一种体外诱导扩增nk细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及利用三叶青提取物的一种体外诱导扩增NK 细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。NK细胞是一类独立 的淋巴细胞群，NK细胞主要通过细胞毒活性而显示生物学效应，可直接杀伤肿瘤细胞、病毒 感染的细胞，胞内寄生菌等。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，其仅杀伤异 常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在 免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。NK细胞主要以组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC)非限制性方式识别肿瘤，通过颗粒酶B(granzyme B)和 穿孔素（perforin)等途径杀伤肿瘤细胞，而T细胞表面的⑶107aPb分子，与T细胞活化以 后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞具有的特异性杀伤活性。
[0003] 同时，NK细胞还能与其它固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用，协同发挥抗 肿瘤作用。目前NK细胞已经成为肿瘤患者过继免疫治疗的重要效应细胞。由此可见，为满 足生物学功能研究和临床过继细胞免疫治疗需要，扩增出高效和较多数量的NK细胞是许 多学者共同研究的课题。
[0004] 现阶段体外扩增NK细胞主要采取饲养层细胞共培养法和免疫磁珠分选法，但饲 养层细胞共培养是将NK细胞添加到经改造后的肿瘤细胞株，这样改造在临床上应用的安 全性没有得到保障，而免疫磁珠分选法操作过程繁琐，成本高，不适合临床大规模应用。
【发明内容】
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[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法， 可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从 而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
[0006] 为实现该发明目的，本发明采用的技术方案为：一种体外诱导扩增NK细胞 的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为 0. 00625 u g/ml ~9. 76 u gg/ml。
[0007] 更具体的，本发明的体外诱导扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上 下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液 分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
[0009] (2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至NK细胞浓 度为2X10 5~lX106/ml，接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于37°C、5% C02培养箱培 养；
[0010] ⑶细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4X 104~6X 10 4/mL，NK 细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0. 00625 y g/ml~9. 76 y g/ml， 此后继续培养；
[0011] ⑷细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。
[0012] 优选的，步骤⑵中的rhIL-2的浓度为500U/ml。
[0013] 优选的，步骤（2)中NK细胞浓度为3. 5X 105ml。
[0014] 优选的，步骤（3)中调整细胞密度为5X104/ml。
[0015] 优选的，步骤（3)中三叶青提取物的浓度为0? 01 ii g/ml~2. 44 ii g/ml。
[0016] 优选的，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为用乙醇溶液加热 回流三叶青而提取得到的。
[0017] 优选的，所述的三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-W3,其制备方法为经有机溶剂提 取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干。
[0018] 优选的，所述的三叶青提取物为石油醚部位Th-P，取三叶青总提取物，用石油醚进 行分步萃取得到。
[0019] 优选的，所述的三叶青提取物为水部位脱糖部位Th-W2,其制备方法为三叶青总提 取物的水部位除去糖分，用30%乙醇水洗脱溶液蒸干后得到。
[0020] 本发明通过向NK细胞培养液中加入三叶青提取物扩增自然杀伤细胞的方法的在 于：
[0021] 三叶青的有效成分主要为含黄酮类化学成份，其性凉，味辛、苦，无毒，具有清热解 毒、活血止痛、祛风化痰、活血止痛等功效，常用于高热惊厥，小儿感冒发热、喉痒肿痛、咳 嗽、肺炎、肝炎、肠炎、痢疾等疾病。现代药理研究表明，三叶青提取物具有较好的抗肿瘤、抗 炎、镇痛及解热作用等。本发明人通过对三叶青的成分进行提取分离和鉴定分析，发现不 同部位的三叶青提取物，只要很低的剂量即能明显促进人NK细胞增殖，提高NK细胞的杀瘤 活性。
[0022] 本发明从大规模生产的可操作性，临床应用安全性以及有效性角度出发，优化出 三叶青提取物诱导NK细胞的最佳方案，与其他方法相比，本发明有以下优点：
[0023] 1.本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活 性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法 操作简便，成本低，适用于大规模应用；
[0024] 2.利用本发明所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平 均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。
【附图说明】
[0025] 图1?三叶青提取技术路线图；
[0026] 图2.不同浓度三叶青提取物TH-t对NK细胞增殖影响图；
[0027] 图3.不同浓度三叶青提取物TH-p对NK细胞增殖影响图；
[0028] 图4.不同浓度三叶青提取物TH-a对NK细胞增殖影响图；
[0029] 图5.不同浓度三叶青提取物TH-b对NK细胞增殖影响图；
[0030] 图6.不同浓度三叶青提取物TH-W对NK细胞增殖影响图；
[0031] 图7.不同浓度三叶青提取物TH-wl对NK细胞增殖影响图；
[0032] 图8.不同浓度三叶青提取物TH_w2对NK细胞增殖影响图；
[0033] 图9.不同浓度三叶青提取物TH-w3对NK细胞增殖影响图；
[0034] 图10.浓度0. 62 ii g/ml的三叶青提取物Th-t对NK细胞增殖影响图；
[0035] 图11.浓度0. 62 ii g/ml三叶青提取物Th-p对NK细胞增殖影响图；
[0036] 图12.浓度0. 166 ii g/ml三叶青提取物Th-W2对NK细胞增殖影响图；
[0037] 图13.浓度0. 62 ii g/ml三叶青提取物Th_W3对NK细胞增殖影响图；
[0038] 图14.三叶青总提取物诱导的NK细胞对三株肿瘤细胞杀伤活性图；
[0039] 图15.0. 15iig/ml三叶青总提取物（TH-t)诱导后的NK细胞颗粒酶、穿孔素和 CD107a的表达图。
【具体实施方式】
[0040] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0041] 实施例1 :三叶青药材提取分离实验
[0042] 提取液分组：根据提取时所选用的制剂将提取液分为9组，分别命名为：TH_t、 TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-wl、TH-w2、TH-w3 和 TH-w4;
[0043] 各组三叶青提取物的提取方法：参照文献[杨阳.甘西鼠尾草及头花寥化学成分 研究.第二军医大学硕士学位论文.上海：第二军医大学，2009]分离纯化得到，经高效液 相色谱（HPLC)检查。可参考图1关于三叶青提取技术路线图。
[0044] TH-t部分：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80 %乙醇水溶液浸泡24h后，加热 回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t 21. 6g， 得率10. 8%。TH-p部分：取此总提取，加水混悬，分别采用10倍体积的石油醚（水饱和） 进行分步萃取。分别得到石油醚部位TH-p 0. 15g，得率0.075%。
[0045] TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a 0? 58g，得率0? 29%
[0046] TH-b部分：正丁醇部位TH-b 2g，得率1 %
[0047] TH-w部分：以及水部位TH-w 18. 9g，得率9. 45 %
[0048] THil部分：取水部位进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分， 再使用10 %、30 %、60 %、95 %乙醇水溶液分别依次洗脱。其中，10 %乙醇水洗脱溶液减压回 收蒸干后得到水部位脱糖流分1^110.14§，得率0.07%
[0049] THi2部分：取水部位进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分， 再使用10 %、30 %、60 %、95 %乙醇水溶液分别依次洗脱。其中，30 %乙醇水洗脱溶液蒸干后 得到水部位脱糖流分THil 0. 3g，得率0. 15%
[0050] TH_w3部分：将上述经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获 得脱水物2. 1克。
[0051] TH-w4部分：将上述经有机溶剂提取后的三叶青药材用减压回收蒸干脱水，再使 用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分别依次脱糖，其中，获得了10%乙醇水部位脱糖流 分。
[0052] 可参考图1关于三叶青提取技术路线图。
[0053] 实施例2:不同浓度的三叶青提取物对NK细胞增殖的影响实验
[0054] NK细胞培养及鉴定：
[0055] 取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500U/ml rhIL-2的NK培养基调整细胞密度为3. 5 X 105/mL，接种于6孔细胞培养板中，每孔5ml，于 37°C、5% C02培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5X105/mL，收集培养7 天的NK细胞，加入PE标记的⑶3、FITC标记的⑶56进行细胞表面标志检测。
[0056] CCK8法检测不同三叶青提取物对人NK细胞生长的影响：
[0057] 取培养7天的NK细胞配成5 X 104/mL的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，200 ill/ 孔。实验组：共设11个浓度组，分别加入5 X104/mL的NK细胞，180 yl/孔。然后加入不 同浓度的三叶青提取物（终浓度分别为〇. 〇〇〇625、0. 0025、0. 01、0. 039、0. 155、0. 62、2. 44、 9. 76、39、156 y g/ml)每组设5个复孔，同时高末加药物空白对照组：于培养箱中培养24h、 48h、72h。培养结束前4个小时每孔加入CCK8 20 iil，继续培养4h后于酶标仪450nm处检 测各孔吸光值（0D)记录结果。增殖率（％ )=(实验0D值）一（对照0D值V(对照0D 值）X100%。
[0058] 各阶段三叶青提取物对NK细胞生长影响：
[0059] 各提取阶段三叶青提取物对NK细胞生长影响有较大差异，在药物浓度相同条件 下，以水煮脱糖部位（Th_w3)时促NK细胞生长活性最强；总提取物（Th-t)、石油醚部位 (Th-p)和水部位脱糖部位（Th-w2)次之，与对照组比较均有统计学差异（p < 0. 05)。其他 结果均有一定的促NK细胞增殖作用。提取物Th-