的需要。免 疫磁珠细胞分选技术（MACS)是本世纪80年代发展起来的一种高效的细胞分离方法，其基 本原理是：根据细胞表面抗原能和连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，将其置于外加 强磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在强磁场中，没有此种表面抗原的细 胞由于不能和连接着磁珠的特异性单克隆抗体结合而无磁性，在强磁场中不滞留，从而分 离出目的细胞。该技术并且不需要大型的仪器设备，容易进行无菌操作，对细胞的功能活性 影响很小，提取分离后可以进行体外培养，因此在对特定细胞亚群的功能研宄中得到了广 泛的应用。
[0004] 因此运用免疫磁珠细胞分选技术（MACS)研制一种人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调 节性T细胞的分选扩增方法具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种人外周血 ⑶4+⑶25+F 〇Xp3+调节性T细胞的分选扩增方法。本发明采用免疫磁珠分选法（MACS 法）成功分选出高纯度的⑶4+⑶25+F 〇Xp3+调节性T细胞，并利用⑶3/⑶28单抗包被的 Dynalbeads联合IL2共同刺激CD4+CD25+Treg细胞，成功扩增了高纯度的Treg细胞。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T 细胞的分选扩增方法，具体步骤如下：
[0007] 1)外周血单个核细胞（PBMC)的分离
[0008] 抽取肝素抗凝静脉血30ml，取6个15ml管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液 5ml，将5ml外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000转/分20 °C离心20min， 收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；
[0009] 2) CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞 MACS 分选
[0010] 将步骤1)中获得的PBMC进行细胞计数，加PBS洗绦，1200转/分离心后倾上清， 以 MACS buffer 90ul/ 每 107个细胞重悬，加入 CD4+T 细胞 Biotin-Antibody 10ul/ 每 10 7 个细胞，混勾，置于2_8°C孵育5min，加入20ul Anti-Biotin Microbeads/每107个细胞， 混匀，2-8°C孵育10min，以MACS buffer将细胞调整至500ul体积，过LD柱，收集过柱后流 下来的细胞悬液为阴选的⑶4+T细胞，将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90ul/每107个 细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，在2-8°C孵育15min，加入l-2ml MACS buffer洗涤 离心，倾去上清，重悬至500ul，过MS柱，把分离器移开，放置lml MACS buffer于MS柱上， 迅速将细胞打下，收集流下的为阳选的⑶4+⑶25+T细胞；
[0011] 3) CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增
[0012] 起始培养细胞数量为2 X105,种于96孔板中，用完全培养液200ul进行培养，第 〇天培养液中加入⑶3/⑶28单抗包被的Dynalbeads，细胞与Dynalbeads磁珠的比例为 1:1-1:2,并加入终浓度为500U/ml的IL2,每3-5天进行细胞换液，并且将孔板中的细胞半 数转移至另一孔中继续培养，每次换液加入终浓度为200U/ml的IL2继续刺激；扩增培养获 得人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞。
[0013] 步骤1)中所述的淋巴细胞分离液优选为购自Sigma公司的淋巴细胞分离液。
[0014] 步骤2)中所述的MACS buffer购于德国美天旎公司。
[0015] MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此 不会损伤细胞。在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场一MACS分 选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微 珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选 纯度和回收率。步骤2)中所述的MS分选柱细胞容量是2*10 8总细胞，10 7个标记细胞；步 骤2)中所述的LD分选柱细胞容量是5*108总细胞，10 8个标记细胞。
[0016] 步骤2)中所述的LD柱为德国美天旎公司购买的LD分选柱。
[0017] 步骤4)中所述的完全培养液为添加10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液体，并 加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
[0018] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019] 本发明中我们采用免疫磁珠两步法（阴选加阳选）成功分离了人外周血 ⑶4+⑶25+Treg细胞，并对其纯度进行了流式鉴定，最终获得的⑶4+⑶25+Treg细胞纯度达 到97%，细胞活性达95%以上。我们的实验结果说明通过目前已成熟的免疫磁珠技术分离 Treg是可行的。然而由于Treg细胞在外周血所占的比例非常少，即使成功分离了高纯度的 Treg还要对其进行扩增才能进行随后的细胞共培养等实验。本发明我们使用CD3/CD28单 抗包被的Dynalbeads联合高浓度IL2体外扩增培养CD4+CD25+Treg细胞，发现Treg细胞 能正常增殖，且培养2周后，细胞数量扩增20倍，培养3周后，细胞数量扩张达40倍，流式 细胞术鉴定其表型仍为⑶4+⑶25+Foxp+。本发明通过提供的的人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+ 调节性T细胞的分选扩增方法获得大量⑶4+⑶25+F 〇Xp+调节性T细胞，扩增前后Treg细 胞的纯度及表型无明显变化。
【附图说明】
[0020] 图1为应用流式细胞术检测人外周血CD4+CD25+Foxp+Treg占CD4+T细胞的结果 图，其中：A.是所有细胞的流式图，画圈部分为淋巴细胞，以淋巴细胞设门，进行下一步的 流式鉴定；B.是P1门内CD4+T细胞及CD4-细胞的百分比，并以CD4+T细胞进行设门P2,分 析⑶4+T细胞亚群情况；C.是P1门里⑶4⑶25的情况：UL是"左上象限"是指⑶4-⑶25+占 的百分比，UR是右上象限CD4+CD25+占的百分比，LL左下象限是CD4-CD25-百分比，LR是 ⑶4+⑶25-百分比；D.是P2门里分析⑶4+T细胞里，⑶25及Foxp3情况（跟C一样分4个 象限）：UL左上象限：CD25-Foxp3+，UR右上象限：CD25+Foxp3+，LL左下象限：CD25-Foxp3-， LR右下象限CD25+Foxp3-〇
[0021] 图2为利用流式细胞术鉴定分选后⑶4+⑶25+Treg细胞的纯度的结果图，其中： A?是 CD4+CD25+双阳细胞占了 97. 1% ;B.CD25+Foxp3+细胞占了 96.52%。
[0022] 图3为Treg加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads和高浓度IL2与96孔板培养 的结果图；其中，A为0天时的细胞图；B为7天时的细胞图；C为14天时的细胞图。
[0023] 图4为Treg加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads和高浓度IL2与96孔板培养 的细胞生长曲线图。
[0024] 图5为流式细胞术检测扩增后细胞Foxp3的表达的结果图；其中：A.是扩增前 CD25+Foxp3双阳细胞占了 96. 52% ;B.是扩增后CD25+Foxp3+双阳细胞占了 92. 56%。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。<