br>[0026] 实施例1
[0027] 1.本实施例所用材料主要如下：
[0028] (1)标本来源：外周血标本采自健康志愿者，共3例。年龄25-32岁，中位年龄26 岁，男性1例，女性2例。
[0029] (2)主要试剂：淋巴细胞分离液购自Sigma公司，⑶3/⑶28单抗包被的 Dynalbeads 购自 Dynal Inc. (0slo，Norway)，O)4+a)25+Treg 细胞分选试剂盒、免疫磁珠分 选仪（autoMACS Pro Separator)、MACS buffer、LD及MS MACS分离柱均购自德国Miltenyi Biotec公司。细胞培养试剂：RPMI 1640细胞培养液体、青霉素和链霉素双抗、胎牛血清购 自Gibco公司，流式抗体：CD4-FITC，CD25-APC、Foxp3-PE及PE同型对照单克隆抗、固定剂、 破膜剂均购自BD Pharmigin公司。细胞计数仪为Beck-man coulter (美国），流式细胞仪 购自 BD 公司（BD FACS Verse-Z6511550198)〇
[0030] 2. -种人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，具体步骤如 下：
[0031] 1)外周血单个核细胞（PBMC)的分离
[0032] 抽取肝素抗凝静脉血30ml，取6个15ml管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液 5ml，将5ml外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000转/分20 °C离心20min， 收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；
[0033] 2)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞比例的流式检测
[0034] 将PBMC调整至IX 107/ml，取100ul细胞悬液，向其中加入CD4-FITC，CD25-APC 各l〇ul，混匀，室温避光孵育30min，经PBS洗涤离心后分别加入lml Fixation/ Permeabilization破膜剂，室温避光孵育40min，用破膜缓冲液洗涤2次后，加入10ul Foxp3-PE (同型对照管加入10ul小鼠IgG rl-PE)，避光孵育30min，经破膜缓冲液洗涤2 次，用500ul PBS重悬，上流式机检测Treg占⑶4+T细胞的百分比；
[0035] 3)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞MACS分选
[0036] 上述步骤获得的PBMC进行细胞计数，加PBS洗涤，1200转/分离心后倾上清，以 嫩05 131^€6190111/每107个细胞重悬，加入004+1'细胞13;[01:;[11-4111:;[130(1710111//每10 7个 细胞，混勾，置于2_8°C孵育5min，加入20ul Anti-Biotin Microbeads/每107个细胞，混 匀，2-8°C孵育10min，以MACS buffer将细胞调整至500ul体积，过LD柱，收集过柱后流下 来的细胞悬液为⑶4+T细胞（阴选），将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90ul/每107个 细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，在2-8°C孵育15min，加入l-2ml MACS buffer洗涤 离心，倾去上清，重悬至500ul，过MS柱，把separator移开，放置lml MACS buffer于MS柱 上，迅速将细胞打下，收集流下的为⑶4+⑶25+T细胞（阳选）；
[0037] 4)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增
[0038] 起始培养细胞数量为2 X 105,种于96孔板中，用完全培养液200ul进行培养（RPMI 1640细胞培养液体+10%胎牛血清+青、链霉素双抗100U/ml)，第0天培养液中加入⑶3/ CD28单抗包被的Dynalbeads，细胞与磁珠的比例为1:1-1:2,并加入终浓度为500U/ml的 IL2,每3-5天行细胞换液，并且将孔板中的细胞半数转移至另一孔中继续培养，每次换液 加入终浓度为200U/ml的IL2继续刺激；分别在扩增培养的第0天、7天、14天、21分别进 行细胞计数并检测细胞的活性。取扩增培养第〇天及第14天细胞行流式细胞术检测扩增 前后细胞纯度、主要表面标记及Foxp3的表达情况；具体步骤同步骤2)。
[0039] 结果数据用SPSS16. 0软件进行统计分析，计量资料采用t检验，P < 0. 05为差异 有统计学意义。
[0040] 3.上述人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法的检测结果如 下：
[0041] (1)正常人外周血Treg的表达情况
[0042] 应用流式细胞术检测人外周血CD4+CD25+Foxp+Treg占CD4+T细胞的比例，结果 显示：人外周血Treg占外周CD4+T细胞的比例约为7. 94±1. 86% (9. 98,6. 5,6. 34)(见图 1)，与国内外报道的5~10%相一致。
[0043] (2)分选后Treg纯度鉴定
[0044] 使用免疫磁珠法将PBMC进行分选，分选出⑶4+⑶25+Treg和⑶4+⑶25-两群细 胞，利用流式细胞术鉴定分选后⑶4+⑶25+Treg细胞的纯度，如图2所示：经过分选后， CD4+CD25+细胞的比例为 96.82±0.41% (97,96.35,97. 12)，CD4+CD25+Foxp+Treg细胞的 纯度可达95. 86±0. 65% (96. 52,95. 23,95. 84)。细胞活性检测显示均大于95%。
[0045] ⑶Treg扩增情况
[0046] 图3显示为Treg加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads和高浓度IL2与96孔板 培养〇天、7天、14天时的情况。表1与图4是细胞生长曲线图。可见经过2周扩增，Treg 细胞数量可扩增置原来的20倍，经过3周的扩增，Treg细胞扩增置原来40倍。
[0047] 表1为细胞生长曲线结果数据
[0048]
[0049] (4)扩增前后纯度及表型的变化
【主权项】
1. 一种人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，其特征在于：具体 步骤如下： 1) 外周血单个核细胞的分离 抽取肝素抗凝静脉血30ml，取6个15ml管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5ml， 将5ml外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000转/分20°C离心20min，收集 淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用； 2. CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞 MACS 分选 将步骤1)中获得的PBMC进行细胞计数，加 PBS洗涤，1200转/分离心后倾上清，以MACS buffer 90ul/ 每 IO7个细胞重悬，加入 CD4+T 细胞 Biotin-Antibody IOul/ 每 10 7个细胞， 混匀，置于 2-8°C孵育 5min，加入 20ulAnti-Biotin Microbeads/每 IO7个细胞，混匀，2-8°C 孵育lOmin，以MACS buffer将细胞调整至500ul体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞 悬液为阴选的⑶4+T细胞，将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90ul/每IO7个细胞重悬， 加入CD25MicroBeads，混匀，在2-8°C孵育15min，加入l-2ml MACS buffer洗涤离心，倾去 上清，重悬至500ul，过MS柱，把分离器移开，放置Iml MACS buffer于MS柱上，迅速将细胞 打下，收集流下的为阳选的⑶4+⑶25+T细胞； 3. CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增 起始培养细胞数量为2 X 105,种于96孔板中，用完全培养液200ul进行培养，第0天培 养液中加入⑶3/0)28单抗包被的Dynalbeads，细胞与Dynalbeads磁珠的比例为1:1-1:2， 并加入终浓度为500U/ml的IL2,每3-5天进行细胞换液，并且将孔板中的细胞半数转移至 另一孔中继续培养，每次换液加入终浓度为200U/ml的IL2继续刺激；扩增培养获得人外周 血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。
2. 根据权利要求1所述的人外周血⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法， 其特征在于：步骤4)中所述的完全培养液为添加 10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液 体，并加有lOOU/ml青霉素和lOOU/ml链霉素。
【专利摘要】本发明公开了一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，属于细胞分选扩增领域。所述的人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，具体步骤如下：1)外周血单个核细胞的分离；2)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞MACS分选；3)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增；最终扩增培养获得人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。本发明中采用免疫磁珠两步法成功分离了人外周血CD4+CD25+Treg细胞，并对其纯度进行了流式鉴定，最终获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度达到97％，细胞活性达95％以上。
【IPC分类】C12N5-0783
【公开号】CN104651309
【申请号】CN201510059318
【发明人】张建平, 陈慧, 祝丽琼, 刘梅兰, 刘玉昆, 谭剑平, 陈立斌, 刘颖琳, 王蕴慧, 张睿
【申请人】中山大学孙逸仙纪念医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月4日